专利名称：C-反应蛋白检测试纸条的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种C-反应蛋白检测试纸条。
背景技术：
C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)是在感染和组织损伤时血衆浓度快速、急剧升高的主要的急性期蛋白。CRP可以激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，从而清除入侵机体的病原微生物和损伤，坏死，凋亡的组织细胞，在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。关于CRP的研究已经有70多年的历史，传统观点认为CRP是一种非特异的炎症标志物，但近十年的研究揭示了 CRP直接参与了炎症与动脉粥样硬化等心血管疾病，并且是心血管疾病最强有力的预示因子与危险因子。目前，CRP检测采用胶体金法进行，一般用于细菌或病毒感染的诊断。CRP胶体金法中，使用一对单克隆抗体，其中一株单克隆抗体用胶体金进行标记，另一株单克隆抗体包被在硝酸纤维膜上，加入血清后，血清中的CRP与胶体金标记的抗体结合并沿硝酸纤维膜上爬，在遇到硝酸纤维膜上包被的另一株抗体后会在此显出胶体金的红色。CRP检测作为心脑血管疾病预报是十分重要的。2003年美国疾病预防控制中心(⑶C)和美国心脏协会AHA已经发布文件，对hs-CRP进行分级标准为:hs_CRP < lmg/L (低度危险)，hs-CRP为l-3mg/L (中度危险)，hs-CRP > 3mg/L (高度危险)。然而，由于CRP胶体金法试剂的灵敏度低，达不到进行心血管疾病筛查的目的。如果灵敏度较低，对于hs-CRP为l_3mg/L的部分人群，其检测结果可能存在偏差。

发明内容
本发明的目的是提供一种快速测定血清中hs-CRP水平的胶体金法C-反应蛋白检测试纸条。本发明所提供的C-反应蛋白检测试纸条，包括底板7以及贴附在底板7上的样品区6、金标记CRP单克隆抗体I区、硝酸纤维素膜2和吸水垫I ;所述样品区6、所述金标记CRP单克隆抗体I区5、所述硝酸纤维素膜2和所述吸水垫I在液体流动方向上顺序排列；所述硝酸纤维素膜2上设有在液体流动方向上顺序排列的第一单克隆抗体线9、第二单克隆抗体线8、第三单克隆抗体线4以及质控线3 ;所述第一单克隆抗体线9包含5 μ g CRP单克隆抗体II，所述第二单克隆抗体线8包含15 μ g CRP单克隆抗体II，所述第三单克隆抗体线4包含5 μ g CRP单克隆抗体II ;所述CRP单克隆抗体I结合的抗原表位与所述CRP单克隆抗体II结合的抗原表位不同。其中，所述金标记CRP单克隆抗体I区5由吸附有红色胶体标记CRP单克隆抗体I的玻璃纤维制成。所述第一单克隆抗体线9是将100 μ g/ml的CRP单克隆抗体II溶液画到硝酸纤维膜上，然后吹干而制成的。所述第二单克隆抗体 线8和所述第三单克隆抗体线4都是将400 μ g/ml的CRP单克隆抗体II溶液画到硝酸纤维膜上，然后吹干而制成。所述CRP单克隆抗体II溶液为用TBS稀释液稀释CRP单克隆抗体II配制而成的，所述 TBS 稀释液包含 10-100mmol/L Tris, 100-500mmol/L NaCl, l-30mmol/L KCl, 1-10%(体积百分含量)甘油，0.01-3% (体积百分含量)异丙醇。本发明的C-反应蛋白检测试纸条在诊断迅速的同时可以对人群中CRP的含量< lmg/L, l-3mg/L或> 3mg/L做出区分,能够准确判断出高危人群。使用本发明的C-反应蛋白检测试纸条不需要任何仪器，患者在家中即可完成检测；仅仅需要I滴血，不超过5分钟即可完成整个检测。


图1表示本发明的C-反应蛋白检测试纸条的结构示意图。
