专利名称：用Fe₃O₄@Au核壳纳米探针检测生物分子的方法
技术领域：
本发明涉及一种基于表面增强拉曼光谱，尤其是涉及一种采用Fe3O4OAu核壳纳米探针快速检测生物分子的方法。
背景技术：
在生物样品中进行生物分子的快速、准确检测，对获取生命过程中的化学与生物信息、进行生物医学疾病的诊断以及化学分析具有重要的研究意义和实际价值。对生物分子的检测，包括对器官、组织、细胞，甚至DNA、蛋白质等生物大分子的探测。这就要求我们的检测器件必须逐步微型化，同时也要保证检测的高效和灵敏度，这是目前许多传统的生物分析方法所面临的极大挑战。随着纳米科学技术的飞速发展，采用纳米材料所构成的纳米生物探针成为新一代的生物检测微型器件。其中，磁性纳米粒子和贵金属纳米粒子由于具有独特的物理化学性质和巨大的应用潜力，已经引起了人们广泛的研究兴趣。磁性纳米粒子，如纳米氧化铁 (Fe3O4)具有独特的磁学性能和较好的生物相容性，在细胞和生物分子分离，磁共振成像、药物靶向传输和干细胞标记等生物医学领域表现出潜在的应用前景。金纳米粒子具有独有的光学性质(表面等离子体吸收和共振光散射)，可以极大地增强表面吸附分子的拉曼散射信号。此外，金纳米粒子具有良好的化学稳定性、生物相容性以及易于对其表面进行生物分子修饰的特点，因而在生物医学领域尤其是结合表面增强拉曼光谱进行生物分子如核酸、 蛋白质及其组分等的超灵敏检测中越来越受到重视。然而，由于磁性Fe3O4纳米粒子具有较高的比表面积和强烈的聚集倾向，且化学稳定性不高，易被氧化，在一定程度上限制了其直接应用于生物体系。而以Fe3O4和Au为基本单元构筑的复合纳米材料不仅可以将纳米氧化铁的磁学特性和纳米金的等离子体发光特性和生物相容性集合于一体，赋予其增强的物理化学性能和多元化的功能；而且，更重要的是，核/壳结构的Fe3O4Au纳米复合物可进一步将“核”和“壳”的优势结合起来，改善磁性纳米材料的分散稳定性并促进表面修饰和生物功能化，进而拓展其在生物医学检测领域的应用潜力。本申请人在中国专利CN101773810A中公开一种金包覆四氧化三铁纳米颗粒的合成方法，将FeSO4 · 7H20、KNO3溶液、NaOH溶液和PEI溶液混溶，放入微波反应器反应，再分散于水中，得四氧化三铁纳米颗粒；将HAuCl4溶液加入超纯水中，再加入柠檬酸三钠，搅拌后加入含NaBH4的柠檬酸三钠，继续搅拌，得金纳米颗粒溶液；在Fe3O4-PEI溶液中加入金纳米颗粒溶液，搅拌，再加入PEI溶液，置于烘箱中，磁性分离洗涤后再分散于去离子水中，加入NaOH,再第一次加入NH2OH · HCl和HAuCl4,其后间隔加入NH2OH · HCl和HAuCl4共4次， 每次间隔至少lOmin。

发明内容
本发明的目的在于提供一种方便快捷的用Fe3O4OAu核壳纳米探针检测生物分子的方法。
本发明采用Fe3O4OAu核壳纳米探针，结合表面增强拉曼光谱，方便快捷地检测生物分子的方法。本发明包括以下步骤I)制备 Fe3O4OAu 探针；2)制备金探针取Au胶体溶液，加入孔雀石绿(MGITC)溶液，得混合溶液A， 再加入HS-PEG-C00H和HS-PEG第I次混合，再离心洗涤悬浮于MES中，接着加入EDC和 NHS-Sulfo第2次混合，并加入生物分子B (某一可与检测分子特异性结合的生物分子B)， 温孵，最后离心洗涤重新分散于PBS缓冲液中；3)拉曼检测各取分别修饰有生物分子A和生物分子B的Fe3O4OAu和Au溶液混合，加入待检测的生物分子，温孵，磁性分离，重新分散于超纯水中，采用拉曼光谱仪进行检测。在步骤I)中，所述制备Fe3O4OAu探针的具体方法可为先制备Fe3O4OAu纳米颗粒，在Fe3O4OAu溶液中加入HS-PEG-COOH和HS-PEG混合， 再离心洗涤，悬浮于2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)中，接着加入I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(NHS-Sulf0)，并加入生物分子A (某一可与检测分子特异性结合的生物分子A)，温孵，最后离心洗涤，重新分散于磷酸盐缓冲液(PBS)中；所述HS-PEG-C00H即为一端修饰羧基的巯基聚乙二醇，HS-PEG即为巯基聚乙二醇。