专利名称：鹅副粘病毒病胶体金快速诊断试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鹅副粘病毒病胶体金快速诊断试纸条，属于一种新的动物诊断试剂， 主要用来诊断鹅副粘病毒感染的动物；应用于畜牧兽医学领域。
背景技术：
鹅副粘病毒病是1997年我国新发现的一种在鹅群中具有高度传染性的病毒性传染 病。鹅副粘病毒(Goose paramyxovirus)为血清I型禽副粘病毒，属于副粘病毒科，副粘病 毒亚科，腮腺炎病毒属(Paramyxovirus)，有囊膜，完整的病毒粒子近圆形，有时因囊膜破损 而形态不规则。囊膜上的纤突长约8nm，在囊膜外呈放射性排列，具有能刺激宿主产生抑制 红细胞凝集素和病毒中和抗体的抗原成份。病毒的核酸类型为单股RNA。根据B. Lomniczi 等建立的基因分型方法，鹅源副粘病毒在基因分型上归属于基因ΥΠ型禽副粘病毒。鹅源副 粘病毒病是现代化集约化养鹅业的主要疫病之一。在我国鹅源副粘病毒病发生和流行十分 严重，每年的经济损失很大。该病在临床症状、病理变化方面与小鹅瘟有某些相似之处，发 病率和死亡率较高，使养鹅业蒙受了较大的损失。目前鹅副粘病毒病检测主要采用的技术方法有HA、HI、ELISA、琼脂扩散试验、免 疫荧光技术、RT-PCR、荧光RT-PCR以及病毒的分离鉴定等。比较快速准确的技术是ELISA 和荧光RT-PCR，但这2种技术都需要特殊的仪器设备，并且检测时间都在2小时以上，检测 成本昂贵，不便于适时和快速诊断。这些限制了鹅源副粘病毒病的预防控制，因此研制出一 种特异性强、灵敏度高、简单易行的诊断方法迫在眉睫。免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是以胶体金作为示踪 标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuC14)在还原剂 如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用 成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的 正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶 体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根 据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫 和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。

发明内容
本发明的目的在于提供一种鹅副粘病毒病胶体金快速诊断试纸条，其利用免疫学抗原 抗体能特异性结合原理，胶体金标记单抗后与抗原结合，这种抗原抗体结合物再与另一株 抗鹅副粘病毒单抗结合，形成夹心抗原抗体结合物在硝酸纤维素膜(NC膜)上出现颜色反 应，可以肉眼观察；具有简单、快速、敏感和特异性好等特点。并且价格低廉，适用于基层或 临床检测鹅副粘病毒病。本发明的技术方案是这样实现的一种鹅副粘病毒病胶体金快速诊断试纸条，其 特征在于试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附在不吸水的支撑薄片 上；其中结合垫上包被有胶体金标记的抗鹅副粘病毒单克隆抗体2B8 ；硝酸纤维素膜上分 别包被有抗鹅副粘病毒单克隆抗体3E9构成的检测线T线和兔抗Balb/c小鼠免疫球蛋白抗体IgG构成的质控线C线。
所述的结合垫上包被的胶体金标记的抗鹅副粘病毒单克隆抗体2B8的制备方法 如下首先制备抗鹅副粘病毒单克隆抗体，利用杂交瘤技术通过细胞融合、细胞克隆筛选建 立的抗鹅副粘病毒单克隆抗体3株，所制备单抗只针对鹅副粘病毒，且为鹅副粘病毒上的 不同抗原表位，这就决定了试纸条的特异性；