具体实施例方式实施例1(一)制备CRP单克隆抗体II溶液用TBS 稀释液稀释 CRP 单克隆抗体 II (0Y MEDIX BIOCHEMI CA AB:Anti_hCRP6404)，分别获得100 μ g/ml，400 μ g/ml，400 μ g/ml的CRP单克隆抗体II溶液，其中TBS稀释液包含 10mmol /I,的 Tris, 100mmol/L 的 NaCl, Immol /I,的 KCl, I %甘油,0.01 %异丙醇；或者 TBS 稀释液包含 100mmol/L 的 Tris，500mmol/L 的 NaCl，30mmol/L 的 KCl，10%甘油，3%
异丙醇。(二)CRP 抗原溶液用TBS 溶液将 CRP 抗原(Scripps Laboratories, C0125)配制成浓度 10 μ g/ml 的CRP抗原溶液。(三)制备红色胶体标记抗体1:1.胶体金的制备:(1)将氯化金先配制成0.01%水溶液，然后取250ml加热至沸。(2)搅动下准确加入6毫升的I %柠檬酸三钠(Na3C6H5O7.2H20)水溶液。(3)继续加热煮沸15min，此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色，全过程约2 3min。(4)冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。2.胶体金标记单抗(1)用0.1moVLK2CO3调节胶体金溶液的pH至5.8-6.6之间；(2)将 CRP 单克隆抗体 I (0Y MEDIX BIOCHEMI CA AB, Ant1-hCRP6405)透析 12 小时后取出，将1/10体积浓度lmg/mL的CRP单克隆抗体I溶液加入上述胶体金溶液中，放置室温反应2 5min ；(3)加入浓度为0.2 %的BSA以饱和游离的胶体金；(4) 20000r/min离心lh，去除上清液中未结合的蛋白质；(5)吸出上清液，沉淀用含BSA的PBS缓冲液(0.01M, pH7.2)悬浮，恢复原体积后再20000r/min离心lh，如此洗涤2 4次以彻底除去未结合的蛋白质；
(6)免疫金复合物用含有0.3%的吐温20和0.2% BSA的PBS缓冲液(0.01M,PH7.2)配制成浓度50 μ g/ml的红色胶体标记CRP单克隆抗体I溶液。(四)C-反应蛋白检测试纸条C-反应蛋白检测试纸条的结构如图1所示，包括底板7以及贴附在底板7上的样品区6、金标记CRP单克隆抗体I区5、硝酸纤维素膜2和吸水垫I ;样品区6、金标记CRP单克隆抗体I区5、硝酸纤维素膜2和吸水垫I在液体流动方向上顺序排列并紧密连接；硝酸纤维素膜2上设有在液体流动方向上顺序排列的第一单克隆抗体线9、第二单克隆抗体线
8、第三单克隆抗体线4以及质控线3 ;第一单克隆抗体线9包含5yg CRP单克隆抗体II，第二单克隆抗体线8包含15 μ g CRP单克隆抗体II，第三单克隆抗体线4包含5μ g CRP单克隆抗体II。其中，样品区6由贴附有一层硝酸纤维素膜的玻璃纤维制成；金标记CRP单克隆抗体I区5是由吸附有红色胶体标记抗体的玻璃纤维制成，其通过将玻璃纤维浸泡在浓度50 μ g/ml的红色胶体标记抗体溶液中4小时，取出后在20-35摄氏度吹干而制备；第一单克隆抗体线9是用划膜笔将0.05ml, 100 μ g/ml的CRP单克隆抗体II溶液画到硝酸纤维膜上，然后20-35摄氏度吹干而制成；第二单克隆抗体线8是用划膜笔将0.0375ml, 400 yg/ml的CRP单克隆抗体II溶液画到硝酸纤维膜上，然后20-35摄氏度吹干而制成；第三单克隆抗体线4是用划膜笔将0.0125ml, 400 μ g/ml的CRP单克隆抗体II溶液画到硝酸纤维膜上，然后20-35摄氏度吹干而制成；质控线3是用划膜笔将0.0lml, 10 μ g/ml的CRP抗原溶液画到硝酸纤维膜上，然后20-35摄氏度吹干而制成。用于检测的患者的血清样品将滴加在样品区6上，血清将沿由左至右的方向流动，进入金标记CRP单克隆抗体I区5时，血清中的CRP抗原将与红色胶体标记CRP单克隆抗体I结合，形成抗原-红色胶体标记抗体复合物，该处的红色胶体标记CRP单克隆抗体I是过量的，所有抗原将与足够的红色胶体标记CRP单克隆抗体I结合形成复合物。