专利名称：一种鉴别苦皮藤根皮药材的方法
技术领域：
本发明属于天然药用植物的鉴别领域，具体地，涉及一种鉴别苦皮藤根皮药材的方法。
背景技术：
苦皮藤(Celastrus angulatus)亦叫马断肠、苦树皮、老虎麻等，系卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属(Celastrus)多年生藤状灌木植物，产于河北、山东、河南、陕西、湖北、甘肃、江苏、安徽等省。其根、茎、叶、果实和种子是天然的杀虫剂又是重要的中药资源，民间用其根皮、茎皮、树叶防治蔬菜及各种作物的虫害已有相当长的历史[①中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.科学出版社，1999，45(3) 102.②柯治国，等.The research and advances on the plant-based insect antifeedant Celastrusangulatus [J],武汉植物学研究1993，11 (3) :265-271]。苦皮藤对菜青虫、猿叶虫、小菜蛾、黄守瓜等害虫有独特的效果，可谓长年不衰的植物杀虫剂。苦皮藤是我国特有的杀虫植物，它具有多种功效，对不同的害虫有不同的生理活性，性能稳定、使用安全、不杀伤天敌、无污染[柯治国，等.杀虫植物——苦皮藤种子的研究.第三届湖北湖南植保农药学术研讨会论文集，2004，94-300]。研究证明其中所含的杀虫活性成分主要是以β _ 二氢沉香呋喃倍半萜为骨架的多元醇酯化合物及其生物碱。这些物质对昆虫具有毒杀、拒食、麻醉等作用[吴文君.植物杀虫剂苦皮藤素研究与应用[Μ].化学工业出版社，2010]。自苦皮藤素被国家审批为植物源杀虫剂以来，其乳油、水乳剂、微乳剂[CN 92113104.6 ；CN94103655. 3 ；CN99109275. 9 ；CN 02122988. O]已不断投放市场并且收到良好的经济效益和社会效益。苦皮藤的杀虫活性 成分具有多样性、复杂性等特点，而且因产地、气候、光照等自然条件差异或提取溶剂的不同，活性成分的含量会有所变化。因此，在鉴别和评价苦皮藤药材及其产品过程中，仅仅采用某种单一分析检测手段[如高效液相色谱法(HPLC)]测定其中某一种主要活性成分(如采用苦皮藤素V (苦皮素A)的含量鉴别代表苦皮藤药材及其产品的含量)，这种模式不能全面、综合地反映苦皮藤药材及其产品之间的质量差异，当然也不能全面评价苦皮藤药材及其产品的好坏。指纹图谱技术己成为国际公认的区别评价植物天然产物及其原料的最有效的手段[周玉新.中药指纹图谱研究技术.北京化学工业出版社，2002]。关于苦皮藤药材的1H NMR指纹图谱[秦海林等，苦皮藤的1H NMR指纹图谱解析.药学学报，2001,36 (6):462-466]和红外指纹图谱[刘惠霞，等.苦皮藤的红外光谱特征及其在鉴别中的应用.西北植物学报1998,305-310]曾见报道，仅能定性分析，未实际应用。并且，IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱未见报道。IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱(IGD 13CNMR)偶联(coupling)指纹图谱技术，是在已研究多年的核磁共振氢谱(1H NMR)指纹图谱技术[赵天增，等.1HNMR指纹法鉴定植物中药.中草药2000,31(11) =868-870]的基础上联合其他技术(例如目前应用最广泛的高效液相(HPLC)指纹图谱技术[谢培山等.中药色谱指纹图谱.人民卫生出版社，2005])提出的一种新的非单一手段综合指纹图谱技术。
随着药品、食品安全日益受到国家和社会的高度重视，可广泛应用于无公害蔬菜、农作物和非作物类的害虫防治的苦皮藤素需求量很大，为IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术的应用提供了广阔的基础。苦皮藤药材IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术的研究与应用，不仅可以解决我国苦皮藤药材(尤其是苦皮藤根皮药材)鉴别和评价的难题，也为加强苦皮藤药材内在成分研究的系统化与标准化，加快植物源农药苦皮藤素现代化的发展，实现与国际接轨提供了科学的保证。随着该技术在其他中药材及其提取物、植物源农药中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。

发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种鉴别苦皮藤根皮药材的方法，该方法利用了 IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术。为实现上述目的，本发明提供的鉴别苦皮藤根皮药材的方法，包括以下步骤I)对苦皮藤根皮药材进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤根皮药材特征提取物；2)对所述苦皮藤根皮药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤根皮药材特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式(IGD核磁共振碳谱指纹图谱)测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；3)通过定量分析手段测定得到苦皮藤根皮药材中所述标准参照品的绝对含量；4)利用所述特征峰峰强度(各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品的特征峰峰强度)的比值和所述绝对含量，计算出 苦皮藤根皮药材中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。其中，步骤I)中，苦皮藤根皮药材特征提取物的制备方法，包括称取苦皮藤根或/和皮药材，粉碎，用6 10倍量90、5%的乙醇回流提取2 3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至粉末，即得苦皮藤根皮药材特征提取物。进一步地，用乙醇回流提取，每次提取广2小时。