专利名称：一种微量多肽及蛋白质含量的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽及蛋白质含量的测定，特别是微量(低至几微克)多肽及蛋白质含量的测定方法。
背景技术：
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，即折射率、比重、紫外吸收等测定得知；另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，即定氮法，双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)、紫外吸收法和考马斯亮蓝法(Bradford法)。
其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。值得注意的是，除定氮法外，这后四种方法都将多肽或蛋白质分子作为一个反应单元参与化学反应，而多肽蛋白质分子的序列、结构、性质多种多样，即使同一种蛋白质溶液用这四种方法测定，也有可能得出四种不同的结果，所以，它们并不能在任何条件下都适用于任何形式的蛋白质。
这些方法中，定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质，它是将样品与浓硫酸共热，含氮有机物即分解产生氨(消化)，氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。由于每一种多肽及蛋白质都有其恒定的含氮量，通过总氮量的测定即可求得多肽和蛋白质的含量。但凯氏定氮法最低可检测出的多肽蛋白质也只有0.3mg，对于微克级的某些基因工程或其它来源的多肽及蛋白质，这个方法并不适用。

发明内容
本发明的目的在于提供一种微量多肽及蛋白质含量的测定方法，采用本发明所述的定氮法可以对仅有微量样品情况下的多肽和蛋白质进行精确的含量测定。
本发明的整体技术构思是多肽蛋白质样品经硫酸消化后，生成硫酸铵，硫酸铵被氢氧化钠分解放出氨，加入奈氏试剂，用分光光度计测定铵盐，并转换成氮含量。
该测定方法由如下步骤组成一种微量多肽及蛋白质含量的测定方法，其特征在于它由如下步骤组成A、检测试剂的制备a、称取0.2-0.5g硒酸钠，0.1-0.2g硫酸铜，加1.5-2.5N硫酸溶解成500ml作为消化剂；浓硫酸14-42ml，加入100-150ml水中，冷却后稀释为1.5-2.5N硫酸；氢氧化钠20-60g，加水溶解至500ml得到1-3N氢氧化钠；b、奈氏试剂的制备将20-30g碘化钾加水20-30ml溶解制成碘化钾溶液；二氯化汞8-14g加热溶于160ml水制成二氯化汞溶液；将60-80g氢氧化钾加水至350ml溶解制成氢氧化钾溶液；然后将上述二氯化汞溶液倒入碘化钾溶液中，直至生成的红色沉淀不再溶解为止；再将此混合液倒入氢氧化钾溶液中，混匀，加水至500ml，静止取上清；c、标准硫酸铵溶液的制备(含氮量0.02-0.06mg/ml)取硫酸铵干燥至恒重后，称取0.4720-1.4159g加水至100ml溶解、摇匀，得到含氮量1-3mg/ml标准溶液、冷藏；取上述标准溶液1ml，用水稀释至50ml摇匀；B、检测方法a、在含氮8～10μg的待测样品中加入消化液1ml，玻璃珠两粒，于通风橱内加热，使被加热液体保持微沸状态；消化至溶液呈淡绿色(3-5小时)后，加大火力继续消化至溶液澄清(1-2小时)；冷却后，加入10ml水稀释，再依次加入奈氏试剂0.5ml，2N氢氧化钠，摇匀，放置10-25分钟，于390-410nm与460-480nm波长比色；b、标准硫酸铵曲线量取标准硫酸铵溶液(含氮量为0.02-0.06mg/ml)5份于烧瓶中，每份为0.1-0.5ml，分别补水至0.5ml，加入消化液1ml，玻璃珠两粒，与待测样品同时消化，按B步骤中的a法操作；C、计算出总氮量，从而计算出蛋白含量。
本发明各步骤的具体工艺条件和工艺参数是所述的C步骤中总氮量的计算采用直线回归法。
奈氏试剂的制备中将60-80g氢氧化钾加水至350ml，缓缓溶解于棕色瓶中。
B步骤中，将加入消化液和玻璃珠后的待测样品或标准硫酸铵溶液置通风橱内的可调火力电炉上加热。
标准硫酸铵溶液的制备步骤中，干燥温度为100℃。
检测试剂制备的步骤a中，浓硫酸的密度为1.84kg/L。
本发明取得的技术进步在于本检测方法中检测试剂和仪器易购；该检测方法解决了现有方法不适用于微量样品中对多肽和蛋白质进行精确含量测定的问题，可以精确检测微克级的某些基因工程或其它来源的多肽及蛋白质。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明做进一步的描述A、检测试剂的制备a、称取0.3g硒酸钠，0.1g硫酸铜，加2N硫酸溶解成500ml作为消化剂。浓硫酸(密度1.84kg/L)28ml，加入150ml水中，冷却后以水稀释至500ml成为2N硫酸。氢氧化钠40g，加水溶解至500ml得到2N氢氧化钠。
