专利名称：鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂及方法
技术领域：
本发明涉及动物医药领域，特别涉及鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂及 方法。
背景技术：
鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里氏杆菌(RA)引起的鸭、鹅等禽类败血症或慢性感染。 其病变特征是出血、纤维素性心包炎、气囊炎、肝周炎、关节炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎等 多种临床病症。由于鸭传染性浆膜炎给养鸭业带来严重的经济损失，有关其诊断和免疫预 防等方面的研究引起了越来越多的关注。其中，疫苗效力检测技术非常重要，不仅可评价疫 苗质量，还可对疫苗免疫鸭抵抗感染的状态做出评判。目前鸭传染性浆膜炎疫苗与其它疫 苗的效力检测多采用攻毒保护率(或保护指数)来表示；此外也采用与攻毒保护率有平行 关系的替代指标表示，即通过体液和细胞免疫检测评价疫苗的免疫效力。抗体检测方法主 要有酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接血凝试验(IHA)等，细胞免疫检测主要有淋巴细胞 转化试验(LTT)等。但这些方法或需要通过活体动物，或操作复杂，仅适用于实验室研究而 不适用于大规模使用。因此急需一种在生产上切实可行、操作简单、检测结果与免疫鸭产生 保护效力相关性好的检测方法和相关试剂，但目前国内、外目前没有相关研究。

发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测 试剂，该试剂通过抽取鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫鸭的血液，测定血液中凝集抗体滴度， 再利用上述滴度制备的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂；该检测试剂成本低廉， 配制简单、专一性强。为实现上述目的，本发明的技术方案为鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂，通过与鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫 动物的血清发生凝集反应的程度来检测鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力，所述检测试剂由 菌体含量为2. OOX 108CFU/mL的鸭疫里默氏杆菌抗原与稀释剂混合而成，所述稀释剂的体 积大于或等于待测血清体积的3倍，所述鸭疫里默氏杆菌抗原的体积等于待测血清与稀释 剂的体积之和。进一步，所述的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂，所述鸭疫里默氏杆菌 抗原的制备步骤具体为a、菌体培养将鸭疫里默氏杆菌接种于含有体积分数为10%新生牛血清的胰酶 大豆肉汤培养基中，37°C培养24 48h，得鸭疫里默氏杆菌培养液；b、菌体灭活向步骤a所得鸭疫里默氏杆菌培养液中加入甲醛至体积分数为 0. 5%，37°C作用24小时灭活菌体，得灭活鸭疫里默氏杆菌培养液；C、调节浓度将步骤b所得灭活鸭疫里默氏杆菌培养液离心，菌体沉淀用稀释剂 离心洗涤后，再用稀释剂调节菌体含量为2. 00X 108CFU/mL，即得鸭疫里默氏杆菌抗原；
进一步，所述检测试剂由鸭疫里默氏杆菌抗原与相当于待测血清体积3倍的稀释 剂组成；进一步，所述稀释剂为生理盐水或含有质量分数为0. 5%的石碳酸的生理盐水。本发明的目的之二在于提供一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测方法，该方 法无需借助仪器检测和动物攻毒保护试验即可以实现快速检测鸭传染性浆膜炎灭活疫苗 的效力。为实现上述目的，本发明的技术方案为所述检测试剂检测鸭传染性浆膜炎灭活疫苗效力的方法，其特征在于，具体包括 以下步骤a凝集反应将所述的检测试剂与待测血清充分混勻，置37°C温箱中16 24h，得 凝集反应液；b观测结果观测所述凝集反应液中菌体凝集程度；c判断所述鸭疫里默氏杆菌抗原中数量为50%以上的菌体被凝集，判定为阳性， 即鸭传染性浆膜炎灭活疫苗效力检测合格。进一步，步骤a中所述检测试剂与待测血清之和为ImL ；进一步，所述方法中还设置空白对照和阳性血清对照。本发明的有益效果在于本检测试剂弥补了鸭传染性浆膜炎灭活疫苗效力检测试 剂的空白，且成本低、配制简单、专一性强；另外，本试剂与免疫鸭产生保护效力的相关性 好，且稳定性高；运用本试剂实现的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测方法避免了活体 试验对动物的伤害，且操作简单，仅需通过测量血清中间数值即可实现对所述疫苗效力的 判断；另外，本方法重现性高。