所述制备Fe3O4OAu纳米颗粒可按照中国专利CN101773810A所公开的方法制备，具体方法如下(I)四氧化三铁纳米颗粒的制备称取O. 26g FeSO4 ·7Η20溶于2. 5ml 2M/L的KNO3 溶液中，加入2.5ml 1M/L的NaOH溶液，搅拌，加入20ml I 5g/L的分子量为1，800 25，000的PEI溶液，放入微波反应器90°C，反应时间30 120min，反应完后，磁性分离用去离子水洗涤5次，分散于25ml水中保存，最终所得溶液四氧化三铁含量浓度为O. 012M(物质量比为 FeSO4 · 7H20 KNO3 NaOH = I. 87 10 5)；(2) 2. 6nm 金纳米颗粒的制备参照文献(Brown, K. R. ；ffalter, D. G. ；Natan, M. J. Chem. Mater. 2000,12 (2), 306-313)方法，具体步骤为，量取 Iml 1% HAuCl4 溶液滴入 90ml超纯水中磁力搅拌Imin,再滴加2ml朽1檬酸三钠(38. 8mM)搅拌lmin。最后加入Iml 新鲜配制含O. 075% NaBH4的柠檬酸三钠(38. 8mM)。继续磁力搅拌5min。然后置于4°C冰
箱保存。(3)Fe3O4OAu纳米颗粒的合成量取2ml Fe3O4-PEI溶液与金种子溶液机械搅拌 90 120min，转速300 600rpm。再加入5g/L PEI 20ml置于50 60°C烘箱60min，磁性分离洗涤5次，最终分散于20ml去离子水中，加入IlOml O. OlM的NaOH，第一次加入O. 75ml NH2OH .HCl (盐酸羟胺)、0.5ml I % HAuCl4,其后间隔加入 O. 5ml NH2OH · HC1、0. 5ml 1% HAuCl4共4次,每次间隔lOmin。最终离心洗漆3次,每次6000rpm IOmin0所述Fe3O4OAu溶液的摩尔浓度可为12. 3pmol/L,所述Fe3O4OAu溶液HS-PEG_C00H 和HS-PEG的摩尔比可为I : (I 6) (I 6)，所述HS-PEG-C00H的Mw = 486，所述 HS-PEG的Mw = 2000 ;所述混合的时间可为0. 5 2h ;所述MES的摩尔浓度可为IOmM ;所述I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔浓度可为O. 1M，所述NHS-Sulfo的摩尔浓度可为O. 5M ;所述生物分子A的摩尔浓度可为6. 7 μ M ;所述温孵的条件可于37°C下，温孵3h ;所述MES、EDC、NHS、生物分子A和PBS缓冲液的体积比可为 1000 (3 5) (I 3) (4 6) 200。在步骤2)中，所述Au胶体的粒径可为30nm ;所述Au溶胶和孔雀石绿溶液的物质量比可为(10-3 10_2) I ;所述混合溶液A与HS-PEG-C00H和HS-PEG的摩尔比可为 I (I 6) (I 6))，所述 HS-PEG-C00H 的 Mw = 486，所述 HS-PEG 的 Mw = 2000 ;所述第I次混合的时间可为O. 5 2h ;所述MES、EDC、NHS_Sulfo、生物分子B和PBS缓冲溶液的体积比可为1000 (3 5) (I 3) (4 6) 200 ;所述MES的摩尔浓度可为 IOmM,所述EDC的摩尔浓度可为O. 1M，所述NHS-Sulfo的摩尔浓度可为O. 5M ;所述第2次混合的时间可为15min 2h ;所述生物分子B的摩尔浓度可为6. 7 μ M ;所述温孵的条件可为于37°C下温孵3h。在步骤3)中，所述修饰生物分子之后的Fe3O4OAu与Au溶液的体积比可为I : I ; 所述温孵的条件可为37°C下温孵I 3h ;所述拉曼光谱仪可采用LabRam I型共焦显微拉曼光谱仪，所述检测的条件可为633nm，4mff下进行检测。本发明提供一种采用Fe3O4OAu核壳纳米探针，结合表面增强拉曼光谱，方便快捷地检测检测生物分子的方法。Fe3O4OAu纳米颗粒进行表面羧基化修饰后，通过羧基和生物分子A相连接形成捕获探针。