专利名称：识别天然的膜联蛋白a3的新抗体的制作方法
识别天然的膜联蛋白A3的新抗体
技术领域：
本发明涉及识别天然的膜联蛋白A3的新抗体。这些抗体适宜于诊断性及治疗性应用。
背景技术：
之前的研究显示，ANXA3显著相关于前列腺疾病及前列腺癌的进展及各阶段。尚且，对人前列腺中ANXA3的作用及生物学知之甚少。迄今已显示，ANXA3所谓的外来体的部分，从各种上皮释放的小囊泡。有迹象表明此现象(其是ANXA3的诊断性表现的基础)是由于前列腺癌中自身免疫的复杂的调节。用于治疗或诊断前列腺癌及其他泌尿生殖道上皮癌的蛋白生物标记描述于US 2005 130 876，WO 03 086 461，WO 2005 078 124，EP 05011 042. 8 及 EP 05 026 092.6。 将这些文献的内容通过弓I用并入本文。US 60/812，089及US 60/859，489公开了癌的诊断，其中用高度特异性单克隆抗体分析样品中膜联蛋白A3的存在和/或量。将这些文献的内容通过引用并入本文。尽管ANXA3已知为前列腺癌的标记物，及有关组织切片中良性，恶变前及恶性病情之间的差异诊断的方法的特异性抗体可用，但通过这些抗体测量尿及压出尿中的ANXA3 遇到惊人的困难。尿中"天然的"ANXA3的构象使得目前可用的在蛋白印迹或组织染色中高度特异性的抗体仅检测蛋白级分。此可能是由于外来体/前列腺小体中ANXA3的折叠导致对于特异性蛋白识别重要的表位非-接近性。已探究这些表位及详细描述于之前专利申请。

发明内容本研究的目的旨在研究体液(例如尿及压出尿)中天然的ANXA3的定量丰度。本发明发现使用之前描述的具有预后关联性的抗ANXA3-抗体的尿中ANXA3的有效检测仅在采用变性条件及蛋白印迹技术中才可能。无这些之前描述的抗体在基于ELISA 的测试中工作良好，其中压出尿在"天然的"条件下测试。意外地，我们接着组成ANXA3的完全特异性"抗体-反应性表面"及之前描述的表位，发现，在尿，压出尿及其他体液(如血浆或血清)中识别"天然的"ANXA3的抗体具有特异性识别天然的ANXA3的额外的表位。在第一方面，本发明涉及识别天然的膜联蛋白A3 (尤其是天然的人膜联蛋白A3) 的抗体。这些抗体能在非-变性条件下(即在体液(例如尿及压出尿)中)与ANXA3特异性结合。在第一优选的实施方式中，本发明涉及识别天然的膜联蛋白A3的抗体，其针对人膜联蛋白A3的氨基酸序列59 67中的表位EYQAAYGKE(SEQ ID NO :1)，或所述抗体的抗原-结合片段。所述抗体之特定例选自
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(i)抗体· TGC42、參TGC43、或· TGC49,(ii)与来自⑴的抗体具有相同的抗原结合位点的抗体，及(iii)所述抗体的抗原-结合片段。还优选的实施方式涉及识别天然的膜联蛋白A3的抗体，其针对人膜联蛋白A3的氨基酸序列1 106中的构象表位，或所述抗体的抗原-结合片段。例如，此抗体可针对人膜联蛋白A3的氨基酸序列1 34中的构象表位，或所述抗体的抗原-结合片段。或者，此抗体可针对人膜联蛋白A3的氨基酸序列35 106中的构象表位，或所述抗体的抗原-结合片段。所述抗体的特定例选自(i)抗体· TGC44、或· TGC48,(ii)与来自(i)的抗体具有相同的抗原-结合位点的抗体，及(iii)所述抗体的抗原-结合片段。在又一实施方式中，本发明的抗体选自(i)抗体 TGC42，TGC43, TGC44, TGC45, TGC46, TGC47, TGC48 或 TGC49，(ii)与来自(i)的抗体具有相同的结合位点的抗体，及(iii)与来自(i)或(ii)的抗体识别天然的人膜联蛋白A3上相同的表位的抗体， 及(iv)所述抗体的抗原-结合片段。