专利名称：大曲中香气物质的提取及分析方法
技术领域：
本发明涉及大曲中香气物质的提取及分析方法，属于酿酒技术领域。
背景技术：
大曲是以单一小麦或小麦、大麦和豌豆混合物为原料，经粗粉碎后加水压成砖状曲坯，人工控制在一定的温度、湿度下培育而成的粗酶制剂。它是酿酒发酵的动力，用于蒸馏酒的酿造。目前许多名优白酒就是利用大曲作为酿酒的糖化、发酵剂。在大曲制造过程中微生物的代谢产物和原料的分解产物直接或间接地构成了白酒的风味物质，使白酒具有各种不同的独特的风味。因此大曲还是生香剂。大曲中富含大量香味前驱物质，因此，大曲本身就是一种香味物质的富集物，所谓的曲香正是一种表现。目前，国内对于大曲中的微量挥发性成分也进行了一些研究，多采用顶空固相微萃取方法分析大曲中的挥发性化合物组成和含量，该方法采取毛细萃取头吸附香气物质，·再通过高温解吸附后通过质谱分析香气物质。采用顶空固相微萃取提取香气物质时，与萃取头的种类、萃取剂的选择、样品用量、萃取时间、萃取温度、盐离子浓度等诸多因素相关，控制不好对样品的提取效果影响大；提取的香气物质吸附于萃取头上，只能通过高温解吸附，无法进行稀释或浓缩等操作。此外，含量高的香气物质不一定对大曲香味的整体贡献就大；一些微量挥发性化合物有着较低的阈值，反而有可能是大曲中的特征香气物质。因此本领域需要一种新的方法来提取、分析大曲中的特征香气物质是哪些。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种分析大曲中香气物质的提取方法。本发明的技术方案是大曲中香气物质的提取方法，包括如下步骤粉碎大曲，力口入可溶于水的无机钙盐，加入浓度为40飞0%的乙醇提取，收集上清液，加入水溶性无机盐饱和上清液，用I :广1 3的戊烷和乙醚溶液萃取2飞次，收集萃取液，去离子水洗涤萃取液，利用溶剂辅助萃取香气装置提取香气物质，加入干燥剂处理8 12h，过滤，N2吹扫浓缩，即得到香气物质。进一步的，所述可溶于水的无机钙盐质量为大曲粉质量的O. Γ0. 5%。进一步的，所述可溶于水的无机钙盐为氯化钙。具体的，所述加入浓度为4(Γ60%的乙醇提取包括如下步骤向大曲粉中加入的浓度为40 60%的乙醇，浓度为40 60%的乙醇与大曲粉的质量比为I : 2 I 4，超声震荡l(T50min，500(Tl0000r/min离心l(T30min，取上清液，重复提取2 4次，合并所用上清液，用去离子水将上清液稀释至乙醇浓度为1(Γ15%。进一步的，所述的可溶于水的无机盐为氯化钠或氯化钾。进一步的，所述的干燥剂为无水硫酸钠或氯化钙，干燥剂大曲粉的质量比为I Tl 2。本发明还提供了大曲中香气物质的分析方法，其特征在于包括如下步骤
a、香气物质的提取粉碎大曲，加入可溶于水的无机钙盐，浓度为4(Γ60%的乙醇提取，收集上清液，加入水溶性无机盐饱和上清液，用I :广1 3的戊烷和乙醚溶液萃取2飞次，收集萃取液，去离子水洗涤萃取液，利用溶剂辅助萃取香气装置提取香气物质，加入干燥剂处理8 12h，过滤，N2吹扫浓缩，即得到香气物质；b、频率检测法分析大曲香气物质将步骤a得到的香气物质经气质联用装置分离，记录下每一种香气物质的保留时间；同时由6 10名利用连接到气质联用装置上的闻香装置对被分离的每一种香气物质进行鉴定，记录每种香气物质被闻香员鉴定出来的次数，少于2名闻香员鉴定出来的香气物质视为干扰；C、香气提取稀释法分析大曲香气物质采用乙醚按照I :广1 5的比例稀释提取的香气物质，直至所有的香气物质均无法再嗅闻到，每稀释一次样品通过气质联用装置分离，由闻香员鉴定，香气物质的强度由稀释比例FD值来表示，FD值高的香气物质即为特征香气物质；其中，所述闻香员为步骤b中鉴定出的香气物质最多的闻香员。