(A)选用其中一株单抗标记胶体金，制备金标抗体，用0. IM碳酸钾调胶体金的PH值至 8. 2，按IOOug抗体/毫升胶体金加入抗鹅副粘病毒单克隆抗体2B8，磁力搅拌器混勻30分 钟，加BSA至终浓度为1%，静置1小时。4°C 13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗 涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的洗涤保存液重悬沉淀，4°C备用。(B)将结合垫浸泡于封闭液即2% BSA、0. 5%吐温-20、2. 5%蔗糖、0. 05%叠氮钠、 0. OlM PBS中30分钟，37°C烘干；然后将制备好的金标抗体均勻喷涂于结合垫上，每毫升铺 20平方厘米，冻干、保存。所述的硝酸纤维素膜上包被有抗鹅副粘病毒单克隆抗体3E9构成的检测线T 线是选用另外一种单抗3E9作为捕获抗体喷涂于检测线上，用包被缓冲液将抗鹅副粘病毒 单克隆抗体3E9稀释到50-100ug/ml，调整机器划线为T线，即为检测线靠近结合垫，距结合 垫端约5mmο所述的兔抗Balb/c小鼠免疫球蛋白抗体IgG构成的质控线C线是以Balb/c小鼠 免疫球蛋白作为抗原，免疫家兔，提取免疫兔血清中的抗体球蛋白制成，用包被缓冲液将兔 抗Balb/c小鼠抗体稀释到50-100ug/ml，调整机器划线为C线，即为对照线靠近吸收垫，距 吸收垫端约3mm ；两线距离5-8mm，在硝酸纤维素膜NC膜上的质控线上，可与金标抗体结合， 以此检验试纸条的有效性。所述该纸条的检测方法是样品中鹅副粘病毒先和胶体金标记的鼠抗鹅副粘 病毒单克隆抗体2B8结合，由于毛细管作用，反应复合物沿包被膜向前泳动，若样品中有鹅 副粘病毒，到达检测线时遇到包被在硝酸纤维素膜上的鼠抗鹅副粘病毒单克隆抗体3E9，就 会形成金标单抗_鹅副粘病毒_单抗复合物，从而凝集在检测线上，形成特异性的红色沉淀 线；没有和鹅副粘病毒结合金标单克隆抗体则会直接通过检测线，富集在质控线上形成红 色沉淀线，即判为阳性结果。若样品中无鹅副粘病毒，反应复合物到达检测线时遇到捕获抗 体就不会形成捕获单抗_鹅副粘病毒_金标单抗复合物，反应复合物通过检测线，富集在质 控线上，形成红色沉淀，即判为阴性结果。本发明的优点是1、具有生物安全性，其所使用的金标单抗、捕获单抗及兔抗 Balb/c小鼠免疫球蛋白抗体均为抗体，不含鹅副粘病毒，因此不存在散毒的危险。2、特异性强，胶体金试纸条金标抗体与检测线上的捕获抗体均为敏感性和特异 性较好的单克隆抗体，因此提高了检测的敏感性和特异性。3、生产成本低，金标单抗、捕获单抗均可由相应的杂交瘤细胞系通过注射Balb/c 小鼠腹腔，诱生腹水，通过辛酸_硫酸铵纯化而大量获得。4、其可快速检测即10-15分钟；不需特殊仪器设备，可用于现场操作；操作简单， 一步完成，无需专业人员操作；检测成本低；储存方便。


图1本发明所涉及的两株单抗的杂交瘤细胞株图2本发明试纸条的结构模式图 图3本发明试纸条结果判定示意图
具体实施例方式
下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均 为常规方法。实施例1兔抗鼠IgG抗体的制备 l>Balb/c小鼠IgG的提取
取IOml健康Balb/c小鼠血清与等量0. 8%氯化钠溶液混合后，逐滴加入饱和硫酸 铵溶液20ml，使成50%饱和度的硫酸铵溶液。4°C静止30分钟取出，4°C 3000rpm离心30 分钟，弃上清，沉淀中加入20ml 0. 8%氯化钠溶液；待沉淀溶解后，缓慢加入IOml饱和硫酸 铵溶液，使成33%饱和度的硫酸铵溶液。4°C静止30分钟取出，40C 3000rpm离心30分钟， 弃上清，沉淀中加入Iml 0.8%氯化钠溶液，装入透析袋内用0.8%氯化钠溶液透析除盐。用 2%氯化钡溶液检测硫酸铵是否透析完全。透析完全后，蛋白溶液用PEG20000浓缩至适当体 积，4°C 12000rpm离心10分钟，取上清，测定蛋白质含量，即为粗提的Balb/c小鼠IgG。2、Balb/c 小鼠 IgG 的纯化
称取3g Sephadex G-200加入数倍体积的蒸馏水混勻，室温浸泡3天，每天换蒸馏 水2次，轻轻弃上层漂浮颗粒，4°C备用。将S印hadex G-200装柱后用0. IM PBS平衡过夜。 样品上柱后，不时用20%磺基水杨酸检测洗出液，当洗出液出现轻微乳浊反应时，接受样品 直至不浑浊为止。PEG20000浓缩至适当体积，4°C 12000rpm离心10分钟，取上清，测定蛋 白质含量，即为纯化的Balb/c小鼠IgG，-20°C冻存备用。3、家兔的免疫及兔抗鼠IgG的提取与纯化
选2. 5K g左右的成年雄性健康家兔，用上述制备的抗原，首次免疫用弗氏完全佐剂 乳化的Balb/c小鼠IgG，2mg IgG/只家兔，以后每次用弗氏不完全佐剂乳化的Balb/c小鼠 IgG。免疫3次后，琼脂凝胶免疫扩散试验检测血清效价，当效价达1 32时，加强免疫一次， 10天后颈动脉采血，分离血清，提取IgG，方法同前。利用该抗体可作为本发明胶体金试纸 条的质控线(C线)。实施例2鹅副粘病毒的制备及纯化
