专利名称：一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法
技术领域：
本发明属于实验样品处理技术领域，涉及一种昆虫触角的样品处理方法，尤其涉及一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法。
背景技术：
商业化透射电子显微镜自1980年代末普遍进入市场以来，在生命科学领域发挥了极大作用。常规透射电镜制样技术也已经非常成熟。然而，在研究组织致密、骨化程度较高的生物样品——比如昆虫触角时，仍然存在一定的技术瓶颈。昆虫的触角上分布有大量的感觉器，是昆虫非常重要的感觉器官，在昆虫寻找配偶和寄主植物、躲避敌害等重要生态学行为中起着关键作用。研究昆虫触角的超微结构，对于从更深层次上理解昆虫的感觉机制和生态行为具有重要意义。因此，近年来，利用透射电镜技术研究昆虫触角超微结构的报道日益广泛。昆虫的触角表皮是其体壁的一部分。昆虫的体壁是其最外层组织，由单一细胞层及其分泌物组成，其中包括致密的蜡层、护蜡层、经过鞣化的含骨蛋白层等，是昆虫的保护性屏障，既能防止昆虫体内水分的蒸发，又能防止外来物质的入侵。因此，昆虫触角表皮硬化程度较高，组织致密，在对其进行常规透射电镜技术制样时，固定液和包埋剂常难以充分浸透样品组织，从而使得触角内部结构得不到快速有效地固定，在透射样品切片中产生许多空白区域；而包埋剂不能充分浸透样品使得树脂与样品在包埋块聚合时容易脱开、错位、产生缝隙，从而使样品在切片捞片、染色、漂洗过程中容易皱折、破损、甚至是整块丢失。另夕卜，用包埋板作为Spon树脂的包埋模具，非常利于昆虫触角的整姿操作，有利于后续样品的切片工作，但由于Spon树脂粘性较大，在用以包埋骨化程度较高的昆虫触角时，更加不易浸透，同时昆虫触角的脆弱部位(如刺芒状触角的鞭节)在粘性大的包埋剂中非常容易遗失。而Spurr流动性较好,更适于包埋昆虫触角，但Spurr树脂曬氧,常规实验中常用0.5ml离心管作为其包埋模具，而昆虫触角在0.5ml离心管中的整姿操作非常难于进行。另外，固定剂漂洗不干净，导致锇算与醛类固定剂或醇类脱水剂发生氧化还原反应，产生沉淀，影响样品切片的美观和观察。固定和浸透困难是应用透射电镜技术研究致密组织及骨化程度较高的生物样品时普遍存在的技术问题，这在研究昆虫触角超微结构时尤为突出。在对昆虫触角进行透射处理时，包埋剂的选择和使用也存在一些问题。因此，我们对常规透射制样技术进行了改进，以使昆虫触角超微结构得到更好地呈现，解决了 Spon和Spurr包埋剂在包埋昆虫触角时所出现的问题。同时也对解决该技术在应用于其他研究领域时所出现的类似问题提供一定的参考。

发明内容
本发明针对现有技术中的缺陷，目的是提供一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，通过使用新型固定液、低温解剖、抽真空前针插样品浸入固定液以及低温手动抽真空，使昆虫触角内部超微结构得到了有效固定和保存。通过使用新型缓冲液及在脱色摇床进行脱色，使对固定剂的漂洗更加彻底。通过梯度浸透及采用浸透过程在脱色摇床进行，使包埋剂更加充分渗入样品，尤其解决了粘性较大的Spon树脂不易浸透样品的问题；通过配制新型包埋剂，使包埋剂硬度与样品硬度更加接近，使得包埋剂与样品聚合良好。此外，对前固定后的漂洗和低浓度乙醇溶液脱水也采用低温进行，固定、漂洗、脱水、浸透过程均在脱色摇床进行，尽力减小了样品成分在处理过程中的降解和变形，有利于细胞结构的保存。采用包埋板作为包埋模具，更利于样品的整姿和后续切片，Spurr聚合的时的密封处理解决了Spurr树脂噬氧的问题。本发明解决了在对昆虫触角进行透射电镜样品处理过程中，固定液浸透困难、包埋剂浸透不充分、固定剂漂洗不干净、样品整姿困难、样品包埋块不方便后续切片以及染色沉淀的产生的问题。