专利名称：一种K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地讲，涉及一种κ-ras基因12密码子突变的双荧 光标记探针实时定量检测方法，及其应用。
背景技术：
K-ras基因(GenBank:NC_000012)突变在胰腺癌的发生发展中起重要作用。已 报道，在胰腺癌组织、胰液或粪便、血液中可检测出K-ras基因第12、13或61密码子点 突变(0MJCM Takahashi, et al. Spontaneous rupture of a biliary diverticulum in the distal common bile duct, with formation of a retroperitoneal biloma, Gastrointestinal Endo 2005 ；61 :76-9 ；Laghi L,et al. Common occurrence of multiple K-RAS mutations in pancreatic cancers with associated precursor lesions and in biliary cancers, Oncogene 2002 ；21 :4301-6 ；Tada Μ, et al. Detection of ras gene mutations in pancreatic juice and peripheral blood of patients with pancreatic adenocarcinoma, Cancer Res 1993 ；53 :2472-4 ；Lu XH, et al. An application value of detecting K~ras and p53 gene mutation in the stool and pure pancreatic juice for diagnosis of early pancreatic cancer, Natl Med J China 2001 ；81 :1050-3 ；N van Heek, et al. Comparison of the novel quantitative ARMS assay and an enriched PCR-ASO assay for K_ras mutations with conventional cytology on endobiliary brush cytology from 312 consecutive extrahepatic biliary stenoses, J. Clin. Pathol. 2005；58 ；1315-1320)。研究表明，检测体细胞DNA中K-ras基因突变与否可作为胰腺癌早期诊断的一种 方法。但在一些实验中发现慢性胰腺炎及胆道结石等良性疾病中也存在K-ras基因突变， 单纯定性分析，特异性较差，定量分析能更好反映突变程度，以便于良恶性鉴别。目前普遍 应用的κ-ras基因突变检测方法为限制性片断长度多态性分析法(RFIi^i)和扩增受阻突 变体系法(ARMS法)。RFLP法原理是将PCR与限制性酶切相结合的方法。第一步PCR引物(K1-上游 5' -CTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT-3'与K2-下游5' -TCAAAGAATGGTCCTGGACC-3 ‘)通过单一碱基错配，在 Κ-ras 基因 第12密码子上游引入BstNI酶切位点，第一步PCR反应中野生型与突变型基因同比扩增， 之后内切酶BstNI破坏了野生型片断，在第二步PCR时主要就只能扩增突变型基因片断，使 突变型基因片断“信号放大”，从而提高了检测基因突变的敏感性。该方法的缺点是1.步 骤烦琐，需要2天时间才能完成鉴定；2.这种方法只能作定性研究，即只能明确是否存在 K-ras基因突变，若要求定量，则需用其他的方法进行进一步检测；3.存在第一轮酶切不完 ^:^ 白勺fiP日个生(0MJCM Watanabe H, et al. Detection of K-ras point mutations at codon 12 in pure pancreatic juice for the diagnosis of pancreatic cancer byPCR-RFLP analysis, Pancreas 1996;12:18-24)。ARMS法原理是根据3'端错配原则，在进行扩增反应时，若3‘端碱基对形成错 配，链延伸反应就会因3' ,5' 二磷酸二酯键形成的障碍而受阻，因此，只有模板链是特定 的等位基因时，才会检测出特异的扩增产物。在ARMS的反应体系中，引物上标记2个不同荧 光素，或加入荧光探针等方法都是以实时荧光PCR为基础的基因分型方法。该方法的缺点 是1.每种特异性引物或探针只能针对某一种基因突变类型进行鉴定，而K-ras基因在第 12、13密码子的突变类型可有十余种，需要逐一检测；2.可能出现由于单一碱基错配造成 的假阳性(参见文献 Fox JC, et al. The detection of K_ras mutations in colorectal cancer using the amplification-refractory mutation system,Br J Cancer 1998 ；77 1267-74)。肽核酸是一种DNA类似物，其骨架由2-氨乙基甘氨酸取代了 DNA的磷酸二酯糖， 其较之传统DNA探针具有不少优点1. PNA十分稳定，正确配对的DNA/PNA的稳定性远远高 于相应的DNA/DNA，同时在PCR反应过程中PNA不可作为Taq酶的底物，亦不会被其他酶所 降解。2.对于错配的PNA/DNA，哪怕只有一个碱基的错配，也会造成其融解温度下降9-10°C 左右。目前，肽核酸作为一种非常有用分子生物学工具已在疾病的诊断、治疗等领域得到应 用(参见文献张兵波等，PNA探针与DNA探针的系统比较A Systemic Comparison between PNA Probe and DNA Probe，《高分子通报》2006 ；9 :62-68 ；Egholm M，et al. PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules, Nature,1993，365 :566 568.)。

