专利名称：借助于受保护的分析物的控释来检测测试元件中酶的分解的制作方法
借助于受保护的分析物的控释来检测测试元件中酶的分解本发明涉及用于测定至少一种分析物的诊断元件和包含这样的诊断元件的分析测量装置。本发明另外涉及一种用于测定分析物的方法、一种用于校正由分析物产生的信号的方法和一种用于检查使用所述诊断元件的分析测量装置的检测光学部件的方法。最后，本发明涉及用于控释试剂的体系和这样的体系作为开关元件的用途。诊断元件是临床上相关的分析方法的重要组分。在此，分析物(例如代谢物或底物)的测量，例如借助于所述分析物的特异性酶直接地或间接地测定所述分析物具有重要意义。在该情况下，借助于酶-辅酶复合物，将分析物转化并随后定量。在该过程中，使待测分析物与合适的酶、辅酶和任选的介质接触，其中所述辅酶通过酶促反应得到物理化学变化，例如被氧化或还原。如果另外使用介质，那么它通常将在分析物的转化过程中释放出的电子从还原型辅酶转移到光学指示剂或电极的传导组分上，这样使得所述过程例如可以通过光度测量方法或电化学测量方法来检测。校准提供了测量值和待测分析物的浓度之间的直接关系。
从现有技术已知的诊断元件的特点在于，时间有限的稳定性和为获得该稳定性对环境的特殊要求，诸如冷却或干燥贮存。在某些应用形式，例如在由末端用户自己进行测试的情况下，例如在血糖自监测的情况下，因此可能由于错误的，未被觉察的测量体系的不正确贮存而产生用户难以识别的错误结果，并可能导致各种疾病的错误治疗。所述错误结果主要归因于下述事实在这样的诊断元件中使用的酶、辅酶和介质通常对水分和热反应灵敏，并因此被灭活。因而，例如在温暖潮湿的环境条件下借助于葡萄糖脱氢酶/NAD体系来检测葡萄糖时，葡萄糖脱氢酶的活性以及辅酶NAD的含量随着时间而下降，其中辅酶的减少通常比葡萄糖脱氢酶活性的丧失明显进展更快。一种已知的用于提高诊断元件的稳定性的措施是，使用稳定的酶，例如使用得自嗜热生物的酶。此外，存在这样的可能性，通过化学修饰(例如交联)或通过诱变来稳定化酶。此外，也可以加入酶稳定剂例如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和血清白蛋白，或者将酶例如通过光聚合包围在聚合物网络中。另一种用于提高诊断元件的稳定性的方法是，使用稳定化的辅酶。由于核糖和吡啶单元之间的糖基键的不稳定性，天然的辅酶例如NAD和NADP或它们的还原形式NADH和NADPH在碱性或酸性条件下是相对不稳定的，而近年来已经在文献中描述了不同的NAD/NADH和NADP/NADPH的衍生物，它们通过烟酰胺基团或核糖单元的修饰来显著提高辅酶的
稳定性。最后，诊断元件稳定性的提高也可以通过使用稳定的介质来获得。因而，通过使用具有尽可能低的氧化还原电位的介质来增加试验的特异性并消除反应过程中的干扰。但是，酶/辅酶复合物的氧化还原电位会形成介质的氧化还原电位的下限。如果介质的电位低于该限度，与介质的反应会减慢或甚至中止。但是，在实践中在诊断元件中使用的化学检测试剂的组分并非全都具有相同的稳定性，而是更确切地说为不同速度的分解过程所决定。因而，例如当使用carbaNAD作为辅酶时，发生下述效应由于碳环(carbazyklisch)糖单元的存在,甚至在潮湿和升高温度的条件下，经长时间辅酶仍保持非常稳定，而在诊断元件中使用的天然酶的活性持续降低。同样地，例如在使用稳定化的酶和天然辅酶组合的情况中，所述酶的活性可以较长时间地保持，而辅酶的量由于热分解或/和水解分解而或多或少地快速减少。为了避免测定分析物时的错误结果，因此诊断元件必须能够确定在诊断元件中使用的检测试剂的各个组分在测量时是否还以功能形式存在，并因此该检测试剂是否适用于分析物的定性或/和定量检测。在这方面，例如酶活性的测定是非常有问题的，因为酶的灭活首先由蛋白构象的变化造成，并因此由于 缺乏构造的改变而没有形成光学活性的或电化学活性的成分。因此，本发明的目的是，提供一种尤其用于测定葡萄糖的稳定的诊断元件，其中至少部分地消除现有技术的缺点。