而直径为30nm的纳米金颗粒在经过修饰拉曼信号分子后，同样经过羧基化与生物分子B相连形成检测探针。通过捕获探针捕获待检测的生物分子，并与检测探针组成“夹心”结构，即带有拉曼标记分子的Au纳米颗粒就和Fe3O4OAu通过目标检测生物分子结合。这样，经过磁性分离，目标生物分子被快速分离收集，并采用拉曼光谱仪进行检测，通过表面增强拉曼信号检测。与其他制备方法相比，该方法具有以下显著的优点；I)该探针可以方便地利用外加磁场将目标生物分子从复杂的生物样品基质中进行提取、洗涤和浓缩，省去离心，过滤等繁杂的操作，大大提高生物分子检测的效率。2)该探针具有很好的化学稳定性和生物相容性，可以安全的使用在生物分子检测中。3)该探针结合表面增强拉曼光谱，检测体系具有很强的表面增强拉曼信号，通过检测标记分子的增强拉曼信号，实现了对生物分子的快速高灵敏度检测，在实验中检测灵敏度为10_7m。4)相对于传统的生物方法，该方法操作简单快捷。5)该方法重现性好，可实现临床样品的检测。


图I为Fe3O4OAu的扫描电镜图片。在图I中，标尺为Ιμπι;由图I中可见单分散性较好，颗粒直径范围在IOOnm左右。图2为Au(30nm)颗粒扫描电镜图片。在图2中，标尺为200nm。图3为Au(30nm)颗粒透射电镜图片。在图3中，标尺为50nm。由图2和3可见，单分散性较好，颗粒直径范围在30nm左右。
图4为在没有待检测生物分子的空白溶液中，经磁性分离出来的Fe3O4OAu-A纳米颗粒、拉曼信号分子的拉曼图谱以及经过磁性分离所检测到的生物分子的拉曼图谱。在图 4中,横坐标为拉曼位移Rama shift (cm-1);标尺为500counts s-1mW-1;曲线(a)是在没有待检测生物分子的空白溶液中，经磁性分离出来的Fe3O4OAu-A纳米颗粒；曲线(b)代表拉曼信号分子的拉曼图谱；曲线(c)是经过磁性分离，所检测到的生物分子的拉曼图谱。将谱线 (C)对照(a)可以明显看出，在检测到目标生物分子后，有明显的拉曼增强信号；而没有检测到目标生物分子时，几乎没有拉曼信号。
具体实施例方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。实施例IDFe3O4OAu探针的制备首先可按照中国专利CN101773810A所公开的方法制备， 具体方法如下(I)四氧化三铁纳米颗粒的制备称取O. 26g FeSO4 · 7H20溶于2. 5ml 2M/L 的KNO3溶液中，加入2. 5ml 1M/L的NaOH溶液，搅拌，加入20ml I 5g/L的分子量为 (1,800-25,000)的PEI溶液，放入微波反应器90°C，反应时间30 120min。反应完后，磁性分离用去离子水洗涤5次，分散于25ml水中保存，最终所得溶液四氧化三铁含量浓度为 O. 012M(物质量比为 FeSO4 · 7H20 KNO3 NaOH = I. 87 : 10 : 5)。(2) 2. 6nm 金纳米颗粒的制备参照文献Brown, K. R. ；ffalter, D. G. ；Natan, M. J. Chem. Mater. 2000,12 (2), 306-313.方法，具体步骤为，量取 Iml I ^HAucl4 溶液滴入 90ml超纯水中磁力搅拌lmin,再滴加2ml朽1檬酸三钠(38. 8mM)搅拌lmin。最后加入Iml 新鲜配制含O. 075% NaBH4的柠檬酸三钠(38. 8mM)。继续磁力搅拌5min。然后置于4°C冰箱保存。(3)Fe3O4OAu纳米颗粒的合成量取2ml Fe3O4-PEI溶液与金种子溶液机械搅拌 90 120min，转速 300 600rpm。再加入 5g/L PEI 20ml 置于 50 60°C烘箱 60min，磁性分离洗涤5次。最终分散于20ml去离子水中，加入IlOml O. OlM的NaOH，第一次加入 O. 75ml NH2OH^Hcl (盐酸羟胺)、0· 5ml I % HAuCl4,其后间隔加入 O. 5ml NH2OH *HC1,0. 5ml I % HAuCl4共4次，每次间隔lOmin。