进一步的，所述的气质联用装置的气相色谱条件如下载气为He,流速lmL/min ； 在250°C下解吸9min ;样品通过弹性石英毛细管柱进行分离，程序升温条件起始温度35 45°C，保持I 3min，以4 8°C /min升温速率升至6(TlO(TC，最后以8 12°C /min升至200^2500C /min保持5 IOmin ;汽化室温度20(T250°C ;不分流。进一步的，所述的气质联用装置的质谱条件如下电子轰击电离离子源，电子能5(Tl00eV，发射电流150 250μΑ，电子倍增器电压30(T400V，离子源温度150 25(TC，接口温度20(T300°C，质量范围33 450u，扫描速度O. Γθ. 5s/scan。优选的，所述步骤a中可溶于水的无机钙盐质量为大曲粉质量的O. Γ0. 5%。优选的，所述步骤a中可溶于水的无机钙盐为氯化钙。优选的，所述步骤a中浓度为4(Γ60%的乙醇提取包括如下步骤向大曲粉中加入的浓度为4(Γ60%的乙醇，浓度为40 60%的乙醇与大曲粉的质量比为I : 2 I 4，超声震荡l(T50min，500(Tl0000r/min离心l(T30min，取上清液，重复提取2 4次，合并所用上清液，用去离子水将上清液稀释至乙醇浓度为1(Γ15%。优选的，所述步骤a中水溶性无机盐为氯化钠或氯化钾。优选的，所述步骤a中干燥剂大曲粉的质量比为I :广1 2，干燥剂为无水硫酸钠或氯化钙。本发明的有益效果在于本发明大曲中香气物质的提取方法提取的香气物质无需解吸附即可用于后续分析，也可以进行稀释等操作，用于进行后续分析等。因此，给大曲中香气物质的提取提供了新的选择。本发明的大曲中香气物质的分析方法能够准确高效的分析出大曲中的特征香气物质。通过对特征香气物质的了解,可以更好地了解大曲品质,有助于更好地指导酿酒生产，填补了酿酒领域的技术空白。本发明方法通过将香气物质的提取方法与分析方法相配合，实现对大曲中特征香气物质的分析鉴定。


图I频率检测法分析中温大曲中特征香气成分图2香气提取稀释法分析中温大曲中特征香气成分图3频率检测法分析高温大曲中特征香气成分
图4香气提取稀释法分析高温大曲中特征香气成分
具体实施例方式本发明大曲中香气物质的提取方法，包括如下步骤粉碎大曲，加入可溶于水的无机钙盐，加入浓度为40飞0%的乙醇提取，收集上清液，加入水溶性无机盐饱和上清液，用1 1~l 3的戊烷和乙醚溶液萃取2飞次，收集萃取液，去离子水洗涤萃取液，利用溶剂辅助萃取香气装置提取香气物质，加入干燥剂处理8 12h，过滤，N2吹扫浓缩，即得到香气物质。进一步的，所述可溶于水的无机钙盐质量为大曲粉质量的O. Γ0. 5%。进一步的，所述可溶于水的无机钙盐为氯化钙。具体的，所述加入浓度为4(Γ60%的乙醇提取包括如下步骤向大曲粉中加入的浓度为40 60%的乙醇，浓度为40 60%的乙醇与大曲粉的质量比为I : 2 I 4，超声震荡l(T50min，500(Tl0000r/min离心l(T30min，取上清液，重复提取2 4次，合并所用上清液，用去离子水将上清液稀释至乙醇浓度为1(Γ15%。进一步的，所述的可溶于水的无机盐为氯化钠或氯化钾。进一步的，所述的干燥剂为无水硫酸钠或氯化钙，干燥剂大曲粉的质量比为I Tl 2。本发明还提供了大曲中香气物质的分析方法，其特征在于包括如下步骤a、香气物质的提取粉碎大曲，加入可溶于水的无机钙盐，浓度为4(Γ60%的乙醇提取，收集上清液，加入水溶性无机盐饱和上清液，用I :广1 3的戊烷和乙醚溶液萃取2飞次，收集萃取液，去离子水洗涤萃取液，利用溶剂辅助萃取香气装置提取香气物质，加入干燥剂处理8 12h，过滤，N2吹扫浓缩，即得到香气物质；b、频率检测法分析大曲香气物质将步骤a得到的香气物质经气质联用装置分离，记录下每一种香气物质的保留时间；同时由6 10名利用连接到气质联用装置上的闻香装置对被分离的每一种香气物质进行鉴定，记录每种香气物质被闻香员鉴定出来的次数，少于2名闻香员鉴定出来的香气物质视为干扰；C、香气提取稀释法分析大曲香气物质采用乙醚按照I :广1 5的比例稀释提取的香气物质，直至所有的香气物质均无法再嗅闻到，每稀释一次样品通过气质联用装置分离，由闻香员鉴定，香气物质的强度由稀释比例FD值来表示，FD值高的香气物质即为特征香气物质；其中，所述闻香员为步骤b中鉴定出的香气物质最多的闻香员。