专利名称：一种单链微核糖核酸的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种单链微核糖核酸的检测方法，属于生物检测技术领域。
背景技术：
单链微核糖核酸(以下简称miRNA)是一类具有21_23个单核苷酸长度的核糖核 酸分子，由高等真核生物基因组编码，miRNA通过和靶基因信使核糖核酸碱基配对引导沉默 复合体(RISC)降解信使核糖核酸或阻碍其翻译。miRNAs在物种进化中相当保守，在植物、 动物和真菌中发现的miRNA只在特定的组织和发育阶段表达，miRNA组织特异性和时序性， 决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作 用。miRNA序列在不同的生物细胞中具有一定的保守性，miRNA的功能是参与生命的一些 基本过程，如发育过程中的细胞增殖、细胞死亡、应激反应和脂肪代谢等。最近的研究发现， miRNA表达与多种癌症相关，大约50%得到注解的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的 脆性位点。这说明miRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用，这些miRNAs所起的作用 类似于抑癌基因和癌基因的功能。这些研究结果都表明miRNA在细胞癌变中可能发挥着重 要的作用。因此，建立一种操作快速简便、费用低廉的检测方法对miRNA的功能研究具有重 要意义。由于miRNA分子较小，检测技术的难点高于其余分子的检测。成熟的miRNA—般 只有二十几个碱基，同族的miRNA之间通常只有一两个碱基的差别，而且绝大部分在细胞 中的表达水平都比较低，这些特性给传统的检测方法如核糖核酸杂交，芯片检测等常规手 段带来了极大的困难和挑战。

发明内容
本发明的目的是提出一种单链微核糖核酸的检测方法，建立一种用于检测miRNA 分子的简便、实用的方法，以用于miRNA的表达分析、克隆研究以及临床标本检验。
本发明提出的单链微核糖核酸的检测方法，包括以下步骤 (1)将包含单链微核糖核酸的核糖核酸加入到多聚腺苷酸聚合酶反应系统中，在 37C反应50-70分钟，得到反应液，所述的多聚腺苷酸聚合酶反应系统的体积为20微升，核 糖核酸加入的质量体积比为2纳克 200纳克/微升，多聚腺苷酸聚合酶反应系统的组成 为多聚腺苷酸聚合酶为2单位、核糖核酸为20纳克 2微克、pH值为8. 0的三羟甲基氨 基甲烷盐酸盐100毫摩尔/升、氯化钠200毫摩尔/升、乙二胺四乙酸80毫摩尔/升和三 磷酸腺苷为50毫摩尔/升； (2)从步骤(1)的反应液中取出2微升，加入到逆转录反应系统中，在37t:反应 50-70分钟，得到反应液，逆转录反应系统的体积为20微升，步骤(1)的反应液的加入体积 比为l : IO，逆转录反应系统的组成为步骤(1)的反应液2微升、逆转录引物150纳摩尔 /升、PH值为8. 8的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐150毫摩尔/升、氯化钾500毫摩尔/升、三 磷酸脱氧核糖核苷为100微摩尔/升、核糖核酸酶抑制剂为20单位和Quant逆转录酶为2 单位；
(3)从步骤(2)的反应液中取出2微升，加入到聚合酶链式反应系统中，反应程序 为40个热循环，每个热循环的条件为94t:保温20秒，6(TC保温30秒，72。C保温30秒，步骤 (2)反应液的加入体积比为l : IO，聚合酶链式反应系统的组成为步骤(2)的反应液2微 升、脱氧核糖核酸聚合酶混合液10微升、上游引物摩尔浓度为200纳摩尔/升和通用型下 游引物摩尔浓度为200纳摩尔/升。 本发明提出的单链微核糖核酸的检测方法，其优点是检测简便、快捷、节约。本发 明方法是基于SYBR Green I染料法的miRNA荧光定量检测系统，可用于从一个合成反应的 单链脱氧核糖核酸中检测多种miRNA，不仅减少了检测误差、节约了检测样品，同时还实现 了检测的高通量。而且本发明方法具有较好的检测特异性，能分辨单碱基差异的miRNA ;检 测灵敏度高，可在低至纳克级的总核糖核酸中检测到特异表达的miRNA。