最终离心洗漆3次,每次6000rpm IOmin0取所制备的Fe3O4OAu 溶液 ImL (12. 3pmol/L)，分别加入 50HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ M)和 50 μ L HS-PEG(Mw = 2000，10 μ Μ)，混合 2h，并离心洗涤最终悬浮于 ImL MES(IOmM)中。接着加入 EDC 4. 75 μ L(O. 1Μ)和 NHS-Sulfo 3. O μ L(0. 5M)混合 2h 并加入 Biotin-PEO-Amine 5. 6 μ L (6. 7 μ Μ)。于37°C条件下,温孵3h。最后离心洗漆重新分散于 200 μ L PBS缓冲溶液中。2)金探针的制备首先取新制备的粒径为30nm的Au胶体溶液，向其中滴加新配制的孔雀石绿溶液。Au溶胶和孔雀石绿溶液的物质量比为(1.65*10_3 I)。然后取Iml 上述溶液，分别加入 15 μ L HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ Μ)和 85 μ L HS-PEG (Mw = 2000Da, 10 μ Μ)，混合0. 5h，并离心洗涤悬浮于ImL MES (10m Μ)中。接着加入EDC 3. 75 μ L (O. 1Μ) 和 NHS-Sulfo I. 89 μ L (O. 5Μ)混合 15min 并加入 Biotin-PEO-Amine 4. 4 μ L (6. 7 μ M)，于 37°C条件下，温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200 μ L PBS缓冲溶液中。
3)拉曼检测各取修饰生物分子之后的Fe3O4OAu和Au溶液100 μ L混合。加入 Streptavidin 4. 5 μ L (10. 5 μ Μ)，置于37°C温孵Ih0磁性分离，重新分散于200 μ L超纯水中，采用LabRam I型共焦显微拉曼光谱仪,在633nm,4mW条件下进行检测。实施例2DFe3O4OAu探针的制备首先可按照中国专利CN101773810A所公开的方法制备， 具体方法如下(I)四氧化三铁纳米颗粒的制备称取O. 26g FeSO4 · 7H20溶于2. 5ml 2M/L 的KNO3溶液中，加入2. 5ml 1M/L的NaOH溶液，搅拌，加入20ml I 5g/L的分子量为 (1,800-25,000)的PEI溶液，放入微波反应器90°C，反应时间30 120min。反应完后，磁性分离用去离子水洗涤5次，分散于25ml水中保存，最终所得溶液四氧化三铁含量浓度为 O. 012M(物质量比为 FeSO4 · 7H20 KNO3 NaOH = I. 87 : 10 : 5)。(2) 2. 6nm 金纳米颗粒的制备参照文献(Brown, K. R. ；ffalter, D. G. ；Natan, M. J. Chem. Mater. 2000,12 (2), 306-313)方法，具体步骤为，量取 Iml 1% HAuCl4 溶液滴入 90ml超纯水中磁力搅拌lmin,再滴加2ml朽1檬酸三钠(38. 8mM)搅拌lmin。最后加入Iml 新鲜配制含O. 075% NaBH4的柠檬酸三钠(38. 8mM)。继续磁力搅拌5min。然后置于4°C冰箱保存。(3)Fe3O4OAu纳米颗粒的合成量取2ml Fe3O4-PEI溶液与金种子溶液机械搅拌 90 120min，转速 300 600rpm。再加入 5g/L PEI 20ml 置于 50 60°C烘箱 60min，磁性分离洗涤5次。最终分散于20ml去离子水中，加入IlOml O. OlM的NaOH，第一次加入 O. 75ml 順20!1*!1(1(盐酸羟胺)、0.51111 I % HAuCl4,其后间隔加入 O. 5ml NH2OH *HC1,0. 5ml I % HAuCl4共4次，每次间隔lOmin。最终离心洗漆3次,每次6000rpm IOmin0取所制备的Fe3O4OAu 溶液 ImL (12. 