为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决:一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，依次由下述步骤组成，A.固定液的配制:在含多聚甲醛及戊二醛的PBS缓冲液中，加入蔗糖，4°C保存，其中PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液；B.各种包埋剂的配制:(I)SPI — Pon 812 包埋剂的配制:将 SPI _Pon812、DDSA、NMA 和 DMP - 30，逐样加入烧杯中，用磁力搅拌器搅动均匀，当四种成分全加入后，用铝箔纸密封烧杯口，继续搅动约I小时，去掉铝箔纸，用真空干燥器将包埋剂中的气泡抽出，并在干燥器中静置片刻待气泡完全消失，将配制好的包埋剂转移入干燥的离心管或密封的注射器中，密封在放有硅胶干燥剂的塑料袋中，-20°C保存，使用时提前拿出，待恢复至室温即可使用，其中SP1- Pon812为环氧树脂，DDSA为2-十二烯基丁二酸酐，NMA为甲基纳迪克酸酐，DMP-30为2-4-6-三(二甲氨基甲基)苯酚；(2) Spurr (4221)包埋剂的配制:将 ERL 4221、DER 736、NSA 和 DMAE，逐样加入烧杯中，用磁力搅拌器搅动均匀，当四种成分全加入后，用铝箔纸密封烧杯口，继续搅动约I小时，去掉铝箔纸，用真空干燥器将包埋剂中的气泡抽出，并在干燥器中静置片刻待气泡完全消失，将配制好的包埋剂转移入干燥的离心管或密封的注射器中，密封在放有硅胶干燥剂的塑料袋中，_20°C保存，使用时提前拿出，待恢复至室温即可使用，其中ERL 4221为环氧树脂，DER 736为聚乙二醇环氧树脂，NSA为壬烯基琥珀酸酐，DMAE为二甲乙醇胺；C.解剖、固定和漂洗:取昆虫成虫，放入盛有固定液的瓶子中，在固定液中将昆虫成虫杀死，在固定液中解剖下昆虫头部，放入盛有固定液的另一个瓶子中，用橡胶皮塞将盛有样品的瓶子密封好，用注射器手动对样品进行抽真空操作，直至样品完全下沉，将瓶子里的样品转移到装有新鲜固定液的离心管中，前固定，前漂洗，再用锇酸溶液进行后固定，后漂洗；D.脱水和浸透:用梯度乙醇溶液及环氧丙烷对漂洗好的样品进行脱水处理，再用环氧丙烷和包埋剂的混合液对样品进行梯度浸透，然后换管，用包埋剂浸透样品；E.聚合:将样品表面的树脂吸净，放入包埋板上盛有包埋剂的包埋孔中，再进行整姿处理，将包埋板放入烘箱中加热使包埋剂聚合，样品处理完成。作为优选，步骤A中的固定液的配制，在含2% (质量分数)多聚甲醛及2.5% (质量分数)戊二醛的0.lmol/L PBS缓冲液(pH7.4)中，加入5% (质量分数)蔗糖，4°C保存，其中磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液。作为优选，步骤A中的固定液的配制，加入5% (质量分数)蔗糖后，还要加入1%单宁酸，4°C保存。作为优选，步骤B中的(I) SPI — PonTM 812包埋剂的配制:SP1- Pon812、DDSA、NMA和DMP - 30按重量份数分别加入10份、2.2份、8份和0.3份。作为优选，步骤B中的(2)Spurr(4221)包埋剂的配制:ERL 422UDER 736、NSA和DMAE按重量份数分别加入5份、2.7份、12份和0.18份。作为优选，步骤C中，在体视显微镜下解剖下昆虫头部，用解剖针插入头部，使头部能够完全浸入固定液，解剖完毕，用橡胶皮塞将盛有样品的瓶子密封，所有解剖器械均需遇冷，解剖过程保持瓶子里的固定液密封，减少其挥发。 作为优选，步骤C中的注射器包括针号X针管长度为6 X 30的注射器针头及50ml注射器针筒，抽真空过程中需不时慢慢打开橡皮塞，且轻轻摇动瓶子，使喷出的样品回到固定液中，继续抽真空，直至样品完全下沉。