将产生抗体TGC42 (DSM ACC 2972)，TGC43 (DSM ACC 2970)，TGC44 (DSM ACC 2976)，TGC45(DSM ACC 2974)，TGC46(DSMACC 2975)，TGC47(DSM ACC 2977)，TGC48(DSM ACC 2971)及TGC49(DSM ACC 2973)的杂交瘤细胞系根据布达佩斯条约于2008年9月17日保藏在DSMZ(德意志微生物和细胞培养物保藏中心，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig。本发明的抗体可为单克隆抗体，嵌合抗体，人源化的抗体，人抗体或重组抗体，例如单链抗体或所述抗体的抗原-结合片段(例如蛋白水解片段或重组单链抗体片段)。抗体在医学中有用，尤其是用于人医学。更具体而言，抗体可用于诊断性或治疗性应用。最优选，抗体用于诊断癌，例如前列腺癌。有利地，本发明的抗体用于在天然的条件下进行的诊断性测定，例如捕获测定，例如ELISA，其中测定天然的膜联蛋白A3的存在和/或量。对于治疗性及诊断性应用，可将本发明的抗体缀合于如本领域所知的效应基团或标记基团。效应基团可例如选自细胞毒性基团或化合物，例如化学治疗剂或放射性核素。标记基团可选自任何已知的标记基团，例如荧光基团，发光基团，酶标记物，放射性标记物等。 效应子或标记基团与抗体的偶联可根据本领域中已知的技术进行。在其他方面，本发明涉及诊断癌(优选前列腺癌)的方法，其中分析体液样品中天然的膜联蛋白A3的存在和/或量。
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优选地，本发明的诊断性方法涉及通过与如上所述的抗体反应来检测天然的膜联蛋白A3，尤其是天然的人膜联蛋白A3。样品优选是体液，例如尿或压出尿。可根据本发明诊断的癌优选是泌尿生殖和/或胃肠道癌，例如前列腺癌，膀胱癌， 肾癌，尿道癌，卵巢癌，子宫癌或结肠癌。尤其是，癌是上皮癌。在尤其优选的实施方式中， 癌是前列腺癌。在优选实施方式中，本发明包括疾病阶段和/或预后评估的差异诊断。例如，本发明允许选自下列的疾病阶段的差异诊断⑴良性病情，尤其是良性前列腺病情，例如良性前列腺增生(BPH)，纤维化及慢性前列腺炎，(ii)恶变前病情，例如各阶段(PIN-1 3)的前列腺上皮内瘤形成，包括高度前列腺上皮内瘤形成(HGPIN)，和/或(iii)恶性病情，例如前列腺癌，尤其是通过Gleason等级评定指定的进展的状态中的晚期前列腺癌。更优选地，本发明允许一方面良性或恶变前病情与另一方面恶性病情之间的差异诊断。在本发明的优选实施方式中，测定样品(其可为体液或组织样品)中天然的ANXA3 的存在，量和/或分布。需知，可对单个组织样品或对不同的样品(例如来自相同的受试者的体液样品及组织样品)测定存在，量及细胞内定位。样品中高量的天然的ANXA3 (例如对应于组织样品的强染色)主要指示良性病情。 中等/低量的天然的ANXA3 (例如对应于组织样品的弱/中等染色)指示恶变前病情或到恶性病情的早期/立即早期阶段。样品中天然的ANXA3的缺乏指示恶性病情，主要指示进展的状态(例如立即或晚期阶段)中的恶性病情。囊泡(例如外来体和/或前列腺小体)中有天然的ANXA3主要指示良性或恶变前病情。这些囊泡可从尿或其他体液通过差异离心得到，因此本发明涉及检测所述体液的任何级分中的天然的ANXA3。而且，本发明的方法可含盖测定针对膜联蛋白A3的自身抗体。有针对ANXA3的自身免疫应答(例如有针对ANXA3的自身抗体)主要指示恶性病情，尤其指示进展的状态中的恶性病情。本发明含盖测定样品中的多肽。