专利名称：检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种ELISA试剂盒，具体涉及检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA 试剂盒及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)主要引起妊娠母猪早产、流产、死胎、木乃伊胎及产弱仔猪等繁殖障碍，仔猪和育肥猪主要表现为咳嗽、呼吸困难。本病于1987年首次在美国爆发(Keffaber K K.，1989)， 随后迅速遍及全球各个养猪业发达的国家和地区，给世界的养猪业带来了巨大的经济损失。本病的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)，属于套式病毒目动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒成员 (Cavanagh, 1997 ；Snijderand Meulenberg, 1998) 根据病毒基因组核苷酸序列的差异，将其分为北美洲型和欧洲型两个基因型，PRRSV包括8个开放阅读框。由0RF5基因编码的囊膜糖蛋白GP5大约由200个氨基酸组成，分子量大小约为25kD，是病毒主要的免疫原性蛋白。近年来人们不仅在研究该蛋白的免疫学特性上进行了大量的探索，而且在对其抗原特性的研究上也一直给予了极大关注。我国于1996年首次报道有该病的发生，并且证明是北美洲型PRRSV毒株感染所致 (郭宝清，1996 ；杨汉春，1997)。2006年夏天出现的“高致病性蓝耳病”给我国的养猪业造成极大的危害和重大的经济损失。此次发病和以往的经典毒株有很大的不同，不同日龄、不同品种的猪均可感染，而且来势凶猛、发病突然、传播迅速、死亡率高、治愈率低，严重影响了农民增收及养猪业的生产安全。应用各种免疫血清学技术对疫病做出准确、迅速的诊断是预防和控制该病的重要措施之一。目前，针对PRRS的诊断方法应用最为广泛的是以全病毒作为包被抗原建立的 ELISA方法，如美国IDEXX公司生产的间接ELISA试剂盒。由于病毒需由细胞培养物中大量增殖，而真正意义上的纯化病毒很难获得。该试剂盒的检测费用过高，昂贵的检测费用使许多基层单位难以接受，使其不利于基层的推广和应用。随着亚单位疫苗和核酸疫苗研究的出现，能够提供相应蛋白包被的试剂盒也成为了必要。

发明内容
针对上述不足与需要，本发明提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒及其应用，用于抗体的检测。该试剂盒操作简单，稳定性和重复性好，检测成本低廉，市场前景良好。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome, PRRS)抗体的ELISA试剂盒，包括以下组分(I)ELISA板条以猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因的重组GP5蛋白作为包
3被抗原，每一试剂盒装有4块经(M/V)牛血清白蛋白(BSA)封闭的板条，以包装袋密封包装于4°C保存；(2)洗涤液1倍浓度的pH7. 4磷酸盐缓冲液(PBQ溶液；(3)血清稀释液1% (M/V)BSA 100 毫升；(4)显色底物已加入H2A的四甲基联苯胺(TMB)溶液100毫升，其中每10毫升溶液TMB中含有30% (M/V)浓度H2O215 μ L ；(5)兔抗猪酶标二抗已用血清稀释液(M/V) BSA稀释至工作浓度1 800的兔抗猪酶标二抗100毫升；(6)终止液:2M H2SO4溶液100毫升；(7) PRRS阳性血清5毫升；

(8) PRRS阴性血清5毫升。本发明的ELISA试剂盒可用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体，主要检测步骤如下(1)加入血清样品用血清稀释液1 % (M/V)BSA将被检血清作1 50倍稀释后，每孔加入100 μ L， 每一血清样品添加两孔，同时设立PRRS阴、阳性血清作为对照，各添加两孔；室温下作用 45min，弃去反应孔中的液体；将每个孔用约200 μ L的洗涤液充分清洗3_5次，每次持续 4-5min，在每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，除去残留的液体；(2)加入兔抗猪酶标二抗每孔加入100 μ L兔抗猪酶标二抗，室温作用45min，洗涤3_5次；(3)加入显色底物每孔加入100 μ L已加入H2A的TMB溶液，室温下作用15min ；(4)终止反应向每孔中加入100 μ L 2M H2SO4终止液终止反应；(5)用酶标仪测定OD值在450nm波长下测定各孔吸光度OD值，随后判定结果；(6)结果判定当样本0D450nm彡0. 21时为阳性，< 0. 21的样本为阴性。本发明检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒包被抗原为猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达产物，其优点在于重组GP5蛋白稳定，易于获得和纯化，用纯化的该蛋白作为包被抗原，其浓度易于确定和控制，为检测试剂盒的大量生产提供有力保证；本发明的试剂盒与现有技术相比，在保证特异性、敏感性的前提下，与现有技术(如 IDEXX公司的ELISA试剂盒)的检测符合率为90%。本发明的试剂盒用于抗体的检测，其操作简单，稳定性和重复性好，检测成本低廉，现有技术检测每份血清样品的费用在50元左右，本发明的检测费用在30元左右，大大降低了检测成本，适于推广，应用前景良好。