进一步地，苦皮藤根或/和皮药材粉碎后过1(Γ24目筛。其中，步骤2)中，在对苦皮藤根皮药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测前，可以进行适当处理，具体方式包括取苦皮藤根皮药材特征提取物，加入6^10倍量氯仿，6(T80°C下回流提取2(T40min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干。溶于⑶Cl3 (氘代氯仿)中，之后即可以做IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测。其中，步骤2)中，所述苦皮藤根皮药材特征提取物中的活性成分特征峰为C_15吸收峰，其化学位移为δ c 60. 0 66· O。其中，步骤2)中所述峰强度，可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。其中，步骤3)中所述标准参照品的绝对含量是指用定量分析手段测定的苦皮藤根皮药材中标准参照品的质量百分含量。其中，步骤3)中，所述定量分析手段为高效液相法(HPLC法)。进一步地，所述HPLC法的条件为色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，流动相为乙腈水=(60:40)^(55:45)的混合溶剂，检测波长为242nm。
其中，所述标准参照品为苦皮素B。本发明主要测定的是苦皮藤根皮药材中4-ΟΗ-β - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的含量。其中，步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为
权利要求
1.一种鉴别苦皮藤根皮药材的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)对苦皮藤根皮药材进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤根皮药材特征提取物； 2)对所述苦皮藤根皮药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述苦皮藤根皮药材特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度； 3)通过定量分析手段测定得到苦皮藤根皮药材中所述标准参照品的绝对含量； 4)利用各活性成分特征峰峰强度及相应标准参照品特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤根皮药材中各活性成分的含量及活性成分组的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)中，苦皮藤根皮药材特征提取物的制备方法，包括称取苦皮藤根或/和皮，粉碎，用6 10倍量90、5%的乙醇回流提取2 3次，滤液合并后减压浓缩，回收溶剂至粉末，即得苦皮藤根皮药材特征提取物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)在对苦皮藤根皮药材特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测前，进行处理的方式包括取苦皮藤根皮药材特征提取物，加入6 10倍量氯仿，6(T8(TC下回流提取2(T40min，过滤后减压浓缩，回收溶剂至干。
4.根据权利要求Γ3任意一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述苦皮藤根皮药材特征提取物中的活性成分特征峰为C-15吸收峰，其化学位移为Sc 60. 0^66. O0
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述峰强度，采用峰高法、面积积分法或重量法计算。
6.根据权利要求Γ4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述标准参照品的绝对含量是指用定量分析手段测定的苦皮藤根皮药材中标准参照品的质量百分含量。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述定量分析手段为高效液相法。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述高效液相法的条件为色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，流动相为乙腈水=(60:40)^(55:45)的混合溶剂，检测波长为242nm。
9.根据权利要求Γ8任意一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，计算各活性成分含量的偶联公式为
10.根据权利要求Γ9任意一项所述的方法，其特征在于，所述标准参照品为苦皮素B。
全文摘要
本发明提供一种鉴别苦皮藤根皮药材的方法，包括对苦皮藤根皮药材进行提取，得到含有活性成分组的苦皮藤根皮药材特征提取物；对特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式测定出各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；通过定量分析手段测定得到苦皮藤根皮药材中标准参照品的绝对含量；利用特征峰峰强度的比值和所述绝对含量，计算出苦皮藤根皮药材中各活性成分的含量及活性成分组含量。本发明利用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，反映苦皮藤根皮中含有4-OH-β-二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物及其比例，完成对苦皮藤根皮药材品种和质量的鉴定。
文档编号G01N30/02GK103048347SQ20121029014
公开日2013年4月17日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者赵天增, 张海艳, 董建军, 郭唯, 范毅 申请人:河南省科高植物天然产物开发工程技术有限公司, 河南省生物技术开发中心