作为优选，步骤C中，将瓶子里的样品转移到装有固定液的离心管中，放在脱色摇床上固定，在O 4°C条件下前固定2 4小时，用磷酸缓冲液前漂洗I 10次，每次10 20min,再用锇酸溶液后固定,再用磷酸缓冲液后漂洗I 10次,每次10 20min。作为优选，步骤C中，解剖及抽真空在冰上进行，前固定及前漂洗在O 4°C层析柜进行，后固定及后漂洗在室温进行，前固定、前漂洗、后固定及后漂洗均在脱色摇床进行。作为优选，步骤D中，依次用50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理10 20min,再用99.9%的乙醇处理15 25min,用环氧丙烧对样品进行过渡处理3次，每次5 15min，再用体积比为3:1、2:1、1:1、1:2和1:3的环氧丙烷和包埋剂的混合液对样品进行梯度浸透，依次处理样品30min、45min、lh、l.5h和3h,然后换管，用包埋剂处理样品24h，用50%和70%的乙醇溶液脱水时在O 4°C层析柜进行，用80%、90%、95%和99.9%的乙醇溶液处理时均在室温进行，脱水和浸透过程均在脱色摇床进行。本发明公开了一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，通过使用新型固定液、低温解剖、抽真空前针插样品浸入固定液以及低温手动抽真空，使昆虫触角内部超微结构得到了有效固定和保存。通过使用新型缓冲液，使对醛类固定剂的漂洗更彻底。通过梯度浸透及采用浸透过程在脱色摇床进行，使包埋剂更加充分渗入样品，尤其解决了粘性较大的Spon树脂不易浸透样品的问题；通过配制新型包埋剂，使包埋剂硬度与样品硬度更加接近，使得包埋剂与样品聚合良好。解决了在对昆虫触角进行透射处理过程中，固定液浸透困难、包埋剂浸透不充分的问题。此外，对前固定后的漂洗和低浓度乙醇溶液脱水也采用低温进行，固定、漂洗、脱水、浸透过程均在脱色摇床进行，尽力减小了样品成分在处理过程中的降解和变形，有利于细胞结构的保存。通过使用新型缓冲液及在脱色摇床进行脱色，使对固定剂的漂洗更加彻底，减少了染色沉淀的产生。采用包埋板作为包埋模具，更利于样品的整姿和后续切片，Spurr聚合时的密封处理解决了 Spurr树脂曬氧的问题。本发明的一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，可以使最后得到的样品切片比较平整，样品皱折、破损、丢失现象大大减少，样品切片内部结构均得到有效固定，亚细胞结构清晰可现，前固定液中加入单宁酸的昆虫触角样品细胞膜轮廓特别清晰。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1固定液的配制:在含多聚甲醛及戊二醛的PBS缓冲液中，加入蔗糖，4°C保存，其中PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液；在含2% (质量分数)多聚甲醛及2.5% (质量分数)戊二醛的0.lmol/L PBS缓冲液(pH 7.4)中，加入5% (质量分数)蔗糖，4°C保存，其中磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液。具体配比如下:0.2mol/L PBS缓冲液(pH 7.4) 50ml、25%(质量分数)戊二醛10ml、10% (质量分数)多聚甲醛20ml、由纯水仪制备的超纯水20ml和蔗糖5g，经搅拌混合制得，并在4°C条件下保存。实施例2固定液的配制:在含多聚甲醛及戊二醛的PBS缓冲液中，加入蔗糖，4°C保存，其中PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液；在含2% (质量分数)多聚甲醛及2.5% (质量分数)戊二醛的0.lmol/L PBS缓冲液(pH 7.4)中，加入5% (质量分数)蔗糖，4°C保存，其中磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液。