专利名称：检测睾酮用的酶免疫分析测试盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是用酶免疫分析方法检测睾酮含量用的测试盒。更具体讲是一种采用第二抗体包被的方式检测睾酮用的酶免疫分析测试盒。
睾酮是广泛存在于人和动物体内的一种类固醇类激素，准确检测其在生物体内的含量，在判定其生殖性能、正常生理指数及病理浓度而用于疾病的诊治、计划生育、动物的繁殖与育种等方面都有重要的作用；在监测食品，特别是动物食品中这种激素的含量，保障食品卫生与人类健康方面也有重要的意义和作用。目前对睾酮激素检测所采用的，仍多是自60年代发展起来的放射免疫分析法。由于其必须使用放射性标记物，检测设备复杂，必需用专门的放射性探测器对检测结果进行测定。同时，对操作人员也存在有放射性污染与伤害，需要特殊的防护和去污设备。此外，因所使用放射性标记物的放射性核素时刻都在发生衰变，特别是如常用的碘-125，碘-131和磷-32等半衰期短的核素，其保存时期不长，也给使用带来了不便。因此，用酶免疫法取代放射性免疫法进行检测是发展方向。目前对类固醇激素检测所建立和使用的酶免疫分析方法，多是首先用抗该激素的抗体，即所谓的第一抗体对所用酶免疫滴定板的板孔进行包被，然后向板孔中加入酶标激素、标准激素或待测样品等进行免疫反应。由于经若干小时的包被和清洗后，实际被吸附和固定在各孔孔壁的该第一抗体的分子数量常存在有较明显的差异，实测其变异系数约为5％～20％会直接影响测定的精密度(即重现性)。此外，其测定本底的吸光率数值常较高，约为0.10～0.20，对测定的准确度或可信度也有影响。因此，B.S.Prakash与H.H.Meyer等人在J.Steroid Biochem.VoL.28,No.6,623-7,1987等文献中已有采用第二抗体包板进行的酶免疫检测方法的报导。
本发明的目的是针对上述情况，提供一种采用以第二抗体包板的方式检测睾酮用的酶免疫分析测试盒，使其具有更高的精密度、灵敏度和稳定性，以及能有更好的特异性和准确性等优点。
本发明检测睾酮用的酶免疫分析测试盒，由免疫反应滴定孔板和检测试剂两部分组成。其中的免疫反应滴定板可采用每板48孔或96孔等酶免疫分析测试中所通用的PVC等各种形式的滴定板。检测试剂包括作为第二抗体的羊抗兔免疫球蛋白G、作为第一抗体的抗睾酮抗体、酶标睾酮、标准睾酮、显色用的底物液、终止液及分析缓冲液等试剂。检测试剂的具体组成为a)羊抗兔免疫球蛋白G冻干品，使用前可用磷酸盐缓冲液溶解(可于4℃至-20℃温度条件下保存)，b)抗睾酮抗体冻干品，使用前可用磷酸盐缓冲液溶解(可于4℃至-20℃温度条件下保存)，c)酶标睾酮用辣根过氧化物酶标记的睾酮-羧甲基肟的冻干品，使用前可用磷酸盐缓冲液溶解(可于4℃至-20℃温度条件下保存)，d)标准睾酮，e)底物液由显色剂与含量为0.004％的过氧化氢溶液共同组成，f)终止液浓度为4M的硫酸，g)分析缓冲液由40mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠与0.14M氯化钠和0.1％牛血清白蛋白(BSA)组成，pH7.2.