进一步的,所述的气质联用装置的气相色谱条件如下载气为He,流速lmL/min ；在250°C下解吸9min ;样品通过弹性石英毛细管柱进行分离，程序升温条件起始温度35 45°C，保持I 3min，以4 8°C /min升温速率升至6(TlO(TC，最后以8 12°C /min升至200^2500C /min保持5 IOmin ;汽化室温度20(T250°C ;不分流。进一步的，所述的气质联用装置的质谱条件如下电子轰击电离离子源，电子能5(Tl00eV，发射电流150 250μΑ，电子倍增器电压30(T400V，离子源温度150 25(TC，接口温度20(T300°C，质量范围33 450u，扫描速度O. Γθ. 5s/scan。优选的，所述步骤a中可溶于水的无机钙盐质量为大曲粉质量的O. Γ0. 5%。优选的，所述步骤a中可溶于水的无机钙盐为氯化钙。
优选的，所述步骤a中浓度为4(Γ60%的乙醇提取包括如下步骤向大曲粉中加入的浓度为4(Γ60%的乙醇，浓度为40 60%的乙醇与大曲粉的质量比为I : 2 I 4，超声震荡l(T50min，500(Tl0000r/min离心l(T30min，取上清液，重复提取2 4次，合并所用上清液，用去离子水将上清液稀释至乙醇浓度为1(Γ15%。优选的，所述步骤a中水溶性无机盐为氯化钠或氯化钾。优选的，所述步骤a中干燥剂大曲粉的质量比为I :广1 2，干燥剂为无水硫酸钠或氯化钙。本发明中，大曲是由粮食经发酵得到，含有丰富的糖化酶、酯化酶等，为了防止酶对提取效果的影响，向大曲粉中加入可溶水的无机钙盐用以抑制酶活。进一步的研究显示，可溶于水的无机钙盐质量为大曲粉质量的O. Γ0. 5%时，抑制效果好，同时不会对后续香气物质的提取效果产生影响。氯化钙为较为常用的试剂，易于获得，同时对酶活的抑制效果也较好，因此优选使用氯化钙。
本发明中，4(Γ60%的乙醇用来溶解大曲中含有的香气物质，经超声震荡使香气物质充分溶解，离心取上清液进行后续操作。重复提取2 4次，可以使香气物质被充分的提取。乙醇浓度太低会影响提取效率，浓度高有利于提高提取效率。但发明人经试验发现，乙醇浓度达到4(Γ60%即可满足条件，更高的浓度乙醇对提取效率影响不大，反而会造成浪费，增加成本。由于在提取过程中乙醇浓度较高，为了不影响后期利用溶剂辅助萃取香气装置对香气物质的提取，发明人经试验发现，用去离子水将上清液稀释至乙醇浓度为1(Γ15%即对后续提取效果影响较小。向乙醇提取液中加入可溶于水的无机盐使提取液饱和，从而让香气物质析出。发明人经过多次实验发现香气物质在戊烷乙醚(I Γ1 3)中溶解性最好，经多次萃取，可让香气物质的收集更为充分。萃取液经溶剂辅助萃取香气装置处理以达到浓缩萃取液中香气物质的目的，加入干燥剂(优选无水硫酸钠或氯化钙)的主要作用是干燥，除去有机溶剂、水，具有效果快、残留少等优点。发明人通过进一步的研究发现干燥剂的用量以干燥齐U :大曲粉的质量比为I :广1 2为最佳，既不会造成原料浪费，也不会影响干燥效果。由于香气物质的浓度往往比较低，而且提取的时候多用有机溶剂，一般将提取的溶液进行吹干浓缩，本发明中优选采用氮气吹扫以达到浓缩的目的。顶空固相微萃取得到的香气物质是吸附于萃取头上，无法进一步的进行稀释分析，而本发明方法的提取的香气物质溶于溶液中，可以进一步稀释，为后续的操作提供方便。