加入5% (质量分数)蔗糖后，还要加入1%单宁酸，4°C保存。具体配比如下:0.2mol/L PBS缓冲液(pH 7.4) 50ml、25%(质量分数)戊二醛10ml、10% (质量分数)多聚甲醛20ml、由纯水仪制备的超纯水20ml、蔗糖5g和单宁酸lg，经搅拌混合制得，并在4°C条件下保存。实施例3一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，依次由下述步骤组成，A.固定液的配制:在含多聚甲醛及戊二醛的PBS缓冲液中，加入蔗糖，4°C保存，其中PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液；B.各种包埋剂的配制:(I)SPI — Pon 812 包埋剂的配制:将 SPI _Pon812、DDSA、NMA 和 DMP - 30，逐样加入烧杯中，用磁力搅拌器搅动均匀，当四种成分全加入后，用铝箔纸密封烧杯口，继续搅动约I小时，去掉铝箔纸，用真空干燥器将包埋剂中的气泡抽出，并在干燥器中静置片刻待气泡完全消失，将配制好的包埋剂转移入干燥的离心管或密封的注射器中，密封在放有硅胶干燥剂的塑料袋中，-20°C保存，使用时提前拿出，待恢复至室温即可使用，其中SP1- Pon812为环氧树脂，DDSA为2-十二烯基丁二酸酐，NMA为甲基纳迪克酸酐，DMP-30为2-4-6-三(二甲氨基甲基)苯酚；(2) Spurr (4221)包埋剂的配制:将 ERL 4221、DER 736、NSA 和 DMAE，逐样加入烧杯中，用磁力搅拌器搅动均匀，当四种成分全加入后，用铝箔纸密封烧杯口，继续搅动约I小时，去掉铝箔纸，用真空干燥器将包埋剂中的气泡抽出，并在干燥器中静置片刻待气泡完全消失，将配制好的包埋剂转移入干燥的离心管或密封的注射器中，密封在放有硅胶干燥剂的塑料袋中，_20°C保存，使用时提前拿出，待恢复至室温即可使用，其中ERL 4221为环氧树脂，DER 736为聚乙二醇环氧树脂，NSA为壬烯基琥珀酸酐，DMAE为二甲乙醇胺；C.解剖、固定和漂洗:取昆虫成虫，放入盛有固定液的瓶子中，在固定液中将昆虫成虫杀死，在固定液中解剖下昆虫头部，放入盛有固定液的另一个瓶子中，用橡胶皮塞将盛有样品的瓶子密封好，用注射器手动对样品进行抽真空操作，直至样品完全下沉，将瓶子里的样品转移到装有新鲜固定液的离心管中，前固定，前漂洗，再用锇酸溶液进行后固定，后漂洗；D.脱水和浸透:用梯度乙醇溶液及环氧丙烷对漂洗好的样品进行脱水处理，再用环氧丙烷和包埋剂的混合液对样品进行梯度浸透，然后换管，用包埋剂浸透样品；E.聚合:将样品表面的树脂吸净，放入包埋板上盛有包埋剂的包埋孔中，再进行整姿处理，将包埋板放入烘箱中加热使包埋剂聚合，样品处理完成。步骤A中的固定液的配制，在含2% (质量分数)多聚甲醛及2.5% (质量分数)戊二醛的0.lmol/L PBS缓冲液(pH 7.4)中，加入5% (质量分数)蔗糖，4°C保存，其中磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液。步骤A中的固定液的配制，加入5% (质量分数)蔗糖后，还要加入1%单宁酸，4°C保存。步骤B 中的(I) SPI — PonTM 812 包埋剂的配制:SP1- Pon812、DDSA、NMA 和DMP - 30按重量份数分别加入10份、2.2份、8份和0.3份。步骤B 中的(2)Spurr(4221)包埋剂的配制:ERL 422UDER 736、NSA 和 DMAE 按重量份数分别加入5份、2.7份、12份和0.18份。步骤C中，步骤C中，在体视显微镜下解剖下昆虫头部，用解剖针插入头部，使头部能够完全浸入固定液，解剖完毕，用橡胶皮塞将盛有样品的瓶子密封，所有解剖器械均需遇冷，解剖过程保持瓶子里的固定液密封，减少其挥发。 