尤其应确保所述诊断元件在检测试剂的各个组分极大地减少或完全缺失功能性能的情况下，避免给出待测定的分析物的误以为正确的测量结果。根据本发明将通过用于测定至少一种分析物的诊断元件实现该目的，所述诊断元件包括对分析物特异性的检测试剂和确定量的待测分析物(指示剂分析物)，其中所述指示剂分析物以对于与检测试剂的反应来说不可使用的可释放形式存在。在根据本发明的诊断元件中使用的检测试剂优选为化学检测试剂，且可以包括适用于测定分析物(例如使用光学或电化学方法)的任意组分。这种组分的实例是本领域技术人员已知的，且尤其包括酶、辅酶、介质、光学指示剂以及助剂或/和添加剂，但不限于这些。在一个优选的实施方式中，所述检测试剂包括至少一种酶或/和辅酶，它们彼此独立地可以是天然的、半合成的或合成的来源，且可以由本领域技术人员根据诊断元件需要自由地选择。根据本发明，至少一种酶和至少一种辅酶的组合是特别优选的，其中所述酶优选地具有对待测分析物的高特异性，并因此在测定所述分析物的范围内将错误结果减小到最低限度。如果根据本发明的诊断元件包括酶，所述酶优选是辅酶依赖性的酶。这样的酶的实例尤其包括脱氢酶、氧化酶(例如葡萄糖氧化酶(EC I. I. 3. 4)或胆固醇氧化酶(ECI. I. 3. 6))、氨基转移酶(例如天冬氨酸氨基转移酶或丙氨酸氨基转移酶)、5’ -核苷酸酶、肌酸激酶和黄递酶(EC 1.6.99.2)。在一个更优选的实施方式中，使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)依赖性的或烟酰胺-腺嘌呤-二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)依赖性的脱氢酶，其中所述酶尤其选自醇脱氢酶(EC I. I. I. I; EC I. I. I. 2)、L-氨基酸脱氢酶(EC 1.4. I. 5)、葡萄糖脱氢酶(EC I. I. I. 47)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC I. I. I. 49)、甘油脱氢酶(EC I. I. I. 6)、3_羟基丁酸脱氢酶(EC I. I. I. 30)、乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27;
I.I. I. 28)、苹果酸脱氢酶(EC I. I. I. 37)和山梨醇脱氢酶。所述酶最强烈优选地是葡萄糖脱氢酶(EC I. I. I. 47)或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC I. I. I. 49)。如果使用葡萄糖脱氢酶(EC I. I. I. 47)作为酶，则在根据本发明的方法的范围内可以使用例如突变的葡萄糖脱氢酶。在本申请的范围内使用的术语“突变体”是指，天然酶的遗传修饰的变体，所述变体具有与野生型酶相同数目的氨基酸，但是具有改变的氨基酸序列，即它与野生型酶相差至少一个氨基酸。所述一个或多个突变的引入可以使用在本专业领域中已知的重组方法位点专一或非位点专一，但是优选位点专一地进行，其中根据各自的需要和条件在天然酶的氨基酸序列内产生至少一个氨基酸交换。相对于野生型酶，所述突变体特别优选具有提高的热或水解稳定性。这种突变体的实例描述在Baik (AppI.Environ. Microbiol. (2005), 71, 3285) > Vasquez-Figueroa (ChemBioChem. (2007),8,2295)中以及在WO 2005/045016 A2中，在此明确引用其公开内容。突变的葡萄糖脱氢酶可以基本上在它的氨基酸序列中的任意位置处包含相对于对应的野生型葡萄糖脱氢酶改变的一个或多个氨基酸。突变的葡萄糖脱氢酶优选地包括，在野生型葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列的位置96、170和252的至少一个位置处的突变，其中具有在位置96和位置170处的突变或在位置170和位置252处的突变的突变体是特别优选的。已经证实，如果突变的葡萄糖脱氢酶不含有除了这些突变以外的其它突变，则是有利的。在位置96、170和252处的突变基本上可以包括导致稳定化(例如，野生型酶的热或水解稳定性的增加)的任意氨基酸置换。在位置96处的突变优选地包括甘氨酸对谷氨酸的氨基酸置换，而对于位置170，精氨酸或赖氨酸对谷氨酸的氨基酸置换、尤其是赖氨酸对 谷氨酸的氨基酸置换是优选的。至于在位置252处的突变，则它优选包括亮氨酸对赖氨酸
