专利名称：附红细胞体病快速鉴别诊断方法
技术领域：
本发明涉及一种人畜共患疾病—附红细胞体病快速鉴别诊断方法，可用于动物和人的附红细胞体病的诊断，属于动物医学和医学诊断的技术领域。
背景技术：
附红细胞体病是由专性血液寄生生物—附红细胞体寄生于人和动物红细胞表面、血浆及骨髓引起的，以贫血、黄疸、发热为基本征候的一种重要的人畜共患传染病。由于该病分布范围广、多呈隐性感染、感染宿主多，给人的健康和畜牧业的发展造成巨大的危害。
附红细胞体病已成为国内外广泛关注的全球性新型人畜共患病，但由于附红细胞体是条件致病菌，隐性感染率高、产生抗体的能力不确实等本身特点，较大地限制了该病血清学检测方法的应用。目前常规的检测方法是用血液压片，显微镜直接观察，其方法虽然简单，但受制于很多因素，观察结果带有一定的主观性，容易出现假阳性。以至于许多学者对国内附红细胞体如此高的发病率提出质疑(张家铮，2003河南畜牧兽医2003第24卷第1期)。
近年来发展起来的分子生物学检测方法如PCR(聚合酶链式反应)、核酸杂交等已开始应用到该病的检测诊断中。但特异敏感的检测诊断方法急需完善，包括IHA试验(间接血凝试验)、补体结合试验和ELISA(酶联免疫吸附)。因抗体的产生与病原数量的增多(而不是与感染发生的时间)只有暂时的相关性(孙荣华，2004中国兽医寄生虫病第12卷第1期)，意味着抗体的产生呈波浪形。即使数次急性发作后，抗体滴度也只能在一定时间内维持较高水平，之后便会下降到阈值以下，表明假阴性是常见的。吴文德(2002广西畜牧兽医18卷2期)介绍了PCR技术检测附红细胞体的情况，根据16SrRNA基因设计引物，Berent等1998年用于猫附红体检测，Brinson等2001年用于狗附红体检查，特异性和敏感性高，可用于流行病学调查和临床检查。王君玮(2003中国动物检疫第20卷第7期)介绍了Gwaltney等1993年报道的检测猪附红细胞体的PCR方法，该法按照E.wenyonii附红体16SrRNA设计引物(5`-A G A G T T T G A T CT T G G C T C A G-3`；5`-C G G T T A C C T T G T T A C G A C TT-3`)对末梢血进行PCR扩增可以检查E.Wenyonii感染及E.suis感染的家畜。此法能否用于人的附红体感染或发病的诊断尚需进行试验。这些方法都存在检测时间长和成本高等问题。因此，目前国内外尚无一种快速、简便、准确、可靠的检测附红细胞体的方法。

发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种附红细胞体病快速鉴别诊断方法，能快速、简便、准确、可靠的检测附红细胞体，以满足畜牧业生产和医学临床诊断的需求。
为实现这样的目的，本发明采用快速鲜血镜检三步法进行检测。首先采取被测对象的末梢血液滴于载玻片上，再滴加生理盐水稀释后进行镜检，观察是否能找到附红细胞体，然后在发现红细胞体的血滴中加滴盐酸或醋酸，观察在红细胞破裂后是否存在运动速度加快，运动范围增大的附红细胞体，进行进一步的判别；在上述确定有附红细胞体的血滴中，再滴加一滴碘溶液，观察附红细胞体运动是否停止并不再恢复活动力，也不被碘着色，即可完全确定附红细胞体是否存在，完成附红细胞体病的鉴别诊断。
本发明方法的具体步骤如下第一步，鲜血悬滴镜检采取可疑病畜或病人被测对象的末梢血液，滴一滴鲜血于载玻片上，再按1∶1～1.5比例滴加生理盐水稀释，以降低血浆粘度，避免红细胞重叠，有利于观察附红细胞体活动。镜检时先在显微镜下找到红细胞，先在显微镜下找到红细胞，然后调节微调旋钮，观察是否有附红细胞体附着在红细胞表面，血浆中是否有游离的附红细胞体，进行初步判别。
如有附红细胞体感染，调节微调旋钮，即能清楚地看到附着在红细胞表面地附红细胞体，同时也能在显微镜下观察到游离于血浆中的附红细胞体。
第二步，酸性溶液活力测定附红细胞体具有运动性，这有别于其他病原体。在第一步鲜血悬滴镜检的基础上，在发现附红细胞体的血滴中加一滴0.5～1％盐酸或1～5％醋酸(也可用其它酸性溶液或重蒸水)，显微镜下可观察到红细胞破裂溶血，此时，附红细胞体并不因红细胞的破裂而运动活力受到影响，相反表现出活动更活泼，运动速度加快，运动范围增大的特点，作摆动、扭转、翻滚、上升、下降等运动。由此可将附红细胞体与其它病原体区别开来，完成进一步的判别。
