专利名称：：一种检测弓形虫IgM抗体的化学发光免疫分析测定试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医学免疫学与体外诊断
技术领域：
，具体地，本发明提供了一种FITC-抗FITC抗体间接包祐j支术结合化学发光免疫分析技术测定弓形虫IgM抗体测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：弓形虫(Toxoplasmagondii)是猫科动物的肠道球虫，由法国学者Nicolle及Manceaux在刚地梳趾鼠(Ctenodactylusgondii)的脾脏单核细胞内发现，虫体呈弓形，故命名为刚地弓形虫。弓形虫病(toxoplasmosis)又称弓形体病，是由弓形虫所引起的一种人畜共患寄生虫病。据文献报道，弓形虫可感染多种哺乳动物，家畜感染率可达10-50%。全球约有10亿人感染了弓形虫，我国人群平均感染率为5.16%。弓形虫是孕妇宫内感染导致胚胎畸形的五大病原体之一，先天性弓形虫病患者可导致智力发育障碍、神经系统病变如脑瘫、癫痫、脑膜炎、弱智等症状。我国每年约有9万名新生儿受弓形虫病损害，年均耗资上亿元，给社会和家庭带来了沉重的负担，同时也严重地影响了我国的出生人口素质。弓形虫感染后最早出现的抗体为IgM抗体，若在血清中检测到IgM抗体则提示为急性弓形虫感染，随后出现的IgG抗体在感染后2-5个月逐渐达到高峰，并可持续较长时间存在，IgG抗体阳性说明曾感染弓形虫，一般多为慢性感染。目前，对弓形虫致畸已引起普遍认识，对异常产史、异常接触史或有临床症状者进行监测、制定有效的防治措施以有效地加强对育龄妇女弓形虫感染的检测，对于提高出生人口素质，搞好计划生育和优生优育具有极其重要的意义。目前，弓形虫的实验室诊断方法主要包括病原学试验和血清学试验。病原学试验具有确诊意义，但存在操作较困难、灵敏度低等缺点。因而，血清学试验是目前广泛应用的重要辅助诊断手段。常用的血清学诊断方法主要包括染色试验(Sabin-FeldmanDT)、间接血凝试验(IHA)、放射免疫分析(RIA)以及酶联免疫分析(EIA)等。其中染色试验存在需要活虫操作的缺点，间接血凝试验虽然与DT符合率高但重复性差、致敏红细胞不稳定，放射免疫分析虽然高灵敏、高特异但存在有效期短、放射性污染的缺点，酶联免疫分析虽然有效期长、特异性强但存在底物大部分有毒或为致癌等缺点。化学发光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay,CLIA)是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析，是继放射免疫分析和酶免疫分析之后发展起来的一种超高灵敏度的微量测定技术。具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器简单经济等优点。它是放射性免疫分析与普通酶免疫分析理想的取代者，是目前免疫定量分析最理想的方法，异硫氰酸荧光素(FITC)是一种很稳定的荧光素，极易结合在蛋白分子上，不仅标记简单，而且标记物十分稳定。FITC作为半抗原结合到蛋白质载体上具有很强的免疫原性，抗FITC单克隆抗体与标记在的蛋白质上FITC反应，不仅特异性高，而且亲和力也高于抗原抗体的结合。本发明以抗FITC抗体包被固相载体，通过FITC-抗FITC抗体系统间接包被FITC标记的蛋白，不仅便于放大生产、易于监控生产过程，而且避免了直接包被固相存在的活性损失大、工艺优化繁瑣等缺点，同时保证了批次间的稳定性。本发明解决了目前临床上病原学试验操作不方便、灵敏度低，放免试剂有效期短、放射性废弃物污染危害以及酶免试剂受多种因素干扰、底物大部分有毒等不足。本发明的弓形虫IgM抗体化学发光测定试剂盒，经临床实验证明，操作简便，灵敏度高，特异性好，与病原学检验结果符合度极高，提供了一种高效、灵敏、稳定、特异的弓形虫急性感染的血清学诊断技术。