图1是单链微核糖核酸mir-24和mir-122荧光定量检测的扩增曲线。
图2是单链微核糖核酸mir-24和mir_122荧光定量检测的溶解曲线。
具体实施例方式本发明提出的单链微核糖核酸的检测方法，包括以下步骤 (1)将包含单链微核糖核酸的核糖核酸加入到多聚腺苷酸聚合酶反应系统中，在 37C反应50-70分钟，得到反应液，所述的多聚腺苷酸聚合酶反应系统的体积为20微升，核 糖核酸加入的质量体积比为2纳克 200纳克/微升，多聚腺苷酸聚合酶反应系统的组成 为多聚腺苷酸聚合酶为2单位、核糖核酸为20纳克 2微克、pH值为8. 0的三羟甲基氨 基甲烷盐酸盐100毫摩尔/升、氯化钠200毫摩尔/升、乙二胺四乙酸80毫摩尔/升和三 磷酸腺苷为50毫摩尔/升； (2)从步骤(1)的反应液中取出2微升，加入到逆转录反应系统中，在37t:反应 50-70分钟，得到反应液，逆转录反应系统的体积为20微升，步骤(1)的反应液的加入体积 比为l : IO，逆转录反应系统的组成为步骤(1)的反应液2微升、逆转录引物150纳摩尔 /升、PH值为8. 8的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐150毫摩尔/升、氯化钾500毫摩尔/升、三 磷酸脱氧核糖核苷为100微摩尔/升、核糖核酸酶抑制剂为20单位和Quant逆转录酶为2 单位； (3)从步骤(2)的反应液中取出2微升，加入到聚合酶链式反应系统中，反应程序 为40个热循环，每个热循环的条件为94t:保温20秒，6(TC保温30秒，72。C保温30秒，步骤 (2)反应液的加入体积比为l : IO，聚合酶链式反应系统的组成为步骤(2)的反应液2微 升、脱氧核糖核酸聚合酶混合液10微升、上游引物摩尔浓度为200纳摩尔/升和通用型下 游引物摩尔浓度为200纳摩尔/升。 本发明涉及一种单链微核糖核酸的检测方法，属于生物检测技术领域。使用细胞 或组织核糖核酸(含有miRNA)，其中的miRNA经过多聚腺苷酸聚合酶在其3'端加上多聚腺 苷酸尾巴，再由逆转录引物进行逆转录获得核糖核酸互补单链脱氧核糖核酸，最后以miRNA 相关序列和逆转录引物的部分互补序列分别作为miRNA检测的上下游引物，使用特定的 测系统(含SYBR Green I荧光染料)来检测miRNA。
本发明方法中，所用的Quant逆转录酶和脱氧核糖核酸聚合酶混合液由天根生化 科技(北京)有限公司生产。 上述方法中步骤(2)中使用的逆转录引物、步骤(3)中使用的上游引物、通用型下 游引物，由美国英俊invitrogen公司合成。 以下介绍本发明方法的实施例检测小鼠肝脏组织中的单链微核糖核酸mir-24
和单链微核糖核酸mir-122。 1、多聚腺苷酸聚合酶反应 (1)包含单链微核糖核酸的核糖核酸的制备 称取50mg的小鼠肝脏组织，用天根生化科技(北京)有限公司的miRNA提取试剂 盒提取小鼠肝脏细胞中的总核糖核酸，得到的总核糖核酸经过吸光值测定获得其浓度。
(2)配制多聚腺苷酸聚合酶反应混合液20微升，组成如下核糖核酸为2微克，多 聚腺苷酸聚合酶为2U，pH值为8. 0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐100毫摩尔/升、氯化钠200 毫摩尔/升、乙二胺四乙酸80毫摩尔/升和三磷酸腺苷为50毫摩尔/升。轻轻混匀上述 配制的反应液，在37t:反应50-70分钟，反应结束后反应液中miRNA的3'端为多聚合腺苷 酸尾巴结构。所得的反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-2(TC短暂保存，如需长期 保存建议存放于-80°C 。
2、逆转录反应
(1)逆转录引物的序列 5' -GCGCAATGCATCGCATAGCAACTGTGCATGACAGTG(T)22(A， G， C) -3，