3pmol/L)，分别加入 15HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ M)和 85 μ L HS-PEG(Mw = 2000,10 μ Μ)，混合 O. 5h,并离心洗涤最终悬浮于 ImL MES(IOmM)中。接着加入 EDC 3. 75 μ L (O. 1Μ)和 NHS-Sulfo I. 89 μ L (O. 5Μ)混合 15min 并加入 free-PSA 抗体(Monoclonal Antibody to H Man free-PSA) 4· 4 μ L (6· 7 μ M)。于 37°C 条件下，温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200 μ L PBS缓冲溶液中。2)金探针的制备首先取新制备的粒径为30nm的Au胶体溶液，向其中滴加新配制的孔雀石绿溶液。Au溶胶和孔雀石绿溶液的物质量比为(1.65*10_3 I)。然后取Iml 上述溶液，分别加入 15 μ L HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ Μ)和 85 μ L HS-PEG (Mw = 2000Da, 10 μ Μ)，混合O. 5h，并离心洗涤悬浮于ImL MES (IOmM)中。接着加入EDC 3. 75 μ L (0. 1Μ)和 NHS-Sulfo I. 89 μ L (0. 5Μ)混合 15min 并加入 McAb PSA (Monoclonal Antibody to H Man PSA)4. 4yL(6. 7μΜ)，于37°C条件下，温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200 μ L PBS缓冲溶液中。3)拉曼检测各取修饰抗体之后的Fe3O4OAu和Au溶液100 μ L混合。加入free-PSA 抗原4. 5 μ L (10. 5 μ Μ)，置于37°C温孵lh。磁性分离，重新分散于200 μ L超纯水中，采用 LabRam I型共焦显微拉曼光谱仪,在633nm,4mW条件下进行检测。实施例3DFe3O4OAu探针的制备首先可按照中国专利CN101773810A所公开的方法制备， 具体方法如下
(I)四氧化三铁纳米颗粒的制备称取O. 26g FeSO4 · 7H20溶于2. 5ml 2M/L 的KNO3溶液中，加入2. 5ml 1M/L的NaOH溶液，搅拌，加入20ml I 5g/L的分子量为 (1,800-25,000)的PEI溶液，放入微波反应器90°C，反应时间30 120min。反应完后，磁性分离用去离子水洗涤5次，分散于25ml水中保存，最终所得溶液四氧化三铁含量浓度为 O. 012M(物质量比为 FeSO4 · 7H20 KNO3 NaOH = I. 87 : 10 : 5)。(2) 2. 6nm 金纳米颗粒的制备参照文献Brown, K. R. ；ffalter, D. G. ；Natan, M.J. Chem. Mater. 2000，12 (2)，306-313.方法，具体步骤为，量取 Iml I ^HAuCl4 溶液滴入 90ml超纯水中磁力搅拌lmin,再滴加2ml朽1檬酸三钠(38. 8mM)搅拌lmin。最后加入Iml 新鲜配制含O. 075% NaBH4的柠檬酸三钠(38. 8mM)。继续磁力搅拌5min。然后置于4°C冰箱保存。(3)Fe3O4OAu纳米颗粒的合成量取2ml Fe3O4-PEI溶液与金种子溶液机械搅拌 90 120min，转速 300 600rpm。再加入 5g/L PEI 20ml 置于 50 60°C烘箱 60min，磁性分离洗涤5次。最终分散于20ml去离子水中，加入IlOml O. OlM的NaOH，第一次加入 O. 75ml 順20!1*!1(1(盐酸羟胺)、0.51111 I % HAucl4,其后间隔加入 O. 5ml NH2OH *HC1,0. 5ml I % HAucl4共4次，每次间隔lOmin。最终离心洗漆3次,每次6000rpm IOmin0取所制备的Fe3O4OAu 溶液 ImL (12. 