发明内容
本发明的目的是提供一种既能定性并定量检测K-ras基因12密码子突变，又能分 辨κ-ras基因12密码子突变不同类型的双荧光标记探针实时定量检测方法，及其应用。基于背景技术中肽核酸作为DNA探针的优点，本发明将其与实时定量PCR检测结 合，针对于不同性质的K-ras基因12密码子突变分别设计由FAM和VIC两种荧光标记的 Taqman MGB探针，应用于K_ras基因检测，并且可分辨K_ras基因12密码子突变的不同类 型。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种K-ras基因12密码子突变的双 荧光标记探针实时定量检测方法，包括如下步骤设计针对野生型κ-ras基因特定密码子 的PNA，设计针对于不同性质的κ-ras基因突变分别设计FAM和VIC荧光标记的Taqman MGB 探针；利用PNA及探针，对已知突变量的质粒标准品进行实时定量PCR检测，得出标准曲线； 提取、纯化样品DNA，测定浓度，进行实时定量PCR检测，根据标准曲线，以及FAM和VIC荧光 的类别，借以判别K-ras基因突变量和突变类型。其中所述PNA 为 NH2-CCTACGCCACCAGCTCC-C00H(SEQ ID NO 1)；其中所述的K-ras-FAM Tagman MGB 探针和 K-ras-VIC Tagman MGB 探针为FAM_ CTACGCCADCAGCTCCAACT-MGB(FAM-SEQ ID NO :2_MGB)和 VIC-CTACGCCACDAGCTCCAACT-MGB( VIC-SEQ ID NO :3_MGB)；其中所述的PCR引物为上游引物F:5' -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3 ‘ (SEQ ID NO 4)；
下游引物R:5' -TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3‘ (SEQ ID NO 5)。其中所述的样品DNA取自粪便、血液、组织液、细胞株或组织。本发明还提供了上述K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测 方法在制备胰腺癌诊断试剂盒中的应用。该试剂盒包括分别装有核酸扩增体系反应液、荧光监测体系反应液、 阳性标准品等，并加盖密封的试剂管/瓶；其中核酸扩增体系反应液中的PNA为 NH2-CCTACGCCACCAGCTCC-C00H ；PCR 上游引物为 5 ‘ -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3 ‘； PCR下游引物为5 ‘ -TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3 ‘；荧光监测体系反应 液中的 K-ras-FAMI^agman MGB 探针和 K-ras-VIC Tagman MGB 探针分别为 FAM-CTACGCCADCAGCTCCAACT-MGB 和 VIC-CTACGCCACDAGCTCCAACT-MGB。本发明采用联合肽核酸(PNA)的实时定量PCR法检测K_ras基因12密码子点突 变量和突变类型。所述K-ras基因可以是从粪便、组织、组织液、细胞珠及血液中提取的DNA 中的基因。因为PNA同时覆盖了 K-ras基因第一外显子中第12、13密码子的6个碱基，任 一突变均可导致PNA/DNA的错配，使得融解温度发生明显改变，故只需设计一种针对野生 型的PNA，进行一次PCR反应，即可区分野生型与突变型。因此本发明是一种操作简便、敏感 性高、特异性高的K-ras基因实时定量检测方法，可实时定量检测K-ras基因12密码子突 变量和突变类型，并可用于胰腺癌等疾病的诊断。


图1是K-ras-FAM Tagman MGB探针敏感性和特异性的结果。图2是K-ras-VIC Tagman MGB探针敏感性和特异性的结果。图3是K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量PCR检测的标准曲 线，其中横坐标为拷贝数的对数值；纵坐标为:Ct值；Slope :-4.2 ;InterC印00; R2 :0.999。图4是胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人群K-ras基因突变率的比较。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进行详细描述。以下实施例以在胰腺癌患者 K-ras基因的实时定量检测为例，对本发明作详细描述。应理解，该实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。实施例11.主要试剂来源1. 1 设计 PNAPNA是针对野生型K-ras基因第12、13密码子设计的PNA，由韩国panagene公司 合成，其组成为NH2-CCTACGCCACCAGCTCC-C00H。1. 2 设计 Tagman MGB 探针K-ras-FAM Tagman MGB 探针禾口 K-ras-VIC Tagman MGB 探针由美国 AppliedBiosystems公司合成，其组成分别为K-ras-FAM Tagman MGB 探针5