优选地，此测定包括免疫学方法，其中所述样品中成分的存在，量和/或定位使用免疫学测试试剂测定。测定样品中天然的ANXA3的试剂优选是特异于天然的ANXA3的抗体，例如如上所述的多克隆或单克隆抗体。用于测定样品中ANXA3自身抗体的试剂优选是包括对于识别重要的特异性表位的ANXA3多肽，或者它们的片段。更优选地，ANXA3多肽是重组ANXA3多肽，再折叠为天然的状态，或从人或其他哺乳动物来源分离的天然的ANXA3。本发明的方法可以适宜于免疫学测定的任何测试形式(包括适宜于自动化的装置的测试形式)进行。在一些测试形式中，可优选使用带标记基团(例如视觉标记物(例如胶乳或金珠)，荧光标记基团，酶促标记基团等)的试剂。可根据标准方法产生试剂和标记基团的缀合物，例如通过用标记基团(例如经双官能间隔物分子)共价偶联于试剂的反应性氨基酸侧基(例如羧基，氨基和/或硫醇基)。优选从人受试者得到样品。在一些实施方式中，方法是非-侵袭性诊断性方法，其中所述样品可为，例如尿样品，尤其是尿样品，压出尿样品或粪便样品。如果需要，可使样品经历预处理过程，例如凝胶过滤。在进一步实施方式中，方法可为组织化学方法，其中所述样品可为组织样品，尤其是活组织检查，例如钻取活组织检查。在组织化学方法中，可通过测定样品中ANXA3的定位进行细胞内或细胞外ANXA3的选择性测定。在优选实施方式中，本发明包括半-定量或定量测定天然的ANXA3。此半-定量或定量测定可涉及基于预定截止值及将评估结果与疾病阶段相关联来评估测试结果。截止值可根据已知的方法通过测定来自健康人和/或处于预定疾病阶段的人的样品中的天然的ANXA3来测定。而且，样品中天然的ANXA3的量也可通过评估染色的组织样品及关联评估结果与疾病阶段来测定。可使样品经历分级分离过程，其使例如在外来体中分开测定天然的ANXA3。例如， 可将样品离心，以便获得细胞沉淀及上清，其中在细胞沉淀中测定细胞内膜联蛋白A3，及在上清中测定细胞外膜联蛋白A3。在尤其优选的实施方式中，方法包括选择性测定细胞外 ANXA3。在其他尤其优选的实施方式中，方法包括选择性测定细胞内ANXA3。本发明的方法可附加地包括测定其他癌标记物，例如癌标记物。其他标记物的测定可在相同的样品(其中测定天然的ANXA;3)或在不同的样品(例如血，血清和/或血浆样品)中进行。尤其优选的是测定血，血清或血浆标记物，尤其激肽释放酶蛋白酶家族的至少一个成员(例如前列腺特异性抗原(PSA))和/或至少一种上皮细胞标记物(尤其是前列腺特异性膜抗原(PSMA))。本发明可为筛选方法，其中测试个体或一组个体的癌，尤其前列腺癌。另一方面， 方法也可包括预后评估或治疗性追踪测试，其中使已诊断癌(尤其前列腺癌或其前体阶段)阳性的个体经历预后评估和/或治疗控制监控。在尤其优选的实施方式中，本发明涉及疾病进展的预后评估，其是在任何诊断性评定(尤其治疗控制)中有价值的工具。预后评估可基于天然的ANXA3单独或与确实与前列腺癌相关的其他标记物(例如PSA，PCA3(Loeb S. Does PCA3 Help Identify Clinically SignificantProstate Cancer ？ Eur Urol. 2008 Jul 16.)， PCADM-I(Ohkia A, HuY, Wang M,Garcia FU,Stearns ME. Clin Cancer Res. 2004 Apr 1 ；10(7) :2452-8. Links Evidence for prostate cancer-associateddiagnostic marker-1 :immunohistochemistry and in situ hybridizationstudies.),EPCA-2(Katz MD,Kibel AS. Words of wisdom. Re :EPCA_2 : a highly specific serum marker for prostate cancer. Eur Urol. 2008 Jan ；53 (1) 210), (Diamandis EP. POINT EPCA-2 :a promisingnew serum biomarker for prostatic carcinoma ？ Clin Biochem. 2007Dec ；40 (18) :1437-9. Epub 2007 Sep 19.), (Leman ES, Cannon GW，Track BJ,Sokoll LJ,Chan DW，Mangold L,Partin AW,GetzenbergRH. EPCA-2 a highly specific serum marker for prostate cancer. Urology. 2007 Apr ；69 (4) 714-20))组合的测定。例如，通过组织评估和/或通过测量PSA或其他癌标记物的水平， 可将患者分类为低风险组(例如PSA水平彡lOng/ml)，立即风险组(例如PSA水平> 10 及< 20ng/ml)及高风险组(例如PSA水平彡20ng/ml)。这些患者组中ANXA3的测定可产生进一步有价值的信息，尤其在已分类为立即风险组的患者中。如果这些立即风险患者是ANXA3阳性，无PSA存活的百分率显著高于已测定为ANXA3阴性的患者。由此，本发明允许个体患者组的其他风险层次。优选地，原初被分类为立即风险组的组中的患者可基于ANXA3 测定结果重分类。ANXA3阳性患者可重分类为在低风险组，及ANXA3-阴性患者(及任选具有针对ANXA3的自身免疫应答)分类为高风险组。而且，将通过以下图及实施例更详细阐述本发明。
实施例将小鼠用重组人膜联蛋白A3免疫。由此，产生单克隆抗体，其能在与多克隆抗血清Petros组合的捕获ELISA中识别天然的膜联蛋白A3(W0Zny W，Schroer K， Schwall GP, Poznanovic s, Stegmannff, Dietz K, Rogatsch H, Schaefer G, Huebl H, Klocker H, Schrattenholz A, Cahill MA. Differential radioactive quantification ofprotein abundance ratios between benign and malignant prostatetissues :cancer association of annexin A3. Proteomics. 2007 Jan ；7 (2) :313-22)。得到的抗体命名如下TGC43 = DSM ACC2970TGC48 = DSM ACC2971TGC42 = DSM ACC2972TGC49 = DSM ACC2973TGC45 = DSM ACC2974TGC46 = DSM ACC2975TGC44 = DSM ACC2976TGC47 = DSM ACC2971.蛋白印迹中结合位点的定位在第一组实验中，在蛋白印迹中用重组膜联蛋白3片段vANAl，vANA4, vANA5, vANA7 及 vANA8 测试杂交瘤细胞 16C12 (TGC42)，14B10 (TGC49)，15D6 (TGC46)，18E9 (TGC43)， 17D9 (TGC48)，17F12 (TGC44)，13H5 (TGC47)及 16A7 (TGC45)的细胞培养上清。膜联蛋白 3 的这些片段代表以重叠片段形式的完整膜联蛋白3 (cf.