3pmol/L)，分别加入 15HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ M)和 85 μ L HS-PEG(Mw = 2000,10 μ Μ)，混合 O. 5h,并离心洗涤最终悬浮于 ImL MES(IOmM)中。接着加入 EDC 3. 75 μ L (O. 1Μ)和 NHS-Sulfo I. 89 μ L (O. 5Μ)混合 15min 并加人Biotin-PEO-Amine 4. 4 μ L (6. 7 μ M)。于37°C条件下，温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200 μ L PBS缓冲溶液中。2)金探针的制备首先取新制备的粒径为30nm的Au胶体溶液，向其中滴加新配制的孔雀石绿溶液。Au溶胶和孔雀石绿溶液的物质量比为(1.65*10_3 I)。然后取Iml 上述溶液，分别加入 15 μ L HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ Μ)和 85 μ L HS-PEG (Mw = 2000Da, 10 μ Μ)，混合0. 5h，并离心洗涤悬浮于ImL MES (10m Μ)中。接着加入EDC 3. 75 μ L (O. 1Μ) 和 NHS-Sulfo I. 89 μ L (O. 5Μ)混合 15min 并加入 Biotin-PEO-Amine 4. 4 μ L (6. 7 μ M)，于 37°C条件下，温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200 μ L PBS缓冲溶液中。3)拉曼检测各取修饰生物分子之后的Fe3O4OAu和Au溶液200 μ L混合。加入 Streptavidin9 μ L(IOyM),置于37°C温孵3h。磁性分离，重新分散于400 μ L超纯水中，采用LabRam I型共焦显微拉曼光谱仪,在633nm,4mW条件下进行检测。实施例4DFe3O4OAu探针的制备首先可按照中国专利CN101773810A所公开的方法制备， 具体方法如下(I)四氧化三铁纳米颗粒的制备称取O. 26g FeSO4 ·7Η20溶于2. 5ml 2M/L的KNO3 溶液中，加入2.5ml 1M/L的NaOH溶液，搅拌，加入20ml I 5g/L的分子量为(1，800 25, 000)的PEI溶液，放入微波反应器90°C，反应时间30 120min。反应完后，磁性分离用去离子水洗涤5次，分散于25ml水中保存，最终所得溶液四氧化三铁含量浓度为
O.012M(物质量比为 FeSO4 · 7H20 KNO3 NaOH = I. 87 : 10 : 5)。(2) 2. 6nm 金纳米颗粒的制备参照文献Brown, K. R. ；ffalter, D. G. ；Natan, M.J. Chem. Mater. 2000，12 (2)，306-313.方法，具体步骤为，量取 Iml I ^HAuCl4 溶液滴入90ml超纯水中磁力搅拌lmin,再滴加2ml朽1檬酸三钠(38. 8mM)搅拌lmin。最后加入Iml 新鲜配制含O. 075% NaBH4的柠檬酸三钠(38. 8mM)。继续磁力搅拌5min。然后置于4°C冰
箱保存。(3)Fe3O4OAu纳米颗粒的合成量取2ml Fe3O4-PEI溶液与金种子溶液机械搅拌 90 120min，转速 300 600rpm。再加入 5g/L PEI 20ml 置于 50 60°C烘箱 60min，磁性分离洗涤5次。最终分散于20ml去离子水中，加入IlOml O. OlM的NaOH，第一次加入