的氨基酸置换。通过源自任意生物来源的野生型葡萄糖脱氢酶的突变，可以得到突变的葡萄糖脱氢酶，其中在本发明的意义上，术语“生物来源”既包括原核生物(例如细菌)也包括真核生物(例如哺乳动物和其它动物)。野生型葡萄糖脱氢酶优选地源自细菌，其中特别优选为来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的葡萄糖脱氢酶,尤其是来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶。在一个特别优选的实施方式中，突变的葡萄糖脱氢酶是通过突变来自枯草芽孢杆菌的野生型葡萄糖脱氢酶而得到的葡萄糖脱氢酶，所述突变的葡萄糖脱氢酶具有在SEQ IDN0:1中所示的氨基酸序列(GlucDH_E96G_E170K)或在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列(GlucDH_E170K_K252L)。在本发明的一个实施方式中，在这一点上所述的诊断元件此外包括辅酶,所述辅酶优选地是稳定化的辅酶。在本发明的意义上，稳定化的辅酶是相对于天然辅酶被化学修饰的辅酶，其在大气压下具有比天然辅酶更高的对湿度、温度(特别是在0°C -50°C的范围内)、酸和碱(特别是在pH 4至pH 10的范围内)或/和亲核试剂(例如醇类或胺类)的稳定性，并因此在相同的环境条件下可以比天然辅酶更久地发挥作用。稳定化的辅酶优选地具有比天然辅酶更高的水解稳定性，其中在试验条件下的完全水解稳定性是特别优选的。与天然辅酶相比，稳定化的辅酶可以具有减小的对酶的结合常数，例如减小1/2或更多的结合常数。在本发明的意义上，稳定化的辅酶的优选实例是稳定化的NAD (P)/NAD (P)H化合物，即天然的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)的化学衍生物，或式(I)化合物
权利要求
1.用于测定至少一种分析物的诊断元件，所述诊断元件包括 Ca)对分析物特异性的检测试剂，和 (b)给定量的待测分析物(指示剂分析物)，其中所述指示剂分析物以对于与检测试剂的反应来说不可使用的可释放形式存在。
2.根据权利要求I所述的诊断元件，其特征在于， 所述检测试剂包括酶或/和辅酶，尤其是稳定化的辅酶。
3.根据权利要求2所述的诊断元件，其特征在于， 所述酶是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)依赖性的或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)依赖性的脱氢酶，尤其是葡萄糖脱氢酶(EC I. I. 1.47)或葡萄糖_6_磷酸脱氢酶(EC I. I. I. 49)。
4.根据权利要求2或3所述的诊断元件，其特征在于， 所述稳定化的辅酶是稳定化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)-化合物或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)-化合物，尤其是carbaNAD或carbaNADP，或式(I)化合物
5.根据权利要求1-4之一所述的诊断元件，其特征在于， 所述检测试剂此外包括介质或/和光学指示剂。
6.根据权利要求1-5之一所述的诊断元件，其特征在于， 所述诊断元件包括载体层以及含有所述检测试剂的检测层。