FAM-CTACGCCADCAGCTCCAACT-MGB ；K-ras-VIC Tagman MGB 探针VIC-CTACGCCACDAGCTCCAACT-MGB。1.3PCR 引物PCR引物由美国AppliedBiosystems公司合成。上游引物F 5 ‘ -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3 ‘；下游引物R 5 ‘ -TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3 ‘。1. 4 TaqMan Gene Expression Master Mix购买于美国 AppliedBiosystems 公司。1. 5 K-ras基因野生型和突变型标准品K-ras基因野生型标准品GGT和K_ras基因突变型标准品GAT、GCT、GTT、AGT、CGT、 TGT由上海hvitrogen公司合成，其基因序列组成分别为1. 5. IGGT 野生型ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQID NO 6)；1. 5. 2GAT 突变型ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ IDNO 7)；1.5. 3GCT 突变型ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGCTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQID NO 8)；1. 5. 4GTT 突变型ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ IDNO 9)；1. 5. 5AGT 型突变ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTAGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQID NO :10)；1. 5. 6CGT 型突变ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTCGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQID NO :11)；1. 5. 7TGT 型突变ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGT6
TGGAGCTTGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAA(SEQ IDNO :12)。
将模板倍比稀释为106、105、104、103、102、10\0拷贝，作为标准品模板。2. ITaqMan MGB探针实时定量实验该方法选用针对K-ras基因靶序列的特异性Taqman MGB探针。K-ras-FAM Tagman MGB探针两端分别以报告基团FAM及淬灭基团MGB标记，其特异性和K-ras基因12密码子 GAT、GCT、GTT等三种突变类型相结合；K-ras-VIC Tagman MGB探针两端分别以报告基团 VIC及淬灭基团MGB标记，其特性性和K-ras基因12密码子AGT、CGT、TGT等三种突变类型 相结合。同样地，实验中PNA能将野生型基因完全抑制，因此仪器所检测的荧光量可反应突 变基因的拷贝量。该方法特异性高，由于不受引物二聚体影响，定量将更加准确。2. 1. 1反应体系及反应条件仪器选用ABI公司的7500型实时定量PCR仪。B. M W % ^ ^ TaqMan Gene Expression Master Mix 12. 5 μ 1，弓 | · F、 R(序列如 1. 3)0. 5 μ l(5pmol/y 1)，PNAl μ l(10pmol/y 1)，MGB 探针(序列如 1. 2)各 0. 3μ KlOpmol/μ 1), DNA标准品模板为ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、ΙΟ2、101、。拷贝，用无菌双蒸水定 容至25μ 1。PCR反应条件95°C预变性10m，之后95°C变性15s，76°C PNA结合15s，60°C退火 60s，共50个循环。2. 1. 2根据标准曲线判定探针的敏感性和特异性根据PCR标准品的标准曲线检验K-ras-FAM Tagman MGB探针和K-ras-VIC Tagman MGB探针的敏感性(图1)和特异性(图2)。图1示K-ras-FAM Tagman MGB能够检测出 GAT、GCT、GTT三种K-ras基因12密码子突变而无法检测出AGT、CGT、TGT其他三种K_ras 基因12密码子突变。图2示K-ras-VIC Tagman MGB能够检测出AGT、CGT、TGT三种K-ras 基因12密码子突变而无法检测出GAT、GCT、GTT其他三种K_ras基因12密码子突变。由此 可见K-ras-FAM Tagman MGB探针和K-ras-VIC Tagman MGB有较高的特异性和敏感性。2. 1. 