步骤C中的注射器包括针号X针管长度为6 X 30的注射器针头及50ml注射器针筒，抽真空过程中需不时慢慢打开橡皮塞，且轻轻摇动瓶子，使喷出的样品回到固定液中，继续抽真空,直至样品完全下沉。步骤C中，将瓶子里的样品转移到装有固定液的离心管中，放在脱色摇床上固定，在O 4°C条件下前固定2 4小时，用磷酸缓冲液前漂洗I 10次，每次10 20min，再用锇酸溶液后固定，再用磷酸缓冲液后漂洗I 10次，每次10 20min。步骤C中，解剖及抽真空在冰上进行，前固定及前漂洗在O 4°C层析柜进行，后固定及后漂洗在室温进行，前固定、前漂洗、后固定及后漂洗均在脱色摇床进行。步骤D中，依次用50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理10 20min，再用99.9%的乙醇处理15 25min，用环氧丙烷对样品进行过渡处理3次，每次5 15min，再用体积比为3:1、2:1、1:1、1:2和1:3的环氧丙烷和包埋剂的混合液对样品进行梯度浸透，依次处理样品30min、45min、lh、l.5h和3h，然后换管，用包埋剂处理样品24h，用50%和70%的乙醇溶液脱水时在O 4°C层析柜进行，用80%、90%、95%和99.9%的乙醇溶液处理时均在室温进行，脱水和浸透过程均在脱色摇床进行。具体操作如下:将准备好的样品，转移至盛有新鲜的固定液的5ml离心管中，置于离心管架上，放入O 4°C层析柜中低速上下摆动的脱色摇床上，低温固定3h。倒掉固定液，用含5 % (质量分数)蔗糖的0.1M PBS (pH7.4)漂洗样品三次，每次15min，在O 4°C层析柜中脱色摇床进行，其中0.1M PBS是指0.lmol/L pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。将样品转移至室温，在通风橱中用0.2MPBS(pH7.4)将2% (质量分数)锇酸溶液稀释为1%，并用1%的锇酸溶液固定样品2h，室温通风橱脱色摇床进行。用0.1M PBS漂洗样品三次，每次15min，最后一次漂洗需换管，室温通风橱脱色摇床进行。用50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min,再用99.9%的乙醇处理20min,最后用环氧丙烧过渡处理3次，每次lOmin。脱水处理均在脱色摇床进行，低浓度乙醇处理时在O 4°C层析柜进行，样品可在70%乙醇中于冰箱4°C保存，从80%乙醇处理开始所有的操作均在室温进行。脱水后，用体积比为3:1、2:1、1: 1、1:2和1:3的环氧丙烷与包埋剂的混合液对样品进行梯度浸透，依次处理样品30min、45min、lh、1.5h和3h，然后换管，用包埋剂处理样品24h，均在室温脱色摇床进行。在样品处理过程中，一定要注意:更换溶液动作要快，尤其不要让样品离开溶液的浸泡，在换液时可采用留存少量液体，多加处理液，在关键步骤如环氧丙烷脱水时增加换液次数等，来保证样品脱水充分。将包埋剂置于20孔平面型包埋板的包埋孔中，用解剖镊将浸透好的样品从包埋剂中取出，先在滤纸上吸去样品表面存留的包埋剂，然后放入包埋板上盛有包埋剂的包埋孔中，在体视显微镜下用I号昆虫针做成的解剖针对样品进行调整，使要切片观察的部位处于包埋孔最顶端位置。整姿时应该在尽量接近烘箱的位置，样品整姿后，马上将其轻轻放入烘箱中，加热使包埋剂聚合。若使用Spon包埋剂，则将样品进行梯度聚合，37°C条件下聚合12h ;45°C条件下聚合12h ;60°C条件下聚合24h。若使用Spurr包埋剂,则直接在70°C条件下聚合8 16h,即得到包埋好的样品。使用Spurr包埋样品时，将包埋板装入分子生物学样品测试常用的送样袋中，密封好大部分端口，从一侧留缝隙用注射器抽真空，再完全密封，放入烘箱。