发明内容本发明的目的是提供一种FITC-抗FITC抗体间接包被技术结合化学发光免疫分析测定弓形虫IgM抗体的化学发光测定试剂盒及其制备方法。本发明的试剂盒由弓形虫IgM抗体阴性对照、阳性对照、抗FITC抗体包被的固相载体、FITC标记的抗人p链单克隆抗体、辣^^过氧化物酶标记的弓形虫抗原、化学发光底物以及浓缩洗涂液组成。本发明的另一目的为提供了上述试剂盒的制备方法。(1)阴性对照的制备收集经ELISA法检测弓形虫IgM抗体、HIV(l+2)抗体、HCV抗体、TP抗体、HBsAg为阴性的正常人血清6份以上，过滤除菌、分装、低温储存。(2)阳性对照的制备收集经ELISA法;险测弓形虫IgM抗体阳性，HIV(l+2)抗体、HCV抗体、TP抗体、HBsAg阴性的患者血清6份以上，过滤除菌、分装、低温储存。(3)抗FITC抗体包被固相载体的制备用0.020MpH值为7.4的磷酸盐緩冲液配制成所需浓度的抗FITC抗体包被液，并将包被液负栽于固相载体上，用含20%新生牛血清、5。/。L-岩藻糖的0.02MpH7.4磷酸盐緩冲液封闭后，抽湿干燥，铝箔袋密闭，2-8。C保存。其中，所迷包被抗FITC抗体的固相载体为微孔板或磁性颗粒。(4)FITC标记抗体的制备将抗体用pH9.60.05M碳酸盐緩冲液透析后，与FITC的DMSO溶液避光反应，经50mMNm:i终止反应后，0.02MpH7.4磷酸盐緩冲液透析、低温、避光保存。(5)酶标弓形虫抗原的制备用简易的过^*酸钠氧化法将辣#>过氧化物酶与弓形虫抗原偶联。(6)化学发光底物的制备基于1000mL所述化学发光底物A液，包括1.7716g鲁米诺、0.051g4-羟基联苯、0.012g4-硤苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值为8.0~10.0;基于lOOOmL所述化学发光底物B液，包括0.329g过氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP04.12H20、8.74gNaH2P04.2H20，其pH值为7.0~7.6。(7)浓缩洗涤液的制备配制含16%NaCl、0.4%KC1、0.1%吐温20、0."/。Proclin300的0.2MpH7.4Tris-HCl緩沖液作为浓缩洗涂液，使用时按20倍稀释使用。本发明的试剂盒釆用FITC-抗FITC抗体间接包被技术与化学发光技术相结合，避免了直接物理吸附存在免疫活性损失大、空间位阻、精密性差等缺点，而且简化工艺优化、便于监控生产过程。本发明的试剂盒利用FITC-抗FITC抗体系统间接包被抗人n链单抗，与待测样本中弓形虫IgM抗体反应形成固相抗FITC抗体-FITC标记的抗人ja链单抗复合物，再与辣根过氧化物酶标记的弓形虫抗原反应形成固相抗FITC抗体-FITC标记的抗人H链单抗-辣根过氧化物酶标记的弓形虫抗原夹心复合物，然后催化底物化学发光，通过检测发光底物产生的光信号代替酶免疫分析中的显色底物从而检测血清中弓形虫IgM抗体的含量，大大提高了检测灵敏度，避免了酶免试剂存在的底物大部分有毒或致癌等缺点，并具有反应速度快、成本低、易储存等优势。本发明的试剂盒可以非常专一地检测出急性感染弓形虫后人体中的弓形虫IgM抗体含量。具体实施例方式实施例1制备本发明的弓形虫IgM抗体化学发光免疫分析测定试剂盒一、阴性对照、阳性对照的制备1、阴性对照的制备收集经ELISA法检测弓形虫IgM抗体、HIV(1+2)抗体、HCV抗体、TP抗体、HBsAg阴性的正常人血清6份以上，过滤除菌、分装、低温储存。2、阳性对照的制备收集经ELISA法检测弓形虫IgM抗体阳性，HIV(1+2)抗体、HCV抗体、TP抗体、HBsAg阴性的患者血清6份以上，过滤除菌、分装、低温储存。二、抗FITC包被微孔板的制备1、包被包被液的配制将5.8gNa2HP0412H20和0.59gNaH2P042H20用双蒸水定溶至IOO(M。将包被液中加入适量的抗FITC，混匀后以每孔100^1包被微孔板，置于2-8'C包被18-24h。2、封闭封闭液的配制将5.8gNa風12H20、0.59gNaH2P04.2H20、200ml新生牛血清、50gL-岩藻糖、lmlProclin300加入洁净容器中，溶解混匀、最后用双蒸水定溶至1000ml。每孔分别加入封闭液120^1,置于2-8。C封闭18-24h。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。28'C除湿、干燥24小时后，用铝箔袋封袋，贴签后置2-8t:保存。三、FITC标记抗人p链抗体的制备1、FITC标记工艺(1)、配制pH9.60.05M碳酸盐緩冲液将2.94gNaHC03、1.59g化20)3加入洁净容器中，加双蒸水定容至1000ml。