本发明中将单独购买的闻香装置连接到气质联用装置(气质联用装置上带有闻香装置的接入接口)上，在采用频率检测法和香气提取稀释法分析香气物质时，香气物质经气质联用装置分离后被分为两部分，一部分进行定性分析，一部分通过闻香装置提供给闻香员鉴定。在本发明中，频率检测法分析香味物质时鉴定出最多香气物质的闻香员，其对香味物质的气味最为敏感，因此在香气提取稀释法分析时采用该闻香员。在香气提取稀释法分析时，稀释比例太小则会增加工作量，稀释比例太大则使得分析的准确性降低。本发明中的闻香员是经过专业培训，在香味物质的鉴定方面具有丰富的经验。本发明中，保留值(retention index)是柯瓦(Kovats)于1958年所提出的,所以又称柯瓦指数。它表示物质在固定液上的保留值行为，是目前使用最广泛并被国际上公认的定性指针。它具有重现性好、标准统一及温度系数小等优点。保留指数的物理意义在于它是与被测物质具有相同调整保留时间的假想的正构烷烃的碳数乘以100。保留值没有单位，是一个与正构烷烃有关的相对值。气质联用分离到的化合物的定性分析采用如方式进行与标准已知化合物比对确认；利用直链烷烃C6-C26计算化合物的保留值，通过与文献报道中的保留值对化合物进行鉴定；未知化合物与NIST谱库和Wiley谱库(NIST谱库和Wiley谱库为气质联用仪器中带有的数据库)比对，只有当正反匹配度均大于800 (最大值为1000)的鉴定结果才予以确认,无法确认的即为未知化合物。实施例I采用本发明方法分析中温大曲中的特征香气物质取IOg粉碎的中温大曲粉加入O. Ig氯化钙抑制酶活，放入50mL离心管，加入15mL50%乙醇溶液浸泡，超声震荡30min，10000r/min离心IOmin提取上清液，重复提取两次。将所有的提取液用去离子水稀释至14%，稀释样品转入分液漏斗，加入氯化钠饱和，用1:1戊烷和乙醚溶液60mL萃取三次，用30mL去离子水洗涤萃取液，利用溶剂辅助萃取香气装置(Glasblaserei Bahr,德国)提取香气物质，提取物加入5g无水硫酸钠过夜,过滤后用N2吹扫至250 μ L0经气质联用仪器分离，分离条件载气为He,流速lmL/min ;在250°C下解吸9min ;样品通过DB-WAX弹性石英毛细管柱(30mX0. 25mmXO. 25 μ m,美国Supelco公司生产)进行分离，程序升温条件起始温度40°C，保持3min，以5°C /min升温速率升至80°C，最后以10°C /min升至230°C /min保持7min ;汽化室温度250°C ;不分流。质谱条件电子轰击电离(EI)离子源，电子能70eV，发射电流200μΑ，电子倍增器电压350V，离子源温度2000C，接口温度250°C，质量范围33 450u，扫描速度O. 2s/scan。8名闻香员分别单独利用气质联用闻香装置(德国Gerstel 0DP2嗅觉检测器)闻香，记录下每种香气物质的嗅闻时间，感官描述，描述人数少于2人的香气物质视为干扰，记录结果见表I和图I。采用乙醚按照I : 3的比例稀释提取的香气物质溶液，直至所有的香气物质均无法再嗅闻到，每稀释一次样品通过气质联用装置闻香，由频率检测法中问出香味最多的闻香员嗅闻，香气物质的强度由稀释比例FD值来表示，结果见表I和图2。结果显示，中温大曲中的特征香气物质为正己醛、未知化合物u2、苯乙醛、4-乙基愈创木酚、未知化合物u5、I-辛烯-3-醇、庚醇、3-甲基丁醇、壬醛、2，6-二甲基吡嗪，其它挥发性化合物作为背景香气物质存在。表I中温大曲中特征香气物质
权利要求
1.大曲中香气物质的提取方法，其特征在于包括如下步骤粉碎大曲，加入可溶于水的无机钙盐，加入浓度为4(Γ60%的乙醇提取，收集上清液，加入水溶性无机盐饱和上清液，用I :广1 : 3的戊烷和乙醚溶液萃取2飞次，收集萃取液，去离子水洗涤萃取液，利用溶剂辅助萃取香气装置提取香气物质，加入干燥剂处理8 12h，过滤，N2吹扫浓缩，即得到香气物质。