O.75ml 順20!1*!1(1(盐酸羟胺)、0.51111 I % HAuCl4,其后间隔加入 O. 5ml NH2OH *HC1,0. 5ml I % HAucl4共4次，每次间隔lOmin。最终离心洗漆3次,每次6000rpm IOmin0取所制备的Fe3O4OAu 溶液 ImL (12. 3pmol/L)，分别加入 15HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ M)和 85 μ L HS-PEG(Mw = 2000,10 μ Μ)，混合 O. 5h,并离心洗涤最终悬浮于 ImL MES(IOmM)中。接着加入 EDC 3. 75 μ L (O. 1Μ)和 NHS-Sulfo I. 89 μ L (O. 5Μ)混合 15min 并加入 free-PSA 抗体(Monoclonal Antibody to H Man free-PSA) 4· 4 μ L (6· 7 μ M)。于 37°C 条件下，温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200 μ L PBS缓冲溶液中。2)金探针的制备首先取新制备的粒径为30nm的Au胶体溶液，向其中滴加新配制的孔雀石绿溶液。Au溶胶和孔雀石绿溶液的物质量比为(1.65*10_3 I)。然后取 Iml 上述溶液，分别加入 50 μ L HS-PEG-C00H (Mw = 486，10 μ Μ)和 50 μ L HS-PEG (Mw = 2000Da, 10 μ Μ)，混合lh,并离心洗涤悬浮于ImL MES (10m M)中。接着加入EDC 5 μ L (0. 1Μ) 和 NHS_Sulfo3y L (0. 5M)混合 2h 并加入 McAb PSA (Monoclonal Antibody to H Man PSA)6 μ L(6. 7 μ M)，于37°C条件下，温孵3h。最后离心洗涤重新分散于200 μ L PBS缓冲溶液中。3)拉曼检测各取修饰抗体之后的Fe3O4OAu和Au溶液100 μ L混合。加入free-PSA 抗原4. 5 μ L (10. 5 μ Μ)，置于37°C温孵lh。磁性分离，重新分散于200 μ L超纯水中，采用 LabRam I型共焦显微拉曼光谱仪,在633nm,4mW条件下进行检测。
权利要求
1.用Fe3O4OAu核壳纳米探针检测生物分子的方法，其特征在于包括以下步骤1)制备Fe3O4OAu探针；2)制备金探针取Au胶体溶液，加入孔雀石绿溶液，得混合溶液A，再加入 HS-PEG-C00H和HS-PEG第I次混合，再离心洗涤悬浮于MES中，接着加入EDC和NHS-Sulfo 第2次混合，并加入生物分子B，温孵，最后离心洗涤重新分散于PBS缓冲液中；3)拉曼检测各取分别修饰有生物分子A和生物分子B的Fe3O4OAu和Au溶液混合，加入待检测的生物分子，温孵，磁性分离，重新分散于超纯水中，采用拉曼光谱仪进行检测。
2.如权利要求I所述的用Fe3O4OAu核壳纳米探针检测生物分子的方法，其特征在于在步骤I)中，所述制备Fe3O4OAu探针的具体方法为先制备Fe3O4OAu纳米颗粒，在Fe3O4OAu溶液中加入HS-PEG-C00H和HS-PEG混合，再离心洗涤，悬浮于2-(N-吗啉代)乙磺酸中，接着加入I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐，并加入生物分子A，温孵，最后离心洗涤，重新分散于磷酸盐缓冲液中。
3.如权利要求I所述的用Fe3O4OAu核壳纳米探针检测生物分子的方法，其特征在于在步骤I)中，所述制备Fe3O4OAu纳米颗粒的具体方法如下(1)四氧化三铁纳米颗粒的制备称取O.26g FeSO4 · 7H20溶于2. 5ml 2M/L的KNO3溶液中，加入2. 5ml 1M/L的NaOH溶液，搅拌，加入20ml I 5g/L的分子量为1，800 25，000 的PEI溶液，放入微波反应器90°C，反应时间30 120min，反应完后，磁性分离用去离子水洗涤5次，分散于25ml水中保存，最终所得溶液四氧化三铁含量浓度为O. 012M，物质量比为 FeSO4 · 7H20 KNO3 NaOH = I. 87 10 5 ；(2)2. 6nm金纳米颗粒的制备量取Iml I % HAuCl4溶液滴入90ml超纯水中磁力搅拌 Imin,再滴加2ml朽1檬酸三钠搅拌Imin,最后加入Iml新鲜配制含O. 075% NaBH4的朽1檬酸三钠，继续磁力搅拌5min。然后置于4°C冰箱保存；(3)Fe3O4OAu纳米颗粒的合成量取2mlFe3O4-PEI溶液与金种子溶液机械搅拌90 120min,转速300 600rpm，再加入5g/L PEI 20ml置于50 60°C烘箱60min，磁性分离洗涤5次，最终分散于20ml去离子水中，加入IlOml O. OlM的NaOH，第一次加入O. 75ml盐酸羟胺、0.5ml I % HAuCl4,其后间隔加入 O. 5ml NH2OH · HC1、0. 5ml I % HAuCl4 共 4 次，每次间隔lOmin，最终离心洗漆3次,每次6000rpm IOmin0