上述的磷酸盐缓冲液由40mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠和0.14M的氯化钠组成，pH7.2。
检测试剂中作为第二抗体的羊抗兔免疫球蛋白G可以为山羊抗兔免疫球蛋白G，或是绵羊抗兔免疫球蛋白G，可用目前的常规方法自行制备，如将正常家兔血浆中制取的IgG以多次免疫注射入成年的山羊或绵羊体内，4个月后收集山羊或绵羊的血清，用常用免疫吸附剂(如兔IgG-琼脂醣凝胶-CL-6B等)纯化制得，冻干保存于-20℃备用，使用前可用磷酸盐缓冲液溶解。此外，也可选用市购的该免疫球蛋白G成品。提高所用的该羊抗兔免疫球蛋白G第二抗体的纯度，有利于保证和提高测试的效果。
检测试剂中所用的抗睾酮抗体可以采用常规方法自行制备，如，用蛋白缩合剂碳化二亚胺将牛血清白蛋白(BSA)与睾酮-3-羧甲基肟连接制成抗原，对家兔进行免疫，经7个月后即可获得特异性强的抗血清，冻于低温保存，使用前可用磷酸盐缓冲液溶解。此外，也可以采用市购的成品。提高所用抗睾酮抗体的滴度可以提高检测的特异性与准确性。试验表明，检测试剂中所用的抗睾酮抗体使用时的工作浓度以在1∶54000以上为宜。
检测试剂中所说的酶标睾酮，可以采用常规用辣根过氧化物酶对睾酮-3-羧甲基肟进行标记的方式。例如，可以采用常规的DEAE-琼脂醣凝胶纯化8毫克辣根过氧化物酶，取收集液中峰值部分，加入300微升二甲替甲酰胺；另将3毫克睾酮-3-羧甲基肟溶于300微升二甲替甲酰胺中，加入3微升甲基吗啉，冷却至-15℃，再加入3微升氯甲酸异丁酯，与酶液混合，在-15℃搅拌1小时，0℃2～3小时，然后在蒸馏水中透析15小时以上，用葡聚糖凝胶G-25层析纯化，冻干保存于低温，使用前可用磷酸盐缓冲液溶解。
检测试剂中底物液中所说的显色剂，可以为酶免疫分析中常用的各种显色剂。经实验表明，其中以采用在0.05M磷酸盐-柠檬酸组成的pH5.0的缓冲液中含量为0.01％(重量％)的四甲基联苯胺的效果为佳。
由于本发明检测药盒使用时采用的是以第二抗体对免疫反应滴定孔板进行包被，因此，所说的免疫反应滴定孔板既可以在临用时才用该第二抗体进行包被，也可以由生产者预先对该滴定孔板用所说的该第二抗体进行了包被处理后再与试剂组成药盒提供给用户使用。
本发明检测药盒的使用操作程序建议可按下述方式进行1)将用适当磷酸盐缓冲液溶解的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)与浓度为50mM碳酸氢钠，pH9.6的常规包被缓冲液混匀，按约1～1.2微克IgG/孔的量注入滴定板的各孔，0℃-4℃孵育过夜；弃去孔内液体，按250微升/孔加入分析缓冲液，室温孵育40～50分钟后，弃去孔内液体，保存于0℃或-20℃，即为已用第二抗体包被的滴定板，保存备用。
2)将上述已包被了第二抗体的滴定板可按300微升/孔的量用0.05％吐温(Tween)-80洗液洗板孔两次。
3)制作标准曲线时，将以所说的分析缓冲液按所需梯度稀释的睾酮标准液50微升，酶标睾酮50微升和抗睾酮抗体50微升先后加入各板孔，在0℃-4℃条件下孵育2～3小时或过夜。
检测时，以同样用分析缓冲液稀释的待测样品溶液50微升替换上述制作标准曲线时所用的睾酮标准液，其余操作方法和要求均与制作标准曲线的相同。
4)弃去孔内液体，用上述洗液洗孔4次，可按常规方式以150微升/孔的量加入底物液(临用前将0.004％的过氧化氢液加入显色剂)，室温下闭光放置30～40分钟。
5)按常规方式向每孔加入终止液50微升，用酶免疫测定仪在450nm处测定各孔的吸光率，计算测定结果。
以本发明上述检测药盒按上述程序进行测定所用的时同较短，一批测定一般在3～4小时内即可完成。