具体实施例方式实施例鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂及方法一、检测试剂中稀释剂用量的确定1、材料准备①培养基为含有体积分数为10%新生牛血清的胰酶大豆肉汤培养基；实验动 物选用健康非免疫的1日龄鸭购自鸭场，隔离饲养观察6天，进一步确诊健康后于7日龄 进行实验，其抗血清I型鸭传染性浆膜炎血清抗体为阴性；供试疫苗含血清I型鸭疫里默 氏杆菌灭活菌1.00X101(lCFU/ml，批号为2005003，批量为20000ml，供试疫苗采取随机抽 样；另外，巧克力琼脂平板、鲜血琼脂平板、普通肉汤及厌氧肉肝汤培养基均按常规方法配 制。②血清I型鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清的制作免疫抗原的制备将鸭疫里默氏杆菌进行纯培养，对培养物进行计数后灭活，备 用。将弗氏完全佐剂在研钵中研磨均勻，在研磨过程中加入等体积的灭活鸭疫里默氏杆菌 菌液，直至其成为均勻的乳白色油包水状液体，得弗氏完全佐剂免疫抗原。检查乳化效果标 准取一滴该液体置于冰水上5 10分钟不扩散判定为合格。乳化物中鸭疫里默氏杆菌菌 体含量应为101(lCFU/ml。制备弗氏不完全佐剂免疫抗原可参照弗氏完全佐剂免疫抗原的制 备方法。
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免疫动物准备体重约2 3kgSPF鸡10只，免疫前每只采血检测无RA抗体存在， 继续饲养观察2天，无异常情况即可用于阳性血清制备。SPF鸡群是指没有目前国际、国 内流行的鸡疫病感染史，也不携带这些疫病的病原和抗体的具有良好生长和繁殖性能的鸡群。免疫程序分别于第一次免疫(弗氏完全佐剂免疫抗原)后第7日、14日和21天 进行二、三和四次免疫(弗氏不完全佐剂免疫抗原)，免疫部位为胸、腿部皮下多点注射，每 次免疫剂量为Iml/只；并于第四次免疫后10天静脉注射纯菌体抗原1. 00X IO10CFU/只。抗体效价测定采用试管凝集试验进行测定，其中凝集效价 32，判定其为合 格。2、鸭疫里默氏杆菌抗原的制备将血清I型鸭疫里默氏杆菌接种于盛有250ml含有体积分数为10%新生牛血清 的胰酶大豆肉汤培养基的玻璃三角瓶中，37°C温箱中24h，得鸭疫里默氏杆菌培养菌液。在 鸭疫里默氏杆菌培养菌液中加入体积浓度为10%的甲醛至所述鸭疫里默氏杆菌培养菌液 的甲醛体积浓度为0. 5%，并于37°C继续作用24h灭活。用含有质量分数为0. 5%石碳酸 的生理盐水在转速5000转/分钟条件下离心洗涤3次，至上清液透明，去上清液得鸭疫 里默氏杆菌，用含有质量分数为0.5%石碳酸的生理盐水将鸭疫里默氏杆菌调整浓度为 2. OOX 108CFU/ml，得鸭疫里默氏杆菌抗原。采用玻片凝集试验测定鸭疫里默氏杆菌抗原，生理盐水作为空白对照品，具体为 分别将鸭疫里默氏杆菌抗原和生理盐水滴加于干净玻片上，并滴加未稀释的所述血清I型 鸭疫里默氏杆菌标准阳性血清1滴，将载玻片轻轻反复摆动或用接种环涂开，37°c温箱35 分钟观察结果，鸭疫里默氏杆菌抗原中出现清晰的乳白絮状凝集块，生理盐水中无凝集现 象发生。4、实验方法取7日龄鸭60只作为实验鸭，随机分为实验组和对照组。实验1组为经鸭传染 性浆膜炎灭活疫苗免疫后7日用5. 08X 109CFU RA-CH-I菌株活菌进行攻毒的实验鸭，对 照1组为同龄仅注射生理盐水7日后用5. 08X 109CFU RA-CH-I菌株活菌进行攻毒的试验 鸭；实验2组为经鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫后14日用5. 25X IO9CFU RA-CH-I菌株活 菌进行攻毒的实验鸭，对照2组为同龄仅注射生理盐水14日后用5. 25X IO9CFU RA-CH-I 菌株活菌进行攻毒的试验鸭；实验3组为经鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫后21日用 5. 44X IO9CFU RA-CH-I菌株活菌进行攻毒的实验鸭，对照3组为同龄仅注射生理盐水21日 后用5. 44 X IO9CFURA-CH-I菌株活菌进行攻毒的试验鸭。在RA-CH-I菌株活菌进行攻毒后， 观察7日，记录临床发病及其死亡情况并剖杀存活的试验鸭，记录心包膜、肝周膜、浆膜病 变，并从心血管和肝脏进行细菌的再分离。实验鸭发病的判定标准如下，即符合下列条件之 一，判为发病①试验鸭出现精神不振、行动蹒跚、眼鼻有分泌物流出、排绿、黄绿色稀薄粪 便等鸭传染性浆膜炎临床症状；②死亡；③剖检时鸭可见心包膜炎或肝周膜炎或浆膜炎病 变或心血、肝脏、脾脏分离细菌呈阳性。试验鸭每只采血1. OOml并分离血清测定其凝集抗体，待测血清依次按2、4、8、16、 32、64、128倍稀释，并按试管凝集法检测血清凝集抗体滴度，进而确定检测试剂中稀释剂用 量。凝集抗体滴度测定采用1. OOml反应体系依次取按上述倍数稀释的待检血清0. 50ml和鸭疫里默氏杆菌抗原0. 50ml。