7.根据权利要求6所述的诊断元件，其特征在于， 所述诊断元件含有在检测层中或在单独的贮存层中的指示剂分析物。
8.根据权利要求7所述的诊断元件，其特征在于， 在所述贮存层和所述检测层之间布置有可溶解的屏障层。
9.根据权利要求6-8之一所述的诊断元件，其特征在于， 所述检测层、所述屏障层或/和所述贮存层包含含有至少一种能量吸收剂的聚合物基质。
10.根据权利要求9所述的诊断元件，其特征在于， 所述聚合物基质由至少一种疏水聚合物、尤其是选自下述的疏水聚合物形成聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚碳酸酯和它们的化学衍生物。
11.根据权利要求9或10所述的诊断元件，其特征在于， 所述聚合物基质含有至少一种共价结合的或/和游离形式的能量吸收剂。
12.根据权利要求9-11之一所述的诊断元件，其特征在于， 所述能量吸收剂是选自花青染料的疏水染料，尤其是隐花青、吲哚三羰花青(C7)、氧杂羰花青(C3),碘化频哪氰醇、硫杂羰花青v(C3)、硫杂二羰花青(C5)和方酸菁染料,尤其是方酸菁染料III。
13.根据权利要求9-12之一所述的诊断元件，其特征在于， 所述指示剂分析物被封装在聚合物基质中。
14.根据权利要求1-13之一所述的诊断元件，其特征在于， 所述指示剂分析物包含光化学或/和电化学可裂解的保护基。
15.根据权利要求1-14之一所述的诊断元件，其特征在于， 所述诊断元件被设计成测试带、测试盘、测试垫、测试条或测试条卷盘。
16.根据权利要求1-15之一所述的诊断元件，其特征在于， 它被设计成用于测定几种分析物。
17.分析测量装置，其包含根据权利要求1-16之一所述的诊断元件。
18.用于测定分析物的方法，所述方法包括下述步骤 (a)使所述分析物与根据权利要求1-16之一所述的诊断元件接触，和 (b)测定所述分析物的存在或/和量。
19.用于校正由分析物产生的信号的方法，所述方法包括下述步骤 Ca)将根据权利要求1-16之一所述的诊断元件引入分析测量装置中， (b)通过使所述分析物与所述诊断元件接触，在所述分析测量装置中产生第一个可检测的信号， (C)通过释放出在所述诊断元件中的指示剂分析物，在所述分析测量装置中产生第二个可检测的信号，和 Cd)使用在步骤(C)中产生的信号，校正在步骤(b)中产生的信号。
20.用于检查分析测量装置的检测光学部件的方法，所述方法包括下述步骤 Ca)将根据权利要求1-16之一所述的诊断元件引入分析测量装置中， (b)通过释放出在所述诊断元件中的指示剂分析物，在所述分析测量装置中产生可检测的信号，和 (C)用参照信号校正在步骤(b)中产生的信号。
21.用于控释试剂的体系，所述体系包括 (a)载体，其包含所述试剂和所述试剂的单独的反应体系，其中所述试剂以对于所述反应体系的反应来说的不可使用的可释放形式存在，且可以在给定的条件下释放，和 (b)用于释放在所述载体上的所述试剂的方式。
22.根据权利要求21所述的体系，其特征在于， 所述试剂被封装在可溶解的基质中，通过可溶解的屏障层与所述反应体系分离，或/和包含化学保护基。
23.根据权利要求21或22所述的体系作为开关元件的用途。
全文摘要
本发明涉及一种用于测定至少一种分析物的诊断元件以及包含这样的诊断元件的分析测量装置。此外，本发明涉及一种用于测定分析物的方法，一种用于校正由分析物产生的信号的方法，以及一种使用所述诊断元件的分析测量装置来检查检测光学部件的方法。最后，本发明涉及一种用于控释试剂的体系和这样的体系作为开关元件的用途。
文档编号G01N33/50GK102741694SQ201080063966
公开日2012年10月17日 申请日期2010年12月15日 优先权日2009年12月16日
发明者C.霍尔恩, D.海因德尔, H-P.哈尔, N.施泰因克 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司