(2)、将2mg/ml抗体用pH9.6的碳酸盐緩冲液在2-8'C条件下透析三次。(3)、将FITC溶于DMSO中，浓度为lmg/ml。(4)、按蛋白质FITC-lmg:150ug的比例将FITC緩慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，避光2-8'C反应8小时。(5)、加入5M的NH4C1至终浓度50mM,2-8'C终止反应2小时。(6)、将标记物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。(7)、标记物的鉴定蛋白浓度(mg/ml)=[A28。-0.31xA州]/1.4=1.5mg/ralF/P比例:3.1xA495/[A28。-0.31xA495]=4，该值应介于2.5-6.5之间。(8)、FITC标记蛋白应置于pH7.4的磷酸盐緩冲液中，加入0.l%NaN3、1%BSA,2-8'C避光保存。2、FITC标记抗体稀释液的配制将0.2gNaH2P042H20、2,9gNa2HP04■12眼10gPEG20000和lmlProclin300加入洁净容器中，用双蒸水定溶至1000ml。3、FITC标记抗体工作液的配制将制备的FITC标记抗体用稀释液分别稀释成不同浓度，使用棋盘滴定法选择出最佳的稀释度为1:5000。四、辣根过氧化物酶标记弓形虫抗原的制备1、弓形虫抗原的标记工艺釆用EDC法将辣根过氧化物酶与弓形虫抗原偶联，加入50y。甘油、置于-20。C冻存2、弓形虫抗原标记物稀释液的配制将0.2gNaH2P042眼2.9gNa2HP0412H20、10gPEG20000和lmlProclin300加入洁净容器中，用双蒸水定溶至lOOOml。3、弓形虫抗原标记物工作液的配制将制备的弓形虫抗原标记物用稀释液分别稀释成不同浓度，使用棋盘滴定法选择出最佳的稀释度为1:4000。五、化学发光底物A液鲁米诺1.7716g4-羟基联苯0.05lg4-硤苯硼酸0.012g硼酸11.4g硼砂、4.9g双蒸水定溶至1000mLpH8.0-10.0六、化学发光底物B液过氧化脲0.329gTween20lmlNa2HP0412H2051.58gNaH2P042H208.74g双蒸水定溶至1000mLpH7.0-7.6使用时A液与B液等比例混合。七、浓缩洗涤液将160gNaCl、4gKCl、24.2g三羟曱基絲曱烷(Tris)、lml吐温20、lralProclin300溶于900ml双蒸水中，用HCl调整pH至7,4,用双蒸水定溶至lOOOml。使用时用双蒸水稀释20倍。本发明的发明人对试剂盒的反应模式和反应条件进行了系统的优化，并就不同的反应时间对试验结果的影响进行了试验，确定最适合的反应时间。通过对化学发光底物液发光持续时间的测定及不同发光时间对测定值的影响试验表明在加入化学发光底物液后5-30分钟之间进行测量为最佳，其结果也较为准确。实施例2制备本发明的弓形虫IgM抗体化学发光免疫分析测定试剂盒除以磁性颗粒作为固相载体，以戊二醛法将抗FITC偶联到磁性颗粒表面外，其余均以与实施例1相同的方法制备弓形虫IgM抗体化学发光免疫分析测定试剂合JUL。实施例3本发明的试剂盒的使用方法以上实施例1制备的弓形虫IgM抗体化学发光免疫分析测定试剂盒的具体操作如下1)自2-8。C冰箱中取出弓形虫IgM测定试剂盒(化学发光法)，室温平衡30分钟；2)将待测样本用生理盐水按1:1000预稀释；3)每次实验设TOXIgM阴性对照3孔、阳性对照2孔。分别加入阴性对照、阳性对照以及预稀释的待测样本50ixl，然后每孔分别加入50nlFITC标记物，振荡混匀，37。C温育30分钟；4)用稀释后的洗涤液洗5次，每孔加满洗涤液，每次浸泡10秒，最后在千净的吸水纸上拍干；5)各孔加酶标记物IOOmI，振荡混匀，37。C温育30分钟；6)用稀释后的洗涤液洗5次，每孔加满洗涂液，每次浸泡10秒，最后在千净的吸水纸上拍干；5)各孔加化学发光底物液A、B各50ji1，室温(20~25°C)避光反应5分钟。6)必须于加化学发光底物液后的第5~30分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔。7)Cutoff值=2.1而，若待测样本的RLU值>Cutoff值则样本判定为阳性样本；RLU值<Cutoff值则样本判定为阴性样本。