图1)。全部抗体上清识别片段vANAl 及，由此，全长膜联蛋白A3蛋白。而且，全部所测抗体检测代表膜联蛋白3的N-端区的片段vANA7(cf.图1)。由此，所测抗体的结合位点在膜联蛋白3的N-端106aa之内。为了进一步定位单克隆抗体的结合位点，就与膜联蛋白3的片段VANA2及VANA3 的反应性测试蛋白印迹中第二组实验的细胞培养上清。vANA3除了 N-端区34aa之外对应于片段vANA2。2种单克隆抗体-17D9 (TGC48)及17F12 (TGC44)-仅识别片段vANA2，其余抗体识别膜联蛋白3片段(图1)。这些实验显示，产生的抗体中有至少2种不同的反应性。 然而，在单克隆抗体17D9(TGC48)及17F12 (TGC44)中，反应性相关于N-端34aa，其余抗体的结合位点在膜联蛋白3序列的氨基酸35和106之间。2.用肽扫描的选定的抗体的表位定位通过肽扫描测定单克隆抗体16C12 (TGC42)，18E9 (TGC43)，17F12 (TGC44)， 14B10 (TGC49)，17D9 (TGC48)的表位以及各抗体上清的表位。[2. 1.抗体 16C12 (TGC42)，18E9 (TGC43)及 14B10 (TGC49)的表位定位
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以未稀释的形式使用单克隆抗体16C12 (TGC42)，18E9 (TGC43)及14B10 (TGC49)的细胞培养上清用于表征它们的表位。这3种抗体在肽扫描中显示相同的结果。肽片段显影的代表性的结果显示于图2。单克隆抗体16C12(TGC42)，18E9(TGC43)及14B10(TGC49)识别肽片段的肽斑点18 20。肽片段显影的分析
权利要求
1.识别天然的膜联蛋白A3的抗体，其针对人膜联蛋白A3的氨基酸序列59 67中的表位EYQAAYGKE(SEQ ID NO :1)，或所述抗体的抗原-结合片段。
2.权利要求1的抗体，其选自 ⑴抗体 TGC42、 TGC43、或 TGC49,( )与来自(i)的抗体具有相同的抗原结合位点的抗体，及 (iii)所述抗体的抗原-结合片段。
3.识别天然的膜联蛋白A3的抗体，其针对人膜联蛋白A3的氨基酸序列1 106中的构象表位，或所述抗体的抗原-结合片段。
4.权利要求3的抗体，其针对人膜联蛋白A3的氨基酸序列1 34中的构象表位，或所述抗体的抗原-结合片段。
5.权利要求3的抗体，其针对人膜联蛋白A3的氨基酸序列35 106中的构象表位，或所述抗体的抗原-结合片段。
6.权利要求的3，4，或5的抗体，其选自 ⑴抗体 TGC44、或 TGC48,( )与来自(i)的抗体具有相同的抗原-结合位点的抗体，及 (iii)所述抗体的抗原-结合片段。
7.识别天然的膜联蛋白A3的抗体，其选自(i)抗体 TGC42，TGC43, TGC44, TGC45, TGC46, TGC47, TGC48 或 TGC49， ( )与来自(i)的抗体具有相同的结合位点的抗体，及(iii)与来自⑴或(ii)的抗体识别天然的人膜联蛋白A3上相同的表位的抗体，及(iv)所述抗体的抗原-结合片段。
8.权利要求1 7中任一项的抗体，其是单克隆抗体，二聚体抗体，人源化抗体，人抗体或重组抗体，或者它们的片段。
9.权利要求1 8中任一项的抗体，其用于医学，特别用于人医学。
10.权利要求9的抗体，其用于诊断或治疗。
11.权利要求9或10中任一项的抗体，其用于诊断癌，特别是前列腺癌。
12.权利要求9，10或11中任一项的抗体，其用于在天然的条件下进行的诊断性测定。
13.权利要求12中任一项的抗体，其用于ELISA。
14.诊断癌的方法，其中分析样品中天然的膜联蛋白A3的存在和/或量。
15.权利要求14的方法，其中所述天然的膜联蛋白A3通过与权利要求1 8中任一项的抗体反应来检测。
16.权利要求14或15的方法，其中所述样品是体液，特别是尿或压出尿。
全文摘要
本发明涉及识别天然的膜联蛋白A3的新抗体。这些抗体适宜于诊断性及治疗性应用。
文档编号G01N33/574GK102164964SQ200980137547
公开日2011年8月24日 申请日期2009年9月25日 优先权日2008年9月26日
发明者G·施瓦尔, S·珀兹纳诺维克 申请人:普罗迪奥塞斯股份公司