多余的红色胶体标记CRP单克隆抗体I将和复合物一起向右流动，经过第一单克隆抗体线9,抗原-红色胶体标记抗体复合物可以与CRP单克隆抗体II形成抗体-抗原-红色胶体标记抗体夹心模式从而固定在第一单克隆抗体线9区域显示出红色。根据抗原-红色胶体标记抗体复合物的量，抗原-红色胶体标记抗体复合物可能仅被第一单克隆抗体线4截留，也有可能分别被三条单克隆抗体线。如果血清样品中不含CRP抗原，红色胶体标记CRP单克隆抗体II将被质控线3截留显示出红色。如果第一单克隆抗体线9显色，第二和第三单克隆抗体线8和4不显色，则患者体内CRP浓度为< lmg/L。如果第一单克隆抗体线9和第二单克隆抗体线8显色，第三单克隆抗体线4不显色，则患者体内CRP浓度为< l-3mg/L。如果第一单克隆抗体线9、第二单克隆抗体线8、第三单克隆抗体线4都显色，则患者体内CRP浓度为> 3mg/L。实施例21.血液标本来源空腹静脉取血取自体检受试者，15例，其用北京永瀚星港生物科技股份有限公司生产的高灵敏C-反应蛋白(hs-CRP)测定试剂盒 (酶免疫分析)测定结果与用本发明高灵敏C-反应蛋白检测试纸条检测结果如下表:
权利要求
1.一种c-反应蛋白检测试纸条，包括底板(7)以及贴附在底板(7)上的样品区(6)、金标记CRP单克隆抗体I区(5)、硝酸纤维素膜⑵和吸水垫⑴；所述样品区(6)、所述金标记CRP单克隆抗体I区(5)、所述硝酸纤维素膜(2)和所述吸水垫(I)在液体流动方向上顺序排列；所述硝酸纤维素膜(2)上设有在液体流动方向上顺序排列的第一单克隆抗体线(9)、第二单克隆抗体线(8)、第三单克隆抗体线(4)以及质控线(3);所述第一单克隆抗体线(9)包含5yg CRP单克隆抗体II，所述第二单克隆抗体线(8)包含15 μ g CRP单克隆抗体II，所述第三单克隆抗体线(4)包含5 μ g CRP单克隆抗体II ;所述CRP单克隆抗体I的抗原表位与所述CRP单克隆抗体II的抗原表位不同。
2.根据权利要求1所述的C-反应蛋白检测试纸条，其特征在于所述金标记CRP单克隆抗体I区(5)由吸附有红色胶体标记CRP单克隆抗体I的玻璃纤维制成。
3.根据权利要求1或2所述的C-反应蛋白检测试纸条，其特征在于所述第一单克隆抗体线(9)是将100 μ g/ml的CRP单克隆抗体II溶液画到硝酸纤维膜上，然后吹干而制成的。
4.根据权利要求3所述的C-反应蛋白检测试纸条，其特征在于所述第二单克隆抗体线(8)和所述第三单克隆抗 体线(4)都是将400 μ g/ml的CRP单克隆抗体II溶液画到硝酸纤维膜上，然后吹干而制成。
5.根据权利要求4所述的C-反应蛋白检测试纸条，其特征在于所述CRP单克隆抗体11溶液为用TBS稀释液稀释CRP单克隆抗体11配制而成的，所述TBS稀释液包含lO-lOOmmol/L Tris, 100-500mmol/L NaCl, l-30mmol/L KC1，体积百分含量 1-10%甘油，体积百分含量.0.01-3%异丙醇。
全文摘要
本发明公开了一种C-反应蛋白检测试纸条。该试纸条的硝酸纤维素膜(2)上设有在液体流动方向上顺序排列的第一单克隆抗体线(9)、第二单克隆抗体线(8)、第三单克隆抗体线(4)以及质控线(3)；所述第一单克隆抗体线(9)包含5μg CRP单克隆抗体II，所述第二单克隆抗体线(8)包含15μg CRP单克隆抗体II，所述第三单克隆抗体线(4)包含5μg CRP单克隆抗体II；所述CRP单克隆抗体I的抗原表位与所述CRP单克隆抗体II的抗原表位不同。本发明的C-反应蛋白检测试纸条在诊断迅速的同时可以对人群中CRP的含量＜1mg/L，1-3mg/L或＞3mg/L做出区分，能够准确判断出高危人群。
文档编号G01N33/68GK103217532SQ201210019219
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者范飞舟, 尹星, 陈智周, 张昊岩 申请人:北京永瀚星港生物科技股份有限公司