2.根据权利要求I所述的大曲中香气物质的提取方法，其特征在于所述可溶于水的无机I丐盐质量为大曲粉质量的O. I "O. 5%。
3.根据权利要求I或2所述的大曲中香气物质的提取方法，其特征在于所述可溶于水的无机钙盐为氯化钙。
4.根据权利要求3所述的大曲中香气物质的提取方法，其特征在于所述加入浓度为40 60%的乙醇提取包括如下步骤向大曲粉中加入的浓度为40 60%的乙醇，浓度为40 60%的乙醇与大曲粉的质量比为I 2 I 4，超声震荡l(T50min，500(Tl0000r/min离心l(T30min，取上清液，重复提取2 4次，合并所用上清液，用去离子水将上清液稀释至乙醇浓度为10 15%。
5.根据权利要求3或4所述的大曲中香气物质的提取方法，其特征在于所述的可溶于水的无机盐为氯化钠或氯化钾。
6.根据权利要求5所述的大曲中香气物质的提取方法，其特征在于所述的干燥剂为无水硫酸钠或氯化钙，干燥剂大曲粉的质量比为I :广1 2。
7.大曲中香气物质的分析方法，其特征在于包括如下步骤 a、香气物质的提取粉碎大曲，加入可溶于水的无机钙盐，浓度为4(Γ60%的乙醇提取，收集上清液，加入水溶性无机盐饱和上清液，用I :广1 : 3的戊烷和乙醚溶液萃取2飞次，收集萃取液，去离子水洗涤萃取液，利用溶剂辅助萃取香气装置提取香气物质，加入干燥剂处理8 12h，过滤，N2吹扫浓缩，即得到香气物质； b、频率检测法分析大曲香气物质将步骤a得到的香气物质经气质联用装置分离，记录下每一种香气物质的保留时间；同时由6 10名利用连接到气质联用装置上的闻香装置对被分离的每一种香气物质进行鉴定，记录每种香气物质被闻香员鉴定出来的次数，少于2名闻香员鉴定出来的香气物质视为干扰； C、香气提取稀释法分析大曲香气物质采用乙醚按照I :广1 5的比例稀释提取的香气物质，直至所有的香气物质均无法再嗅闻到，每稀释一次样品通过气质联用装置分离，由闻香员鉴定，香气物质的强度由稀释比例FD值来表示，FD值高的香气物质即为特征香气物质；其中，所述闻香员为步骤b中鉴定出的香气物质最多的闻香员。
8.根据权利要求7所述的大曲中香气物质的分析方法，其特征在于气质联用装置的气相色谱条件如下载气为He,流速lmL/min ;在250°C下解吸9min ;样品通过弹性石英毛细管柱进行分离，程序升温条件起始温度35 45°C，保持f 3min，以4 8°C /min升温速率升至6(Tl00°C，最后以8 12°C /min升至20(T250°C /min保持5 IOmin ;汽化室温度200^250 0C ;不分流。
9.根据权利要求8或9所述的大曲中香气物质的分析方法，其特征在于气质联用装置的质谱条件如下电子轰击电离离子源，电子能5(Tl00eV，发射电流15(Γ250μ A，电子倍增器电压30(T400V，离子源温度15(T250°C，接口温度20(T30(TC，质量范围33 450u，扫描速度0.1~0.5s/scan。
全文摘要
本发明涉及大曲中香气物质的提取及分析方法，属于酿酒技术领域。本发明要解决的技术问题是提供一种分析大曲中香气物质的提取方法。本发明的技术方案是大曲中香气物质的提取方法。本发明还提供了大曲中香气物质的分析方法，包括如下步骤a、香气物质的提取；b、频率检测法分析大曲香气物质；c、香气提取稀释法分析大曲香气物质。本发明的大曲中香气物质的提取及分析方法能准确、可靠的提取大曲中的香气物质，并能分析大曲中的特征香气物质，有助于更好地了解大曲品质。
文档编号G01N30/02GK102928536SQ20121043051
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者沈才萍, 张春林, 邬捷峰, 陶文沂, 王小军, 涂荣坤, 杨平, 敖宗华, 任剑波 申请人:泸州品创科技有限公司