专利名称：一种测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体而言，本发明提供了一种同时测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法，同时本发明还涉及一种测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的试剂盒。
背景技术：
近十年来，单克隆抗体在生物医药界、乃至整个医药行业里取得重大的成功和巨大的发展。与传统小分子药物相比，单克隆抗体具有特异性强，疗效显著，副作用小，用量少等优点。就药物分子特性而言，抗体具有更大的不均一性。抗体的这一特性是由多种因素引起的，翻译后修饰是其中最重要的内在因素。常见的抗体翻译后修饰包括糖基化，N端焦谷氨酸化，C端脱赖氨酸，脱酰胺，氧化，异构化等。在抗体药物研发的多个环节，如分子鉴定、工艺开发、质量监控等，均需要对翻译后修饰进行检测分析。抗体IgG糖基化发生在重链Fe区的天冬酰胺，属N-糖基化，是抗体的重要结构组成。IgG糖链的核心单元由两个N-乙酰葡萄糖胺和三个甘露糖的双叉结构连接组成，根据末端半乳糖、核心岩藻糖、末端唾液酸等的差异，可以组成多种不同的糖链结构。IgG的糖基化是不均一的，表现为不同的糖型和含量。糖基化差异可以影响抗体的生物学活性和药代特征，如CDC、ADCC、体内清除半衰期等。抗体IgG的N端氨基酸为谷氨酰胺时，容易发生环化反应而生成焦谷氨酸(pyroglutamicacid, pyroE)。此反应可以自发进行,也可以在酶催化条件下进行。在抗体IgG分子的C端，则容易发生脱赖氨酸(-K)。在大部分情况下，两者对抗体的生物活性没有影响，但亦有报道指某些抗体的N端焦谷氨酸化可能会影响其与抗原的结合力。此外，N端的谷氨酰胺焦谷氨酸化和C端脱赖氨酸均会影响抗体的电荷分布，而电荷特性是抗体质量监控的重要指标之一。因此，建立快速检测抗体IgG糖基化和末端修饰的分析方法在抗体研发中具有重要意义。目前，本领域一般对糖基化和末端修饰单独进行检测。酶解荧光标记法是IgGl糖基化测定的经典定量方法，但样品处理过程相当复杂，耗时长，而且需要样品量大；也有使用质谱测定IgG酶解片段进行糖基化分析，如papain酶和IdeS酶等，但这些方法都存在一些不足，如酶切位点选择性不强，或成本过高，或样品处理复杂等，不适宜常规或工艺开发样品的批量检测。应用LC-MS进行肽图分析理论上可以同时检测抗体的糖基化和末端修饰，但含糖多肽的分离、测定和数据分析存在诸多技术难点，不适用于糖基化定量分析，而且样品处理过程复杂，耗时长，酶切过程也可能对抗体原有末端修饰产生影响。因此，目前仍未有适用于抗体研发的对IgG的糖基化和末端修饰同时进行快速测定的报道，也未有可以对少量抗体电荷异构体的结构进行快速、准确表征和鉴定的方法
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种同时测定免疫球蛋白(即抗体)电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法，该方法能够同时、快速地对免疫球蛋白糖基化、N端焦谷氨酸化和C端脱赖氨酸进行测定，可以对少量抗体电荷异构体的结构进行准确的表征和鉴定。同时本发明的另一个目的是提供一种测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的试剂盒。本发明提供一种测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法，所述方法包括以下步骤:I)使用阳离子交换色谱(CEX-HPLC)分析羧肽酶B酶切前后的免疫球蛋白，并按保留时间柱后收集不同免疫球蛋白电荷异构体；2)使步骤I)中免疫球蛋白经变性剂变性后，使用还原剂还原，从而拆分轻链和重链；3)使用反相超高压液相色谱分离步骤2)中免疫球蛋白的轻链和重链；4)使用质谱测定步骤3)中获得的轻链和重链的分子量；以及5)分析步骤3)中的色谱数据和步骤4)中的质谱数据，从而测定所述免疫球蛋白的糖基化和末端修饰情况。其中，所述免疫球蛋白优选为人免疫球蛋白，优选为人免疫球蛋白IgG，进一步优选为人免疫球蛋白IgGl和IgG2亚型。并且，所述免疫球蛋白的糖基化和末端修饰情况优选包括免疫球蛋白的轻链N端焦谷氨酸化，以及重链的天冬酰胺糖基化和N端焦谷氨酸化、C端脱赖氨酸。在本发明提供的测定方法中，所述步骤I)中的羧肽酶B与免疫球蛋白的质量比为
I: 20;酶切时间为3小时。具体地，所述步骤2)包括:向一定量的免疫球蛋白中加入10_30μ L的1_6Μ盐酸胍水溶液，混合均匀后加入1-4 μ L 二硫苏糖醇(DTT)水溶液，使免疫球蛋白发生变性、还原反应，其中，反应溶液中DTT终浓度为25-100mM，免疫球蛋白终浓度为0.2-3 μ g/μ L0优选地，所述步骤2)中的DTT终浓度为50mM。优选地，所述步骤2)中的免疫球蛋白发生变性、还原反应温度为50_65°C，反应时间为 45min_120mino更优选地，所述步骤2)中的免疫球蛋白发生变性、还原反应温度为65°C，反应时间为45min。具体地,所述步骤3)具体包括:采用反向超高压液相色谱分离步骤2)中免疫球蛋白的轻链和重链，以实现所述轻链和重链的基线分离，据本发明的具体实施方案，采用的液相系统可以为UPLC (Waters,ACQUITY)。色谱柱:ffaters, ACQUITY UPLC column, BEH C4,1.7 μ m(粒径)，300A (孔径)，