3定量方法选用同一系列倍比稀释的质粒标准品，分成两组，一组标准品反应体系中加入FAM 型标准品，另一组加入VIC型标准品。同一待检模板同时设置FAM和VIC两个待测探针为 两组。反应结束后，利用两组标准品分别制作标准曲线(图3)，分别进行待检样本的定量， 可实时定量检测K-ras基因12密码子突变量。2. 1. 4突变类型检测方法根据实时定量PCR反应结束后，可得知待测样本发出荧光的不同来判断K-ras基 因突变类型。检测不到荧光提示GGT野生型K-ras基因；检测到FAM荧光提示GAT、GCT、GTT 突变型K-ras基因；检测到VIC荧光提示AGT、CGT、TGT突变型K_ras基因。根据实验中收 集到的样本发出荧光类型，可分辨K-ras基因的突变类型。3.收集临床胰腺癌、慢性胰腺炎患者及正常人血液，抽提DNA。3. 1标本收集胰腺癌、慢性胰腺炎患者及正常人，采抗凝全血1ml。3. 2血液DNA抽提方法①、抗凝全血0. 5_12ml ；②、加入500_700ul TT缓冲液，剧 烈振荡后，低温离心机12000转/分离心5分钟；③、收集沉淀。重复2，3步骤，直至沉淀为 无色；④、加入200ulPCR裂解液A ；⑤、37°C水浴过夜；⑥、抽取PCR裂解物(约200ul)，加入200ul酚氯仿，充分混勻后，12000转/分离心20分钟；⑦、取上清，加入200ul氯仿充分 混勻，12000转/分离心10分钟；⑧、取上清，加入IOOul乙酸铵及2倍体积无水乙醇(约 700ul)充分混勻，静置1分钟后，12000转/分离心10分钟；⑨、弃上清加入lml70%乙醇洗 涤，12000转/分离心5分钟；⑩、弃上清，自然风干，用lOOulTE液溶解沉淀，分装于_80°C保存。3. 3 DNA浓度测定应用NanoDrop ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计测出浓度。3. 4标本进行K-ras基因的PNA钳制定量PCR法检测按照方法2. 1. 3和2. 1. 4，进行K_ras基因的PNA钳制PCR法定量和突变类型检 测。4.结果分析根据步骤2. 1. 3所得标准曲线，得出待测样本K-ras基因突变量。根据步骤2. 1. 4， 得出待测样本本K-ras基因突变类型。经过检测及数据转换，得到胰腺癌、慢性胰腺炎以及正常人群血液中K-ras基因 的突变量。运用SPSS18. 0软件，采用卡方检验得到胰腺癌、慢性胰腺炎和正常人群各个两 组之间均有显著差异(P<0. 05)，组间的比较如图4所示。证实胰腺癌血液中K-ras基因 的突变率高于慢性胰腺炎和正常人群.更进一步证实对于K-ras基因12密码子突变的双 荧光标记探针实时定量检测的方法在现实实际中有可操作性，同时具有科学性。本实施例仅以胰腺癌、慢性胰腺炎、正常人群血液为检测样本，对本发明的技术方 案进行了验证，但是根据本发明的公开，也可以采集患者的胰液、粪便、组织、胰腺穿刺物等 为DNA样本，也同样运用本实施例公开的方法准确、简便地定量检测K-ras基因。
权利要求
1.一种κ-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测方法，包括如下步 骤设计针对野生型K-ras基因特定密码子的PNA，设计针对于不同性质的K-ras基因突变 分别设计FAM和VIC荧光标记的Taqman MGB探针；利用PNA及探针，对已知突变量的质粒 标准品进行实时定量PCR检测，得出标准曲线；提取、纯化样品DNA，测定浓度，进行实时定 量PCR检测，根据标准曲线，以及FAM和VIC荧光的类别，借以判别K-ras基因突变量和突 变类型；其中所述PNA如SEQ ID NO 1所示；其中所述的 K-ras-FAM Tagman MGB 探针如 FAM-SEQ ID NO :2_MGB 所示，K-ras-VIC Tagman MGB 探针如 VIC-SEQ ID NO :3_MGB 所示；其中所述的PCR上游引物如SEQ ID NO 4所示，下游引物如SEQ ID NO 5所示。
2.根据权利要求1所述的K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测 方法，其中所述的样品DNA取自粪便、血液、组织液、细胞株或组织。
3.—种如权利要求1所述的K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检 测方法在制备胰腺癌诊断试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域。K-ras基因突变在胰腺癌的发生发展中起重要作用，但目前普遍应用的K-ras基因突变检测方法为限制性片断长度多态性分析法和扩增受阻突变体系法，但两方法特异性不高，且不能同时定性和定量检测K-ras基因的突变。本发明的目的是提供一种操作简便、敏感性高、特异性高的K-ras基因12密码子突变的双荧光标记探针实时定量检测方法，该方法设计针对野生型K-ras基因12密码子的PNA及相应的突变检测探针K-ras-FAMTagman MGB探针和K-ras-VIC Tagman MGB探针；利用PNA及探针，对已知突变量的质粒标准品进行实时定量PCR检测，得出标准曲线和荧光类型；提取、纯化样品DNA，测定浓度，进行实时定量PCR检测，根据标准曲线和荧光类型，借以判别K-ras基因突变量和突变类型。
文档编号G01N21/64GK102041313SQ20101051212
公开日2011年5月4日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者任艳, 李兆申, 王小玮, 顾俊骏, 高军, 黄浩杰 申请人:中国人民解放军第二军医大学