(2)配制逆转录反应混合液20微升，组成如下步骤1(2)的反应生成液2微升、 逆转录引物150纳摩尔/升、pH值为8. 8的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐150毫摩尔/升、氯 化钾500毫摩尔/升、三磷酸脱氧核糖核苷为100微摩尔/升、核糖核酸酶抑制剂为20单 位和Quant逆转录酶为2单位。轻轻混匀上述配制的反应液，在37。C反应50-70分钟，反应 结束后反应液中含有相应的单链脱氧核糖核酸，放置于-201:保存。
3、聚合酶链式反应
(1)引物序列:通用型下游5' -GCGCAATGCATCGCATAGCAACTGT-3'
mir-24上游引物序列5' -TGGCTCAGTTCAGCAGGAACAG-3'
mir-122上游引物序列5' -TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT-3， (2)配制聚合酶链式反应混合液20微升，组成如下步骤2 (2)的反应生成液2微 升，天根生化科技(北京)有限公司的脱氧核糖核酸聚合酶混合液10微升，上游引物摩尔 浓度为200纳摩尔/升，通用型下游引物摩尔浓度为200纳摩尔/升。反应程序为40个热 循环，每个热循环的条件为94t:保温20秒，6(TC保温30秒，72。C保温30秒，反应结束后即 可通过荧光定量检测仪检测相应的miRNA。说明书附图中图l是单链微核糖核酸mir-24和 mir-122荧光定量检测的扩增曲线；图2是单链微核糖核酸mir-24和mir-122荧光定量检 测的溶解曲线。
权利要求
一种单链微核糖核酸的检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)将包含单链微核糖核酸的核糖核酸加入到多聚腺苷酸聚合酶反应系统中，在37℃反应50-70分钟，得到反应液，所述的多聚腺苷酸聚合酶反应系统的体积为20微升，核糖核酸加入的质量体积比为2纳克～200纳克/微升，多聚腺苷酸聚合酶反应系统的组成为多聚腺苷酸聚合酶为2单位、核糖核酸为20纳克～2微克、pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐100毫摩尔/升、氯化钠200毫摩尔/升、乙二胺四乙酸80毫摩尔/升和三磷酸腺苷为50毫摩尔/升；(2)从步骤(1)的反应液中取出2微升，加入到逆转录反应系统中，在37℃反应50-70分钟，得到反应液，逆转录反应系统的体积为20微升，步骤(1)的反应液的加入体积比为1∶10，逆转录反应系统的组成为步骤(1)的反应液2微升、逆转录引物150纳摩尔/升、pH值为8.8的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐150毫摩尔/升、氯化钾500毫摩尔/升、三磷酸脱氧核糖核苷为100微摩尔/升、核糖核酸酶抑制剂为20单位和Quant逆转录酶为2单位；(3)从步骤(2)的反应液中取出2微升，加入到聚合酶链式反应系统中，反应程序为40个热循环，每个热循环的条件为94℃保温20秒，60℃保温30秒，72℃保温30秒，步骤(2)反应液的加入体积比为1∶10，聚合酶链式反应系统的组成为步骤(2)的反应液2微升、脱氧核糖核酸聚合酶混合液10微升、上游引物摩尔浓度为200纳摩尔/升和通用型下游引物摩尔浓度为200纳摩尔/升。
全文摘要
本发明涉及一种单链微核糖核酸的检测方法，属于生物检测技术领域。使用细胞或组织核糖核酸(含有miRNA)，其中的miRNA经过多聚腺苷酸聚合酶在其3’端加上多聚腺苷酸尾巴，再由逆转录引物进行逆转录获得核糖核酸互补单链脱氧核糖核酸，最后以miRNA相关序列和逆转录引物的部分互补序列分别作为miRNA检测的上下游引物，使用特定的检测系统(含SYBR Green I荧光染料)来检测miRNA。本方法具有简便、快速和适于大量样本检测的优点。本方法可用于miRNA的表达分析、克隆研究以及临床标本检验。
文档编号G01N21/64GK101792806SQ20101012981
公开日2010年8月4日 申请日期2010年3月19日 优先权日2010年3月19日
发明者俞萍, 孙克非, 寇彤, 李晓晨 申请人:天根生化科技(北京)有限公司