2.1 X 50mm。流动相洗脱条件对轻链和重链的分离影响较大，优选地，色谱条件设定为:色谱柱温度设定为55-65°C，进样量0.2-3 μ g ;流动相X为0.1 %甲酸水，流动相Y为0.1 %甲酸乙腈，流速为0.4mL/min ；梯度洗脱条件为:
权利要求
1.一种测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法，所述方法包括以下步骤: 1)使用阳离子交换色谱(CEX-HPLC)分析羧肽酶B酶切前后的免疫球蛋白，并按保留时间柱后收集不同免疫球蛋白电荷异构体； 2)使步骤I)中免疫球蛋白经变性剂变性后，使用还原剂还原，从而拆分轻链和重链； 3)使用反相超高压液相色谱分离步骤2)中免疫球蛋白的轻链和重链； 4)使用质谱测定步骤3)中获得的轻链和重链的分子量；以及 5)分析步骤3)中的色谱数据和步骤4)中的质谱数据，从而测定所述免疫球蛋白的糖基化和末端修饰情况。
2.根据权利要求1所述的测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法，其特征在于，所述羧肽酶B与免疫球蛋白的质量比为1: 20;酶切时间为3小时。
3.根据权利要求1所述的测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法，其特征在于，所述步骤2)包括:向一定量的免疫球蛋白中加入10-30yL的1-6M盐酸胍水溶液，混合 均匀后加入1-4 μ L 二硫苏糖醇(DTT)水溶液，使免疫球蛋白发生变性、还原反应，其中，反应溶液中DTT终浓度为25-100mM，免疫球蛋白终浓度为0.2-3 μ g/μ L0
4.根据权利要求3所述的测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法，其特征在于，所述步骤2)中DTT终浓度为50mM。
5.根据权利要求3所述的测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法，其特征在于，所述步骤2)中免疫球蛋白发生变性、还原反应温度为50-65°C，反应时间为 45min_120mino
6.根据权利要求5所述的测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法，其特征在于，所述步骤2)中免疫球蛋白发生变性、还原反应温度为65°C，反应时间为45min。
7.根据权利要求1所述的测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法，其特征在于，所述步骤3)包括:采用C4反向超高压液相色谱分离步骤2)中免疫球蛋白的轻链和重链，以实现所述轻链和重链的基线分离。
8.根据权利要求1所述的测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法，其特征在于，所述步骤4)包括: 采用电喷雾电离质谱测定步骤3)中获得的轻链和重链的分子量，其中在0-5min，流路通往废液，5-16min，流路通往质谱，然后采用正离子模式采集质谱数据。
质谱条件设定为: 锥孔气流为50.0L/Hr，脱溶剂气体为800.0L/Hr，脱溶剂温度为500°C，锥孔电压为20-40V，扫描范围为400-2500Da，扫描时间为Is。
9.根据权利要求1所述的测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法，其特征在于，所述步骤5)包括: 由步骤3)中获得的色谱峰面积计算得到所述免疫球蛋白的轻链的N端焦谷氨酸化比例，由步骤4)中获得的质谱数据计算得到所述免疫球蛋白的重链的糖型相对含量以及N端焦谷氨酸化和C端脱赖氨酸比例。
10.根据权利要求1所述的测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法，其特征在于，所述免 疫球蛋白为人免疫球蛋白。
全文摘要
本发明提供一种测定免疫球蛋白电荷异构体的糖基化和末端修饰情况的方法，该方法能够同时、快速地对免疫球蛋白糖基化、N端焦谷氨酸化和C端脱赖氨酸进行测定，所述方法包括以下步骤1)使用阳离子交换色谱(CEX-HPLC)分析羧肽酶B酶切前后的免疫球蛋白，并按保留时间柱后收集不同免疫球蛋白电荷异构体；2)使步骤1)中免疫球蛋白经变性剂变性后，使用还原剂还原，从而拆分轻链和重链；3)使用反相超高压液相色谱分离步骤2)中免疫球蛋白的轻链和重链；4)使用质谱测定步骤3)中获得的轻链和重链的分子量；以及5)分析步骤3)中的色谱数据和步骤4)中的质谱数据，从而测定所述免疫球蛋白的糖基化和末端修饰情况。
文档编号G01N30/88GK103217499SQ20131002751
公开日2013年7月24日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者朱保国, 彭育才, 杨嘉明 申请人:珠海市丽珠单抗生物技术有限公司