第三步，碘制动测定在第二步活力测定镜检时，当显微镜下观察到附红细胞体作摆动、扭转、翻滚、上升、下降等运动后，在上述血滴中滴加一滴0.05～0.1％碘溶液后，可观察到附红细胞体运动即停止。此时，即使用PBS(磷酸盐缓冲液)或生理盐水洗涤，附红细胞体活动力也不恢复，也不被碘着色。附红细胞体这一固有特性是别于其它血液寄生病原微生物，具有重要的鉴别诊断意义。由此即可完全确定附红细胞体的存在，完成附红细胞体病的鉴别诊断。
本发明根据附红细胞体所具有的特性，采用鲜血镜检三步法进行快速检测，第一可初步判断血液是否存在附红细胞体；第二步可将附红细胞体同其它血液寄生微生物区别；第三步后即可完全确定附红细胞体是否存在，完成附红细胞体病的鉴别诊断。本发明方法操作简单、灵敏、准确、快速，三个步骤仅需一小时就能完成，而传统血清学和分子生物学方法均需一天以上方能完成。
具体实施例方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下实施例的作用应被理解为是对发明的注释，而并非对本发明的任何方式的限制。
实施例1在兽医门诊收治的20例可疑附红细胞体病患犬中，分别于犬前臂静脉采血，滴一滴于载玻片上，加1∶1生理盐水稀释后。显微镜镜下可见附红细胞体多为环形、球形、短杆状、哑铃形或星状闪光小体附着于红细胞表面，或游离于血浆中。轻度感染者每个红细胞表面附着1-5个附红细胞体，中度感染者为6-8个，重度感染者可达20个以上。在滴加等量的0.9％盐酸溶液后，可见附红细胞体在显微镜下作摆动、扭转、翻滚、上升、下降等运动。再滴加等量0.1％碘溶液后，附红细胞体立即停止活动，用PBS或生理盐水洗涤后，附红细胞体活动力也不恢复，也不被碘着色。最后确诊为附红细胞体病病犬18只。用IHA试验、补体结合试验和ELISA方法检测对照，结果完全一致。
实施例2在犬附红细胞体病流行期间，分别从7位同患犬有长期接触的兽医门诊医生和护理人员指尖无菌采血，滴一滴于载玻片上，加1∶1.2生理盐水稀释。显微镜下可见附红细胞体多为环形、球形、短杆状、哑铃形或星状闪光小体附着于红细胞表面，或游离于血浆中。轻度感染者每个红细胞表面附着1-5个附红细胞体，中度感染者为6个以上。在滴加等量的1％盐酸溶液后，可见附红细胞体在光镜下作摆动、扭转、翻滚、上升、下降等运动。再滴加等量0.1％碘溶液后，附红细胞体立即停止活动，用PBS或生理盐水洗涤后，附红细胞体活动力也不恢复，也不被碘着色。最后确诊附红细胞体感染者3人。用IHA试验、补体结合试验和ELISA方法检测对照，结果完全一致。
权利要求
1.一种附红细胞体病快速鉴别诊断方法，其特征在于包括以下步骤1)采取被测对象的末梢血液，滴一滴于载玻片上，再按1∶1～1.5的比例滴加生理盐水稀释血液后进行镜检，先在显微镜下找到红细胞，然后调节微调旋钮，观察是否有附红细胞体附着在红细胞表面，血浆中是否有游离的附红细胞体，进行初步判别；2)在上述发现红细胞体的血滴中加一滴0.5～1％盐酸或1～5％醋酸，在显微镜下观察到红细胞破裂溶血，根据附红细胞体不因红细胞的破裂而运动活力受到影响，相反表现出运动速度加快，运动范围增大的特点，将附红细胞体与其它病原体区别开来，完成进一步的判别；3)在上述确定有附红细胞体的血滴中，滴加一滴0.05～0.1％碘溶液，观察附红细胞体运动是否停止，若停止，再用磷酸盐缓冲液或生理盐水洗涤，若附红细胞体活动力不恢复，也不被碘着色，即可确定附红细胞体的存在，完成附红细胞体病的鉴别诊断。
全文摘要
本发明涉及一种附红细胞体病快速鉴别诊断方法，采用快速鲜血镜检三步法进行检测。首先采取被测对象的末梢血液滴于载玻片上，再滴加生理盐水稀释后进行镜检，观察是否能找到附红细胞体，然后在发现红细胞体的血滴中加滴盐酸或醋酸，观察在红细胞破裂后是否存在运动速度加快，运动范围增大的附红细胞体，进行进一步的判别；在上述确定有附红细胞体的血滴中，再滴加一滴碘溶液，观察附红细胞体运动是否停止并不再恢复活动力，也不被碘着色，即可完全确定附红细胞体是否存在，完成附红细胞体病的鉴别诊断。本发明根据附红细胞体所具有的特性，能快速、准确的进行动物和人的附红细胞体病的鉴别诊断。
文档编号G01N33/49GK1696691SQ20051002621
公开日2005年11月16日 申请日期2005年5月26日 优先权日2005年5月26日
发明者华修国, 崔立, 朱建国 申请人:上海交通大学