使用Spurr时，预先在包埋板上适当位置插入减去尖半部的解剖针以支起一定空间，防止在抽真空以后，包埋剂与测试送样袋接触而使整姿好的样品位置发生改变。样品在超薄切片机中定位、切片，获得70 90nm的超薄切片。切片经醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液及柠檬酸铅溶液分别染色30min，25min后，在透射电镜中进行观察、拍照，获得显微图片。总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
权利要求
1.一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，其特征在于:依次由下述步骤组成， A.固定液的配制:在含多聚甲醛及戊二醛的PBS缓冲液中，加入蔗糖，4°C保存，其中PBS缓冲液为磷酸盐缓冲液； B.各种包埋剂的配制: (1)SPI — Pon 812 包埋剂的配制:将 SPI _Pon812、DDSA、NMA 和 DMP - 30，逐样加入烧杯中，用磁力搅拌器搅动均匀，当四种成分全加入后，用铝箔纸密封烧杯口，继续搅动约I小时，去掉铝箔纸，用真空干燥器将包埋剂中的气泡抽出，并在干燥器中静置片刻待气泡完全消失，将配制好的包埋剂转移入干燥的离心管或密封的注射器中，密封在放有硅胶干燥剂的塑料袋中，_20°C保存，使用时提前拿出，待恢复至室温即可使用，其中SP1-Pon812为环氧树脂，DDSA为2-十二烯基丁二酸酐，NMA为甲基纳迪克酸酐，DMP-30为2_4_6_三(二甲氨基甲基)苯酚； (2)Spurr(4221)包埋剂的配制JfERL 422UDER 736、NSA和DMAE，逐样加入烧杯中，用磁力搅拌器搅动均匀，当四种成分全加入后，用铝箔纸密封烧杯口，继续搅动约I小时，去掉铝箔纸，用真空干燥器将包埋剂中的气泡抽出，并在干燥器中静置片刻待气泡完全消失，将配制好的包埋剂转移入干燥的离心管或密封的注射器中，密封在放有硅胶干燥剂的塑料袋中，_20°C保存，使用时提前拿出，待恢复至室温即可使用，其中ERL 4221为环氧树月旨，DER 736为聚乙二醇环氧树脂，NSA为壬烯基琥珀酸酐，DMAE为二甲乙醇胺； C.解剖、固定和漂洗:取昆虫成虫,放入盛有固定液的瓶子中，在固定液中将昆虫成虫杀死，在固定液中解剖下昆虫头部，放入盛有固定液的另一个瓶子中，用橡胶皮塞将盛有样品的瓶子密封好，用注射器手动对样品进行抽真空操作，直至样品完全下沉，将瓶子里的样品转移到装有新鲜固定液的离心管中，前固定，前漂洗，再用锇酸溶液进行后固定，后漂洗； D.脱水和浸透:用梯度乙醇溶液及环氧丙烷对漂洗好的样品进行脱水处理，再用环氧丙烷和包埋剂的混合液对样品进行梯度浸透，然后换管，用包埋剂浸透样品； E.聚合:将样品表面的树脂吸净，放入包埋板上盛有包埋剂的包埋孔中，再进行整姿处理，将包埋板放入烘箱中加热使包埋剂聚合，样品处理完成。
2.根据权利要求1所述的一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，其特征在于:步骤A中的固定液的配制，在含2% (质量分数)多聚甲醛及2.5% (质量分数)戊二醛的0.1mol/L PBS缓冲液(pH7.4)中，加入5% (质量分数)蔗糖，4°C保存，其中磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液。
3.根据权利要求2所述的一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，其特征在于:步骤A中的固定液的配制，加入5% (质量分数)蔗糖后，还要加入1%单宁酸，4°C保存。