将鹅副粘病毒(GPMV)NA-I株10倍稀释后接种于11 d的SPF鸡胚中，收集36 72h 死亡的鸡胚尿囊液，做血凝试验测效价为27，4 OOOg 4 °C离心15 min、8 OOOg 4°C离心15 min去杂蛋白，取上清25 OOOg 4°C离心3h，沉淀用适量STE悬浮。将粗提病毒以20% 50%的蔗糖线性梯度离心，25 OOOg 4°C离心3h，在3(Γ40%处可见一条淡白色的带，收集沉 淀病毒带，用STE稀释5倍，30 OOOg 4°C离心lh，去上清沉淀加入Iml STE悬浮，血凝试 验测效价为29，用紫外分光光度法测定蛋白浓度为，2. 135mg/ml, - 70°C冻存备用。
实施例3抗鹅副粘病毒单克隆抗体的制备
1、动物免疫选择6-8周龄健康BALB/ C小鼠以弗氏完全佐剂乳化纯化的病毒，每只 小鼠腹腔注射50 μ g左右，14d后以弗氏不完全佐剂乳化病毒腹腔注射100 μ g,最后一次 加强免疫时，直接腹腔注射100 μ g纯化的病毒，融合前3 4d尾静脉注射50 μ g纯化的病毒。
2、细胞融合取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0混合于融合管内，以300g离心10 min,弃去上清，振荡细胞，使两种细胞尽量混合均勻，然后45s内缓慢滴加预热的PEG 溶液，再缓慢加入无血清的1640培养基终止融合，静置后再以1 000 r/min离心10 min ，弃去上清后加入HAT培养基，使细胞悬浮并混勻，加入适量饲养细胞，于96孔培养板 培养，第IOd换液并开始检测筛选。3、阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆化 阳性克隆的筛选采用间接ELISA和HI试 验。间接ELISA中，用纯化的GPMV NA-I株抗原包被，并以骨髓瘤细胞上清作为阴性对 照进行平行筛选。对所获阳性杂交瘤细胞的培养上清再HI试验筛选，HI试验按常规方法 进行；将ELISA和HI试验筛选的阳性杂交瘤细胞进行克隆，将检出的阳性孔再次克隆和 亚克隆，直到所有的孔都为阳性，最后选择OD值高、细胞活力好、只有一株细胞的孔扩大 培养，再建株、冻存。通过三次细胞克隆最终获得1G7、2B8和3E9三株杂交瘤细胞株。4、腹水的制备0.5 mL的高压灭菌的石蜡油注射到小鼠腹腔，7d后注入IO6个杂 交瘤细胞于小鼠腹腔，7 10 d后，当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，将收集好的腹水置 370C 24h，随后置4°C过夜，第二天将腹水离心，上清56°C灭活30 min即可。5、单克隆抗体的纯化用4倍体积醋酸缓冲液稀释腹水，调至pH4. 5，缓慢滴 加3. 3 %的正辛酸，搅拌30 min，离心取上清，加入1/10体积的10倍PBS，调至pH7. 4 ，4°C预冷后，用45 %饱和硫酸铵沉淀，离心后取沉淀，用PBS稀释后移入透析袋，在50 倍体积PBS中透析，透析期间多次换液，透析结束后，紫外分光光度计280 nm测定蛋白 浓度并分装冻存。6抗鹅副粘病毒单克隆抗体的特性鉴定
(1)腹水效价测定间接ELISA方法测定，细胞培养上清与腹水分别从10倍和100 倍开始做梯度稀释，同时分别以SP2/0细胞培养上清和腹水做同等稀释度作为阴性对照。 通过检测得知1G7、2B8和3E9三株单抗的腹水效价分别为5 X 106、1 X IO7和1 X IO70(2)鹅副粘病毒单克隆抗体的Ig亚类鉴定按鼠mAb Ig亚类检测试剂盒的说明 书进行。具体方法是将纯化的每株单克隆抗体1000倍稀释后包被酶标板，每孔100 μ L ，37°C孵育1 h，洗涤后每孔加入1 000倍稀释的抗体亚类试剂IOOy L，37°C孵育1 h， 洗涤3遍。然后加入羊抗鼠IgG酶标二抗，37°C孵育1 h，洗涤后加入底物显色，确定三 种单克隆抗体的亚类分别为IgG2a、IgG2b、IgGl。(3)杂交瘤细胞株染色体的分析采用秋水仙素法对杂交瘤细胞株进行染色体分 析，结果显示1G7、2B8、3E9三株杂交瘤细胞的染色体数目分别为93条、97条、101条。(4)鹅副粘病毒单克隆抗体特异性鉴定将所获单克隆抗体分别与小鹅瘟、鹅鸭 瘟病、鹅腺病毒性肝炎、鹅禽流感病毒进行间接ELISA和HI试验，检测所得知制备的三种 单克隆抗体与其它鹅病毒病均无交叉反应性。实施例4胶体金、金标单克隆抗体的制备 1、胶体金的制备