b、奈氏试剂的制备将25g碘化钾加水26ml溶解，二氯化汞11.0g加热溶于160ml水，69g氢氧化钾，加水缓缓溶解于500ml刻度棕色瓶中，加水至350ml；然后将上述二氯化汞饱和溶液倒入碘化钾溶液中，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。再将此混合液倒入氢氧化钾溶液中，混匀，加水至500ml，静止一段时间，取上清应用。
c、标准硫酸铵溶液的制备(含氮量0.04mg/ml)取硫酸铵于100℃干燥至恒重，精密称重0.9439g，用水溶解，小心洗入100ml容量瓶中，并加水至刻度，摇匀，得到含氮量2mg/ml标准溶液，保存冰箱中备用。取标准硫酸铵贮备液1ml，置于50ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀即可。
B、检测方法a、取待测样品(含氨9μg)置于凯氏烧瓶或大试管中，加入消化液1ml，玻璃珠两粒，置通风橱内的可调火力电炉上加热，使管内液体保持微沸状态，消化至溶液呈淡绿色(3-5小时)，加大火力，继续消化至溶液澄清(1-2小时)，取下冷却后，加入10ml水稀释，再依次加入奈氏试剂0.5ml，2N氢氧化钠，摇匀，放置15分钟，于400nm与470nm波长比色。
b、标准硫酸铵曲线精密量取标准硫酸铵溶液(含氮量为0.04mg/ml)0.1、0.2、0.3、0.4和0.5ml于凯氏烧瓶中，补足水至0.5ml，加入消化液1ml，玻璃珠两粒，与待测样品同时消化，同法操作。
C、采用直线回归法求出总氮量，再计算出蛋白含量。
权利要求
1.一种微量多肽及蛋白质含量的测定方法，其特征在于它由如下步骤组成A、检测试剂的制备a、称取0.2-0.5g硒酸钠，0.1-0.2g硫酸铜，加1.5-2.5N硫酸溶解成500ml作为消化剂；浓硫酸14-42ml，加入100-150ml水中，冷却后稀释为1.5-2.5N硫酸；氢氧化钠20-60g，加水溶解至500ml得到1-3N氢氧化钠；b、奈氏试剂的制备将20-30g碘化钾加水20-30ml溶解制成碘化钾溶液；二氯化汞8-14g加热溶于160ml水制成二氯化汞溶液；将60-80g氢氧化钾加水至350ml溶解制成氢氧化钾溶液；然后将上述二氯化汞溶液倒入碘化钾溶液中，直至生成的红色沉淀不再溶解为止；再将此混合液倒入氢氧化钾溶液中，混匀，加水至500ml，静止取上清；c、标准硫酸铵溶液的制备(含氮量0.02-0.06mg/ml)取硫酸铵干燥至恒重后，称取0.4720-1.4159g加水至100ml溶解、摇匀，得到含氮量1-3mg/ml标准溶液、冷藏；取上述标准溶液1ml，用水稀释至50ml摇匀；B、检测方法a、在含氮8～10μg的待测样品中加入消化液1ml，玻璃珠两粒，于通风橱内加热，使被加热液体保持微沸状态；消化至溶液呈淡绿色(3-5小时)后，加大火力继续消化至溶液澄清(1-2小时)；冷却后，加入10ml水稀释，再依次加入奈氏试剂0.5ml，2N氢氧化钠，摇匀，放置10-25分钟，于390-410nm与460-480nm波长比色；b、标准硫酸铵曲线量取标准硫酸铵溶液(含氮量为0.02-0.06mg/ml)5份于烧瓶中，每份为0.1-0.5ml，分别补水至0.5ml，加入消化液1ml，玻璃珠两粒，与待测样品同时消化，按B步骤中的a法操作；C、计算出总氮量，从而计算出蛋白含量。
2.根据权利要求1所述的一种微量多肽及蛋白质含量的测定方法，其特征在于所述的C步骤中总氮量的计算采用直线回归法。
3.根据权利要求1所述的一种微量多肽及蛋白质含量的测定方法，其特征在于所述的奈氏试剂的制备中将60-80g氢氧化钾加水至350ml，缓缓溶解于棕色瓶中。
4.根据权利要求1所述的一种微量多肽及蛋白质含量的测定方法，其特征在于所述的B步骤中，将加入消化液和玻璃珠后的待测样品或标准硫酸铵溶液置通风橱内的可调火力电炉上加热。
5.根据权利要求1所述的一种微量多肽及蛋白质含量的测定方法，其特征在于所述的标准硫酸铵溶液的制备步骤中，干燥温度为100℃。
6.根据权利要求1所述的一种微量多肽及蛋白质含量的测定方法，其特征在于所述的检测试剂制备的步骤a中，浓硫酸的密度为1.84kg/L。
全文摘要
本发明涉及一种多肽及蛋白质含量的测定，特别是微量(低至几微克)多肽及蛋白质含量的测定方法。本发明的工作原理是多肽蛋白质样品经硫酸消化后，生成硫酸铵，硫酸铵被氢氧化钠分解放出氨，加入奈氏试剂，用分光光度计测定铵盐，并转换成氮含量。本发明由检测试剂的制备、检测方法、蛋白含量计算等步骤组成。它克服了现有技术存在的不适用于微量样品中对多肽和蛋白质进行精确含量测定的问题，具有检测试剂和仪器易购、可精确检测微克级的某些基因工程或其它来源的多肽及蛋白质等优点。
文档编号G01N21/33GK1687745SQ20051001242
公开日2005年10月26日 申请日期2005年3月25日 优先权日2005年3月25日
发明者周兆平, 林枫, 邱岗峰, 周国卫, 于志江, 王玉树, 欧阳藩 申请人:深圳国家生化工程技术开发中心