专利名称：使用乙酰胆碱酯酶进行农药检测的量热方法
技术领域：
本发明涉及一种使用乙酰胆碱酯酶进行农药快速检测的量热方法，尤其是能够实现热放大的乙酰胆碱酯酶量热分析方法，属农药检测领域。
背景技术：
量热法通过测量生化反应过程的热量变化进行分析，与光学、电化学等方法比较，其通用性强，不受试样自身颜色、浑浊、及电化学等属性的干扰，能够满足实际试样的检测要求，尤其适合现场速测，并且检测原理简单、可靠，有利于微型系统的开发。乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase,AchE)是生物正常神经传导活动所必不可少的，因有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶的正常功能有抑制作用，乙酰胆碱酯酶常用于酶抑制率法检测有机磷酸酯类和氨基甲酸酯类农药残留的存在和超标。虽然出现了许多乙酰胆碱酯酶替代酶源的研究和尝试(刘洋等.农药残留检测用植物酯酶筛选研究.安徽农学通报，2012，18(19):41-43;邓光辉等.用于有机磷农药残留检测酯酶的筛选.环境科学与技术，2010, 12:99-103)，但从实际效果看，替代酶源的灵敏度和特异性较差，容易误报，并且成本低廉的主要原因是其是粗酶，实际提纯后，价格往往会高于工业批量生产的乙酰胆碱酯酶。乙酰胆碱酯酶酶促反应产生的热量较小，检测灵敏度低，量热法检测难度大，商用微量热计灵敏度能满足微小热量变化测量的要求，但稳定时间长(几个小时)，价格高(几十万到上百万人民币)，只能在实验室使用，不适于快速检测和现场使用，难以规模应用。目前，主要使用微量热分析手段对乙酰胆碱酯酶的性质深入研究和了解，这有助于量热法应用。考虑现场速测和规模应用需求，实现基于乙酰胆碱酯酶的农药检测量热方法，采用热放大这一有效手段，酶促反应热可通过连续的酶促反应来提高，最终的热信号是各级酶促反应热的总和，能增强有效热信号强度，提高系统灵敏度、分辨率和选择性。已有专利(徐斐等，适用于量热式农药快速检测的固定化酶的制作方法，ZL 200610147245.2 ;郑艺华等，实现热放大的量热法检测重金属用固定化酶的制作方法，201110150133.3)均应用了热放大原理，但没有涉及乙酰胆碱酯酶或农药残留检测。

发明内容
本发明的目的是克服乙酰胆碱酯酶酶促反应产生的热量较小，用于量热法检测难度大和检测灵敏度低的缺点；实现乙酰胆碱酯酶对有机磷和氨基甲酸酯类农药的高敏感度及量热法适合现场实际试样快速检测的共用优势；提供一种基于乙酰胆碱酯酶的放热量大，易于测量的满足现场速测和规模应用需求的农药检测量热方法。本发明的原理是对有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测采用酶抑制法和级联反应进行，乙酰胆碱酯酶被农药抑制，降低酶促反应速度，产物胆碱的量减少并正比于被抑制的程度，进一步地，胆碱的量可通过胆碱氧化酶和过氧化氢酶的级联反应热量得到，胆碱被胆碱氧化酶催化分解，后者能催化前者催化产生的水解产物-过氧化氢，其反应分别为:
权利要求
1.一种使用乙酰胆碱酯酶进行农药检测的量热方法，其特征在于，采用流动注射固定化酶热分析系统，系统设置第一反应器和第二反应器，第一反应器中放置固定化乙酰胆碱酯酶，第二反应器中放置固定化胆碱氧化酶和过氧化氢酶，系统设置热检测器全程监测第二反应器中的酶促反应热，在一定流量、温度、PH等反应及分析条件下，包括下列步骤: (1)定量、定浓度的反应底物乙酰胆碱溶液注入并流过第一反应器，第一反应器中发生乙酰胆碱酯酶酶促反应，乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸，流出的为含有胆碱的反应产物溶液； (2)取第一反应器的定量反应产物溶液作为第二反应器的反应底物，注入并流过第二反应器，第二反应器中发生胆碱氧化酶和过氧化氢酶级联酶促反应，胆碱氧化酶催化胆碱分解产生过氧化氢，产生的过氧化氢被过氧化氢酶催化，并放出热量； (3)热检测器监测第二反应器的酶促反应热，作为无抑制的系统响应热信号； (4)已处理的样液注入并流过第一反应器，对乙酰胆碱酯酶进行一定时间的抑制，重复步骤(I) (2) (3)得到有抑制的系统响应热信号； (5)农药的检测结果以乙酰胆碱酯酶被农药抑制的程度，按照计算公式:
2.根据权利要求1所述的使用乙酰胆碱酯酶进行农药检测的量热方法，其特征在于，为消除非特异性热和干扰，可以设置与第二反应器同为孪生结构的参考反应器，其中放置固定化胆碱氧化酶和过氧化氢酶的空白载体，进行分析时，底物同时、同量注入并流过第二反应器和参考反应器，热检测器监测第二反应器和参考反应器的热响应信号差，作为系统响应热信号。
3.根据权利要求1所述的使用乙酰胆碱酯酶进行农药检测的量热方法，其特征在于，为简化检测步骤和提高检测速度，可以预先进行步骤(I) (2) (3)得到标准化分析条件下无抑制的系统响应热信号，并作为已知数据，进行检测时，仅需进行步骤(4)，得到标准化分析条件下有抑制的系统响应热信号，与已知的无抑制的系统响应热信号比较，进行步骤(5)，得到相对抑制率。
全文摘要
本发明涉及一种使用乙酰胆碱酯酶进行农药快速检测的量热方法，其技术方案是采用酶抑制法和级联反应进行，乙酰胆碱酯酶被农药抑制，降低酶促反应速度，产物胆碱的量减少并正比于被抑制的程度，进一步地，胆碱的量可通过胆碱氧化酶和过氧化氢酶的级联反应热量得到。本发明利用了级联反应大大提高了原始热信号强度以及检测的灵敏度和分辨率，降低检测限，并有效提高检测的准确度；实现了基于乙酰胆碱酯酶的农药检测量热方法，集合了乙酰胆碱酯酶对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感度高和量热方法不受样品电化学活性物质或颜色、浑浊干扰的优点；方便现场快速检测农药残留，有助于规模化应用。
文档编号G01N25/48GK103196952SQ201310116550
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月7日 优先权日2013年4月7日
发明者郑艺华, 刘君 申请人:青岛大学