用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释为0.01%，加热煮沸，按每100 ml 0.01%氯金酸加 入2 ml 1%柠檬酸钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温补足水分。制 备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。2、胶体金标记单克隆抗体的制备
6用0. IM碳酸钾调胶体金的PH值至8. 2，按IOOug抗体/毫升胶体金加入抗鹅副 粘病毒单克隆抗体2B8，磁力搅拌器混勻30分钟，加BSA至终浓度为1%，静置1小时。4°C 13000rpm离心30分钟，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金 体积的洗涤保存液重悬沉淀，4 °C备用。实施例5胶体金试纸条的组装 1、样品垫的制备
将样品垫浸泡于封闭液(2% BSA、0. 5%吐温-20、2. 5%蔗糖、0. 05%叠氮钠、0. OlM PBS)中30分钟，37 °C烘干，封装。2、结合垫的制备
将结合垫浸泡于封闭液(2% BSA、0. 5%吐温-20、2. 5%蔗糖、0. 05%叠氮钠、0. OlM PBS)中30分钟，37°C烘干。然后将制备好的金标抗体均勻铺在结合垫上，每毫升铺20平方 厘米，冻干、保存。3、硝酸纤维膜的制备
用包被缓冲液将抗鹅副粘病毒单克隆抗体3E9稀释到50-100ug/ml，调整机器划线 为T线，即为检测线靠近结合垫，距结合垫端约5mm ；用包被缓冲液将兔抗Balb/c小鼠抗体 稀释到50-100ug/ml，调整机器划线为C线，即为对照线靠近吸收垫，距吸收垫端约3mm。两 线距离5-8mm，线应细致均勻，37°C烘干，备用。4、试纸条的组装
将硝酸纤维膜、吸收垫、结合垫(玻璃纤维)、样品垫、背衬按图依次黏贴起来，切成 3. 6mm宽的小条，即为胶体金试纸条。封存备用。实施例6胶体金试纸条的应用 1、本发明试纸条的使用方法
(1)样品制备临床采集待检动物的体液、粪便悬液或组织悬液用于检测。(2)检测取出试纸条，室温平衡20分钟，打开包装取出试纸条，将样品垫浸入待 见样品中，取出，平放，静置10-15分钟，判定结果。(3)结果判定当时纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，没有出现肉眼可见的紫 红色检测线，判为阴性，记为“一”；当试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，同时出现肉眼 可见的紫红色检测线，判为阳性，记为“ + ” ；检测线颜色深度与待检抗原量成正比，颜色越 深说明待检抗原滴度越高，检测线浓厚与质控线颜色一致或接近时判为+ + + +，颜色介 于+和+ + + +之间酌情判为+ +或+ + +。达到+及以上深度时，判为被检样品抗原为 阳性。质控线无条带则判为试纸条失效。2、试纸条的敏感性试验
将GPMV阳性尿囊液分别稀释成HA效价为Z1Iw的各5份，用试纸条进行检测，结 果当HA效价为22以下时试纸条检测为阴性，HA效价为23以上时试纸条检测为阳性，结果 见表1
.1.1.1.1.1.1..................................................................................................................................................................................................■....................■.......................................................■....................................................................■.................................................................................................1.1.
