专利名称：高效液相色谱法分析蛹虫草中腺苷和虫草素含量的方法
技术领域：
本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种高效液相色谱(HPLC)法分析蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的方法。
背景技术：
蛹虫草(又名北虫草、北冬虫夏草)为麦角菌科虫草属真菌蛹草菌(Cordyc印s Hiilitaris(L)Link)的干燥子座，是我国特有的名贵药用真菌，具有扩张器官、镇静、抗心律失常、降血压、抗病原微生物、抗恶性肿瘤等多种药理活性。腺苷、虫草素等核苷类成分被作为虫草质量的主要参考指标。腺苷(CltlH13N5O4，结构式如下所示的(a))全称腺嘌呤核苷， 是核酸的基本结构单位，它具有参与人体代谢和生理调节的功能。虫草素(CltlH13N5O3，结构式如下所示的(b))又称虫草菌素、3丨-脱氧腺苷，具有抗菌、消炎、抗氧化、抗肿瘤、调节人体内分泌等作用。
蛹虫草子实体中腺苷和虫草素的含量测定是虫草产品质量控制及代谢途径研究的前提。目前，蛹虫草中腺苷和虫草素的含量测定以高效液相色谱法最为普遍，但多采用磷酸盐溶液与有机相的混合体系作为流动相，而长期使用盐相对液相系统伤害较大。刘小芳等人(刘小芳，薛长湖，常耀光.高效液相色谱法测定蛹虫草中腺苷和虫草素的含量[J]. 食品科学，2010, 31 (16) : 172-175)提出了一种新的测定蛹虫草中腺苷和虫草素含量的方法，其流动相由柠檬酸、醋酸、三乙胺混合溶液及乙腈组成，流动相的成分和制备过程较为复杂。李祥玲等人(李祥玲，胡劲松，陈作红.HPLC测定人工蛹虫草及其培养基中虫草素和腺苷含量[J]·湖南师范大学自然科学学报，2010，33(2) :107-110)、毛新亮等人(毛新亮， 郑国栋，张晨，等.反相高效液相色谱法同时测定冬虫夏草中腺苷、虫草素、肌肝含量方法的研究[J].中南药学，2009,7(12) :895-897)虽用甲醇和水作为流动相，但却采用梯度洗脱的方式，过程繁琐。另外，如果采用《保健食品检验与评价技术规范》2003年版中腺苷的提取条件对北虫草子实体进行提取，则提取率偏低。
目前，蛹虫草中腺苷和虫草素的含量测定还没有统一的国标方法，因此确立一个简便可靠的方法一次性进样同时分析腺苷和蛹虫草的含量具有现实意义。
权利要求
1.一种高效液相色谱法分析蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)腺苷和虫草素混合标准溶液制备称取干燥至恒重的腺苷及虫草素标准品置于容器中，用水溶解并定容作为标准储备液，加超纯水将所述标准储备液稀释成若干不同浓度的腺苷和虫草素混合标准溶液； 蛹虫草子实体供试溶液制备将蛹虫草子实体烘干，经粉碎机粉碎后过筛，精确称取干燥至恒重的蛹虫草子实体粉末样品，加入提取液进行提取，提取结束后分离得上清液，即为蛹虫草子实体供试溶液； (2)测定分别吸取腺苷和虫草素混合标准溶液及蛹虫草子实体供试溶液，过滤后注入进样小瓶，测定蛹虫草子实体供试溶液应呈现与腺苷和虫草素混合标准溶液色谱保留时间相同的色谱峰。
2.如权利要求I所述的高效液相色谱法分析蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述步骤(I)中，所述腺苷和虫草素混合标准溶液的制备方法为精确称取干燥至恒重的腺苷及虫草素标准品各4mg,置于50 ml容量瓶中，用50ml水溶解并定容作为标准储备液，浓度记为80 μ g/ml ； 将所述标准储备液用超纯水稀释成2 μ g/ml、5 μ g/ml、10 μ g/ml、20 μ g/ml、40 μ g/ml、80 μ g/ml的腺苷和虫草素混合标准溶液。
3.如权利要求2所述的高效液相色谱法分析蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述精确称取为精确到O. 0001 g。
4.如权利要求I所述的高效液相色谱法分析蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述步骤(I)中，蛹虫草子实体供试溶液制备为将蛹虫草子实体置于40°C烘干箱烘干，经粉碎机粉碎后过200目筛，精确称取干燥至恒重的样品O. 50 g于50 ml离心管中，加入25 ml提取液后水浴超声提取，提取结束后将离心管置于20°C、50()0 r/min的离心机中离心10 min,吸取上清液I ml，经O. 45 μ m水相微孔滤膜过滤后直接注入进样瓶以供分析。
5.如权利要求I或4所述的高效液相色谱法分析蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述步骤(I)蛹虫草子实体供试溶液制备中，所述提取液为纯水。
6.如权利要求I或4所述的高效液相色谱法分析蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述步骤(I)蛹虫草子实体供试溶液制备中，所述提取为提取一次，提取时间为30-40分钟，提取温度为30°C。
7.如权利要求4所述的高效液相色谱法分析蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述水浴超声提取的超声功率为700W。
8.如权利要求I所述的高效液相色谱法分析蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，高效液相色谱条件为 色谱柱为 XBridgeTM C18(5ym, 4. 6 X 250 mm)； 流动相为甲醇水=16:84 (V:V);流速1. O ml/min ； 进样量10 μ L，自动进样； 柱温30°C ;检测波长254 nm。
9.如权利要求8所述的高效液相色谱法分析蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述流动相中的水为超纯水。
10.如权利要求I所述的高效液相色谱法分析蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的方法，其特征在于，所述色谱测定过程采用等度洗脱。
全文摘要
本发明公开了一种高效液相色谱(HPLC)法测定人工培养蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量的方法，具体为1、称取蛹虫草干燥子实体粉末于50ml具塞离心管中并加水，将离心管在水浴中超声提取，之后离心，取上清液为供试溶液；2、分别称取一定质量的腺苷和虫草素标准品，加水溶解制得混合溶液，作为混合标准溶液；3、含量测定，分别取混合标准溶液和供试溶液，经0.45μm水相微孔滤膜过滤后注入进样小瓶，测定蛹虫草子实体供试溶液与腺苷虫草素标准溶液色谱保留时间相同的色谱峰。本发明为评价蛹虫草子实体质量提供了一种新的简便方法。
文档编号G01N30/02GK102928526SQ201210381609
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月10日 优先权日2012年10月10日
发明者周培, 袁蜜, 支月娥, 徐鲁荣, 乐昕 申请人:上海交通大学