图1GST-GP5融化蛋白在大肠杆菌BL_21的表达。
图2纯化后的GST-GP5融化蛋白
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通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。
具体实施例方式实施例1本发明所建立的以重组GP5蛋白为包被抗原的间接ELISA方法反应条件的确定通过以下步骤实现1.抗原最适包被浓度和血清最适稀释度的确定用包被液将纯化的PRRSV重组GP5蛋白作梯度稀释1 16(Κ20 μ g/mL)、1 320、 1 640、1 1观0，包被96孔酶标板，每孔加100 μ L。血清从1 25、1 50稀释到1 200， 组成方阵，用EL ISA方法进行操作。分光光度计测定0D450nm值。选择阳性血清0D450nm 值在1左右且阳性0D450nm值/阴性0D450nm值(即P/N)比值最大时的抗原包被浓度和抗体稀释度为最佳工作浓度。方阵滴定结果显示，当重组GP5蛋白的包被浓度为1 640(5yg/mL)，血清稀释度为时1 50，P值为1左右，P/N比值最大为15.667。因此确定重组GP5蛋白的包被最佳浓度为5yg/mL，血清的最佳稀释度为1 50。表IELISA方阵滴定结果
权利要求
1.检测猪繁殖与呼吸综合征(porcinereproductive and respiratory syndrome, PRRS)抗体的ELISA试剂盒，包括以下组分(1)ELISA板条以猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白基因的重组GP5蛋白作为包被抗原，每一试剂盒装有4块经(M/V)牛血清白蛋白(BSA)封闭的板条，以包装袋密封包装于4°C保存；(2)洗涤液1倍浓度的pH7.4磷酸盐缓冲液(PBQ溶液；(3)血清稀释液1%(M/V)BSA 100毫升；(4)显色底物已加入H2O2的四甲基联苯胺(TMB)溶液100毫升，其中每10毫升溶液 TMB 中含有 30% (M/V)浓度 H2O215 μ L ；(5)兔抗猪酶标二抗已用血清稀释液(M/V)BSA稀释至工作浓度1 800的兔抗猪酶标二抗100毫升；(6)终止液2MH2SO4溶液100毫升；(7)PRRS阳性血清:5毫升;(S)PRRS阴性血清5毫升。
2.权利要求1所述ELISA试剂盒在检测猪繁殖与呼吸综合征抗体中的应用，主要操作步骤如下(1)加入血清样品用血清稀释液1 <% (M/V) BSA将被检血清作1 50倍稀释后，每孔加入100 μ L，每一血清样品添加两孔，同时设立PRRS阴、阳性血清作为对照，各添加两孔；室温下作用45分钟， 弃去反应孔中的液体；将每个孔用约200 μ L的洗涤液充分清洗3-5次，每次持续4-5分钟， 在每次洗涤后将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，除去残留的液体；(2)加入兔抗猪酶标二抗每孔加入100 μ L兔抗猪酶标二抗，室温作用45分钟，洗涤3_5次；(3)加入显色底物每孔加入100 μ L已加入H2A的TMB溶液，室温下作用15分钟；(4)终止反应向每孔中加入100 μ L 2Μ H2SO4终止液终止反应；(5)用酶标仪测定OD值在450nm波长下测定各孔吸光度OD值，随后判定结果；(6)结果判定当样本0D450nm彡0. 21时为阳性，< 0. 21的样本为阴性。
全文摘要
本发明提供了一种检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒及其应用，属于生物技术领域。该试剂盒包括以纯化的重组GST-GP5蛋白作为包被抗原的ELISA板条、PBS溶液、血清稀释液、兔抗猪酶标二抗、显色底物、终止液、PRRS阳性血清、PRRS阴性血清等。本发明试剂盒用于检测猪繁殖与呼吸综合征抗体，检测方法经特异性、敏感性、重复性等指标的检验后，将其用于血清样品的检验，与现有技术中ELISA试剂盒的检测符合率为90％。本发明试剂盒便于操作，使用成本低，重复性好，适合推广应用，为临床上快速检测PRRSV抗体提供了可靠的手段。
文档编号G01N33/543GK102175853SQ20111000268
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月7日 优先权日2011年1月7日
发明者严景华, 侯艳红, 焦连国, 赵亚荣, 高福 申请人:中国科学院微生物研究所, 北京大北农科技集团股份有限公司, 福州大北农生物技术有限公司