4.根据权利要求1所述的一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，其特征在于:步骤B中的(I) SPI — PonTM 812包埋剂的配制:SP1- Pon812、DDSA、NMA和DMP - 30按重量份数分别加入10份、2.2份、8份和0.3份。
5.根据权利要求1所述的一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，其特征在于:步骤B中的(2) Spurr (4221)包埋剂的配制:ERL 422UDER 736、NSA和DMAE按重量份数分别加入5份、2.7份、12份和0.18份。
6.根据权利要求1所述的一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，其特征在于:步骤C中，在体视显微镜下解剖下昆虫头部，用解剖针插入头部，使头部能够完全浸入固定液，解剖完毕，用橡胶皮塞将盛有样品的瓶子密封，所有解剖器械均需遇冷，解剖过程保持瓶子里的固定液密封，减少其挥发。
7.根据权利要求6所述的一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，其特征在于:步骤C中的注射器包括针号X针管长度为6X30的注射器针头及50ml注射器针筒，抽真空过程中需不时慢慢打开橡皮塞，且轻轻摇动瓶子，使喷出的样品回到固定液中，继续抽真空，直至样品完全下沉。
8.根据权利要求7所述的一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，其特征在于:步骤C中，将瓶子里的样品转移到装有固定液的离心管中，放在脱色摇床上固定，在O 4°C条件下前固定2 4小时，用磷酸缓冲液前漂洗I 10次，每次10 20min，再用锇酸溶液后固定，再用磷酸缓冲液后漂洗I 10次，每次10 20min。
9.根据权利要求8所述的一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，其特征在于:步骤C中，解剖及抽真空在冰上进行，前固定及前漂洗在O 4°C层析柜进行，后固定及后漂洗在室温进行，前固定、前漂洗、后固定及后漂洗均在脱色摇床进行。
10.根据权利要求1所述的一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，其特征在于:步骤D中，依次用50%、70%、80%、90%和95%的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理10 20min,再用99.9%的乙醇处理15 25min，用环氧丙烷对样品进行过渡处理3次，每次5 15min,再用体积比为3:1、2:1、1:1、1:2和1:3的环氧丙烧和包埋剂的混合液对样品进打梯度浸透，依次处理样品30min、45min、lh、1.5h和3h，然后换管，用包埋剂处理样品24h，用50%和70%的乙醇溶液脱水时在O 4°C层析 柜进行，用80%、90%、95%和99.9%的乙醇溶液处理时均在室温进行，脱水和浸透过程均在脱色摇床进行。
全文摘要
本发明属于实验样品处理技术领域，涉及一种昆虫触角的样品处理方法，尤其涉及一种昆虫触角的透射电镜样品处理方法，依次由下述步骤组成，A.固定液的配制、B.各种包埋剂的配制、C.解剖、固定和漂洗、D.脱水和浸透、E.聚合，从而得到样品。本发明解决了在对昆虫触角进行透射处理过程中，固定液浸透困难、包埋剂浸透不充分的问题，可以使最后得到的样品切片比较平整，样品皱折、破损、丢失现象大大减少，样品切片内部结构均得到有效固定，亚细胞结构清晰可现。
文档编号G01N1/28GK103115809SQ20131002615
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月23日 优先权日2013年1月23日
发明者付丙鲜, 祝增荣, 洪健 申请人:浙江大学