以血清I型RA标准阳性血清为阳性对照品，以生理盐水为 空白对照品。按照下述试管凝集法的判断标准进行判断++++ 管底形成伞状沉淀，或沉淀物呈片状、块状或颗粒状，直径> 0. 25cm,即数 量为100%以上的菌体被凝集；+++ 菌体大部分凝集呈片状、块状或颗粒状，直径0. 20cm 0. 24cm,即数量为 75%以上的菌体被凝集；++:管底有明显的凝集沉淀，呈块状或小片絮状物，直径0. IOcm 0. 19cm，即数量 为50%以上的菌体被凝集；+ 有不太显著的凝集沉淀或仅有凝集沉淀的痕迹，直径0. Olcm 0. 09cm,即数量 为25%以上的菌体被凝集；-液体呈浑浊、不透明，无凝集沉淀或凝集沉淀的痕迹。以出现“++”判断标准的血清最高稀释度的下一倍比稀释度为待检血清效价，即抗 体滴度。例如血清稀释度为1 1时未出现凝集反应，则待检血清效价仍记为0;如果出现 凝集反应，则待检血清效价记为1 2，依次类推。其中生理盐水对照凝集效价应彡1 2。5、实验结果经鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫后7日用5. 08X IO9CFU RA-CH-I菌株活菌进行 攻毒的实验鸭凝集抗体滴度与保护效力的关系见表1。表1鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫7日龄鸭后7日抵抗5.08X 109CFU攻击的结果
权利要求
鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂，其特征在于所述检测试剂通过与鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫动物的血清发生凝集反应的程度来检测鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力，其由菌体含量为2.00×108CFU/mL的鸭疫里默氏杆菌抗原与稀释剂混合而成，所述稀释剂的体积大于或等于待测血清体积的3倍，所述鸭疫里默氏杆菌抗原的体积等于待测血清与稀释剂的体积之和。
2.根据权利要求1所述的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂，其特征在于，所 述鸭疫里默氏杆菌抗原可由以下方法获得a、菌体培养将鸭疫里默氏杆菌接种于含有体积分数为10%的新生牛血清的胰酶大 豆肉汤培养基中，37°C培养24 48小时，得鸭疫里默氏杆菌培养液；b、菌体灭活向步骤a所得鸭疫里默氏杆菌培养液中加入甲醛至体积分数为0.5%， 37°C作用24小时灭活菌体，得灭活鸭疫里默氏杆菌培养液；c、调节浓度将步骤b所得灭活鸭疫里默氏杆菌培养液离心，菌体沉淀用稀释剂离心 洗涤后，再用稀释剂调节菌体含量为2. 00X 108CFU/mL，即得鸭疫里默氏杆菌抗原。
3.根据权利要求1所述的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂，其特征在于所 述稀释剂为生理盐水或含有质量分数为0. 5%的石碳酸的生理盐水。
4.根据权利要求1 3任一项所述的鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂，其特 征在于所述稀释剂的体积等于待测血清体积的3倍。
5.应用权利要求1所述检测试剂检测鸭传染性浆膜炎灭活疫苗效力的方法，其特征在 于，具体包括以下步骤a凝集反应将所述检测试剂与待测血清充分混勻，37°C反应16 24小时，得凝集反 应液；b观测结果观测所述凝集反应液中菌体凝集程度；c判断所述鸭疫里默氏杆菌抗原中数量为50%以上的菌体被凝集，判定为阳性，即鸭 传染性浆膜炎灭活疫苗效力检测合格。
6.根据权利要求5所述的检测鸭传染性浆膜炎灭活疫苗效力的方法，其特征在于步 骤a中所述检测试剂与待测血清体积之和为lmL。
7.根据权利要求5所述的检测鸭传染性浆膜炎灭活疫苗效力的方法，其特征在于所 述方法中还设置有空白对照和阳性血清对照。
全文摘要
本发明涉及动物医药领域，特别涉及鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力检测试剂及方法，该检测试剂通过与鸭传染性浆膜炎灭活疫苗免疫动物的血清发生凝集反应的程度来检测鸭传染性浆膜炎灭活疫苗的效力，由菌体含量为2.00×108CFU/mL的鸭疫里默氏杆菌抗原与稀释剂混合而成，稀释剂的体积大于或等于待测血清体积的3倍，鸭疫里默氏杆菌抗原的体积等于待测血清与稀释剂的体积之和；该检测试剂配制简单，成本低廉，专一性强；利用该试剂检测鸭传染性浆膜炎灭活疫苗效力的方法包括凝集反应、观测结果、效力判断共三个步骤，避免了活体试验对动物的伤害，且操作简单，仅需通过测量血清中间数值即可判断疫苗效力。
文档编号G01N33/569GK101975855SQ201010261638
公开日2011年2月16日 申请日期2010年8月25日 优先权日2010年8月25日
发明者朱德康, 汪铭书, 程安春, 陈孝跃 申请人:四川农业大学实验动物工程技术中心