4.如权利要求I所述的用Fe3O4OAu核壳纳米探针检测生物分子的方法，其特征在于在步骤I)中，所述Fe3O4OAu溶液的摩尔浓度为12. 3pmol/L，所述Fe3O4OAu溶液HS-PEG_C00H 和 HS-PEG 的摩尔比为 I : (I 6) (I 6)，所述 HS-PEG-C00H 的 Mw = 486，所述 HS-PEG 的 Mw = 2000。
5.如权利要求I所述的用Fe3O4OAu核壳纳米探针检测生物分子的方法，其特征在于在步骤I)中，所述混合的时间为O. 5 2h ;所述MES的摩尔浓度为IOmM ;所述I-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔浓度为O. 1M，所述NHS-Sulfo的摩尔浓度为O. 5M ;所述生物分子A的摩尔浓度为6. 7μΜ ;所述温孵的条件于37°C下，温孵3h ;所述MES、EDC、NHS、生物分子A和PBS缓冲液的体积比为1000 (3 5) (I 3) (4 6) 200。
6.如权利要求I所述的用Fe3O4OAu核壳纳米探针检测生物分子的方法，其特征在于在步骤2)中，所述Au胶体的粒径为30nm;所述Au溶胶和孔雀石绿溶液的物质量比为(10_3 1(Γ2) I ;所述混合溶液A与HS-PEG-C00H和HS-PEG的摩尔比可为I : (I 6) (I 6)，所述 HS-PEG-C00H 的 Mw = 486，所述 HS-PEG 的 Mw = 2000。
7.如权利要求I所述的用Fe3O4OAu核壳纳米探针检测生物分子的方法，其特征在于在步骤2)中，所述第I次混合的时间为O. 5 2h ;所述MES、EDC、NHS_Sulfo、生物分子B和 PBS缓冲溶液的体积比为1000 (3 5) (I 3) (4 6) 200;所述MES的摩尔浓度可为10mM，所述EDC的摩尔浓度可为O. 1M，所述NHS-Sulfo的摩尔浓度可为O. 5M。
8.如权利要求I所述的用Fe3O4OAu核壳纳米探针检测生物分子的方法，其特征在于在步骤2)中，所述第2次混合的时间为15min 2h ;所述生物分子B的摩尔浓度为6. 7 μ M ; 所述温孵的条件可为于37°C下温孵3h。
9.如权利要求I所述的用Fe3O4OAu核壳纳米探针检测生物分子的方法，其特征在于在步骤3)中，所述修饰生物分子之后的Fe3O4OAu与Au溶液的体积比为I : I。
10.如权利要求I所述的用Fe3O4OAu核壳纳米探针检测生物分子的方法，其特征在于在步骤3)中，所述温孵的条件为37°C下温孵I 3h ;所述检测的条件可为633nm，4mW下进行检测。
全文摘要
用[email protected]核壳纳米探针检测生物分子的方法，涉及一种基于表面增强拉曼光谱。先制备[email protected]探针；再制备金探针；最后拉曼检测。优点可方便利用外加磁场将目标生物分子从复杂的生物样品基质中进行提取、洗涤和浓缩，省去离心，过滤等繁杂的操作，大大提高生物分子检测的效率。具有很好的化学稳定性和生物相容性，可安全使用在生物分子检测中。该探针结合表面增强拉曼光谱，检测体系具有很强的表面增强拉曼信号，通过检测标记分子的增强拉曼信号，实现了对生物分子的快速高灵敏度检测，在实验中检测灵敏度为10-7M。相对于传统的生物方法，该方法操作简单快捷。该方法重现性好，可实现临床样品的检测。
文档编号G01N21/65GK102590174SQ20121003248
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者周樨, 张其清, 徐文龙, 石延峰 申请人:厦门大学