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3、试纸条的特异性试验
i I i ι用检测试纸条检测鹅副粘病毒NA-I株结果为阳性，而检测蒸馏水、传染性法氏囊 病毒、鸽源NDV毒株、小鹅瘟、H9N2禽流感、H3N2禽流感、传染性支气管炎病毒、含产蛋下降 综合征病毒结果为阴性。证明检测卡较为特异。结果见表2。
权利要求
一种鹅副粘病毒病胶体金快速诊断试纸条，其特征在于试纸条由样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)依次粘附在不吸水的支撑薄片(5)上；其中结合垫(2)上包被有胶体金标记的抗鹅副粘病毒单克隆抗体2B8；硝酸纤维素膜(3)上分别包被有抗鹅副粘病毒单克隆抗体3E9构成的检测线T线(6)和兔抗Balb/c小鼠免疫球蛋白抗体IgG构成的质控线C线(7)。
2.根据权利要求1所述的一种鹅副粘病毒病胶体金快速诊断试纸条，其特征在于所述 的结合垫(2)上包被的胶体金标记的抗鹅副粘病毒单克隆抗体2B8的制备方法如下(A)选用抗鹅副粘病毒单克隆抗体2B8标记胶体金，制备金标抗体，用0.IM碳酸钾调 胶体金的PH值至8. 2，按IOOug抗体/毫升胶体金加入抗鹅副粘病毒单克隆抗体2B8，磁力 搅拌器混勻30分钟，加BSA至终浓度为1%，静置1小时。4°C 13000rpm离心30分钟，弃上 清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的洗涤保存液重悬沉淀， 4°C备用。(B)将结合垫浸泡于封闭液即2%BSA、0. 5%吐温-20,2. 5%蔗糖、0. 05%叠氮钠、0. OlM PBS中30分钟，37°C烘干；然后将制备好的金标抗体均勻喷涂于结合垫上，每毫升铺20平 方厘米，冻干、保存。
3.根据权利要求1所述的一种鹅副粘病毒病胶体金快速诊断试纸条，其特征在于所 述的硝酸纤维素膜(3)上包被有抗鹅副粘病毒单克隆抗体3E9构成的检测线T线(6)是选 用另外一种单抗作为捕获抗体喷涂于检测线上，用包被缓冲液将抗鹅副粘病毒单克隆抗体 3E9稀释到50-100ug/ml，调整机器划线为T线，即为检测线靠近结合垫，距结合垫端约5mm。
4.根据权利要求1所述的一种鹅副粘病毒病胶体金快速诊断试纸条，其特征在于所述 的兔抗Balb/c小鼠免疫球蛋白抗体IgG构成的质控线C线(7)是以Balb/c小鼠免疫球蛋 白作为抗原，免疫家兔，提取免疫兔血清中的抗体球蛋白制成，用包被缓冲液将兔抗Balb/c 小鼠抗体稀释到50-100ug/ml，调整机器划线为C线，即为对照线靠近吸收垫，距吸收垫端 约3mm ；两线距离5-8mm，在硝酸纤维素膜NC膜上的质控线上，可与金标抗体结合，以此检验 试纸条的有效性。
5.一种鹅副粘病毒病胶体金快速诊断试纸条，其特征在于所述的试纸条的检测方法是 样品中鹅副粘病毒先和胶体金标记的鼠抗鹅副粘病毒单克隆抗体2B8结合，由于毛细管作 用，反应复合物沿包被膜向前泳动，若样品中有鹅副粘病毒，到达检测线时遇到包被在硝酸 纤维素膜上的鼠抗鹅副粘病毒单克隆抗体3E9，就会形成金标单抗_鹅副粘病毒_单抗复合 物，从而凝集在检测线上，形成特异性的红色沉淀线。没有和鹅副粘病毒结合金标单克隆抗 体则会直接通过检测线，富集在质控线上形成红色沉淀线，即判为阳性结果。若样品中无鹅 副粘病毒，反应复合物到达检测线时遇到捕获抗体就不会形成捕获单抗_鹅副粘病毒_金 标单抗复合物，反应复合物通过检测线，富集在质控线上，形成红色沉淀，即判为阴性结果。
全文摘要
本发明涉及一种鹅副粘病毒病胶体金快速诊断试纸条，其特征在于试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次粘附在不吸水的支撑薄片上；其中结合垫上包被有胶体金标记的抗鹅副粘病毒单克隆抗体2B8；硝酸纤维素膜上分别包被有抗鹅副粘病毒单克隆抗体3E9构成的检测线T线和兔抗Balb/c小鼠免疫球蛋白抗体IgG构成的质控线C线。其具有特异性强、灵敏度高、操作简单和诊断快速的显著优点，可用于鹅副粘病毒病的快速诊断。
文档编号G01N33/558GK101968488SQ20101051866
公开日2011年2月9日 申请日期2010年10月26日 优先权日2010年10月26日
发明者丁壮, 丛彦龙, 张晓东, 张泉鹏, 母连志, 邱翠翠 申请人:吉林大学