如前述，由于在目前用第一抗体包板的酶免疫分析法中，固定在各板孔壁的抗体分子数量差异的变异系数可达5％-20％，是影响测量精密度的一个重要因素。而在本发明的检测药盒中采用的是以1～1.2微克/孔过量的羊抗兔IgG第二抗体包板，其结合位点大大超过第一抗体上的结合位点。即使各孔中被吸附、固定的第二抗体分子有一定的差异，也影响不大。在以后向各孔加入第一抗体抗睾酮抗体时，经过一定的孵育时间，一般都能与已被固定于孔壁上的第二抗体发生反应而被结合、固定在孔壁上。因此只要操作时向各孔中加入的第一抗体溶液的体积相同，在孔壁上被固定的第一抗体的分子数量就基本相同，各孔间的差异大大减小，实测表明其变异系数一般均＜3％，从而能显著提高测定的精密度。与此同时，对睾酮抗体的用量也只需以第一抗体包板方法用量的4％～25％，大大节约了这一珍贵的试剂。
经大量实验证明，本发明上述检测药盒在用于睾酮含量测定时的方法学鉴定数据可以达到如下的指标和水平灵敏度-最小可测量1pg/孔；标准曲线范围可为0～40pg/孔，并可根据需要进行调整。比目前直接以第一抗体包板的酶免疫分析法一般在5-40pg/孔范围的最小可测量值的测量灵敏度高5～40倍；比最小可测量值为10-50pg/孔的放射免疫分析法高出10～50倍。
特异性——与不同类固醇激素的交叉反应率为睾酮100％，雄酮0.1％，孕酮、孕烯醇酮、雌酮、雌二醇、雌三醇及皮质酮均＜0.1％。
精密度——测定的批内变异系数为6.8％(n=8)，批间变异系数为9.5(n=8)，均符合公认的免疫测定标准，表明本发明药盒在检测试验中可具有很好的重复性。
准确性——向血清中添加标准睾酮后的回收率为98％～110％。
此外，由于本发明药盒中采用了过量的第二抗体包板，并又有分析缓冲液中的牛血清白蛋白(BSA)液的封闭，使其本底测定数值可均在0.08以下的水平，明显优于目前以第一抗体包板的酶免疫分析法0.10～0.20的测定本底。
试验表明，实际应用本发明测试盒对人或各种动物的血、尿、粪等样品中的睾酮激素进行测定时，只需取极少量(0.1～10微升)的样品即可进行，对被检测的人或动物体的健康毫无损害。因此，在提高疾病诊断、开展计划生育、动物繁殖与育种等方面的质量与水平，以及保障食品卫生与人类健康上都有着积极的意义。
权利要求
1．检测睾酮用的酶免疫分析测试盒，由免疫反应滴定孔板和包括抗睾酮抗体、酶标睾酮、标准睾酮、显色用的底物液、终止液及分析缓冲液在内的检测试剂共同构成，其特征在于检测试剂中还有由羊抗兔免疫球蛋白G构成的第二抗体，检测试剂的具体组成为a)羊抗兔免疫球蛋白G冻干品，使用前可用磷酸盐缓冲液溶解，b)抗睾酮抗体冻干品，使用前可用磷酸盐缓冲液溶解，c)酶标睾酮用辣根过氧化物酶标记的睾酮-羧甲基肟的冻干品，使用前可用磷酸盐缓冲液溶解，d)标准睾酮，e)底物液由显色剂与含量为0.004％的过氧化氢溶液共同组成，f)终止液浓度为4M的硫酸，g)分析缓冲液由40mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠与0.14M氯化钠和0.1％牛血清白蛋白组成，pH7.2，上述的磷酸盐缓冲液由40mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠和0.14M的氯化钠组成，pH7.2。
2．如权利要求1所述的酶免疫分析测试盒，其特征在于所说的羊抗兔免疫球蛋白G为山羊抗兔免疫球蛋白G。
3．如权利要求1所述的酶免疫分析测试盒，其特征在于所说的羊抗兔免疫球蛋白G为绵羊抗兔免疫球蛋白G。
4．如权利要求1至4之一所述的酶免疫分析测试盒，其特征在于所说的检测试剂中所用的抗睾酮抗体使用时的工作浓度在1∶54000以上。
5．如权利要求1至4之一所述的酶免疫分析测试盒，其特征在于所说的底物液中的显色剂为在由0.05M磷酸盐-柠檬酸组成的pH5.0的缓冲液中含量为0.01％(重量％)的四甲基联苯胺。
6．如权利要求1至4之一所述的酶免疫分析测试盒，其特征在于所说的免疫反应滴定孔板的板孔中预先用所说的羊抗兔免疫球蛋白G第二抗体包被。
全文摘要
本发明涉及检测睾酮用的酶免疫分析测试盒，由免疫反应滴定孔板和由羊抗兔免疫球蛋白G构成的第二抗体、抗睾酮抗体、酶标睾酮、标准睾酮、显色用的底物液、终止液和分析缓冲液组成的检测试剂共同构成。
文档编号G01N33/64GK1227350SQ98121838
公开日1999年9月1日 申请日期1998年11月10日 优先权日1998年11月10日
发明者郭大智 申请人:郭大智