实施例4本发明的试剂盒临床试验评价用实施例1制备的试剂盒对81例正常人样本和确诊的弓形虫急性感染患者样本45例进行平行检测，检测程序和结果判断严格按照实施例3提供的使用方法进行。检测结果如表1所示表1本发明的试剂盒临床试验评价结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表1所述数据表明，本发明试剂盒特异性、敏感性均优良，本发明的试剂盒阳性预测值、阴性预测值均为100%。本发明的试剂盒，可以作为产前优生优育诊断的辅助手段，对于提高出生人口素质，搞好计划生育和优生优育具有极其重要的意义。权利要求1、一种弓形虫IgM抗体化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由阴性对照、阳性对照、抗FITC抗体的固相载体、FITC标记的抗人μ链单抗、辣根过氧化物酶标记的弓形虫抗原、化学发光底物和浓缩洗涤液组成。2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为微孔板或磁性颗粒。3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺。4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含16%NaCl、0.4%KC1、0.1%吐温20、0.1%Proclin300的0.2MpH7.4Tris-HCl緩冲液，使用时用蒸馏水20倍稀释使用。5、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤配制阴性对照、阳性对照，抗FITC抗体包被固相载体，标记单抗、抗原，配制发光底物和浓缩洗涤液，分装上述组份并组装为成品。6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述阴性对照为经ELISA检测弓形虫IgM抗体为阴性的正常人血清混合物。7、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述阳性对照为经ELISA检测弓形虫IgM抗体阳性患者血清的混合物。8、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述以抗FITC包被固相载体采用以下方法制备用0.020MpH值为7.4的磷酸盐緩冲液配制成所需浓度的抗FITC包被液，并将包被液负载于固相栽体上，用含20%新生牛血清、5%L-岩藻糖的0.02MpH7.4磷酸盐緩冲液封闭后，抽湿干燥，铝箔袋密闭，2-8'C保存。9、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物的配制方法为基于1000mL所述化学发光底物A液，包括1.7716g鲁米诺、0.051g4-羟基联苯、Q.012g4-硖苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值为8.0~10.0。基于lOOOmL所述化学发光底物B液，包括0.329g过氧化脲、lmlTween20、51.58gNa2HP0412H20、8.74gNaH2P04.2H20,其pH值为7.0~7.6。10、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述浓缩洗涤液的配方为含16%NaCl、0.4%KC1、0.IV土温20、0.1%Proclin300的0.2MpH7.4Tris-HCl緩冲液，使用时用双蒸水20倍稀释使用。全文摘要本发明公开了一种FITC-抗FITC间接包被技术与化学发光免疫分析技术相结合的弓形虫IgM抗体测定试剂盒及其制备方法。本发明的试剂盒由阴性对照、阳性对照、抗FITC抗体的固相载体、FITC标记的抗人μ链单抗、辣根过氧化物酶标记的弓形虫抗原、化学发光底物和浓缩洗涤液组成。本发明的试剂盒可以作为产前优生优育诊断的辅助检测指标，对于提高出生人口素质，搞好计划生育和优生优育具有极其重要的意义。文档编号G01N33/543GK101377504SQ200810104140公开日2009年3月4日申请日期2008年4月16日优先权日2008年4月16日发明者唐宝军,宋胜利,应希堂,彭京胜,胡国茂,郑金来申请人:北京科美东雅生物技术有限公司