专利名称：原料乳中抗生素残留物的快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种原料乳中抗生素残留物的快速检测法，就是测定原料乳中含有微量抗生素残留物，它属于微量物质的检测领域。
原料乳是用来加工各种乳制品的主要原料，只有优质的无异物污染的原料乳才能生产出优质安全的乳及乳制品。
1979年，世界卫生组织正式将抗生素列入被检测污染物后，规定原料乳及消毒乳中不得有抗生素残留，欧美国家多年前就对牛乳中抗生素残留有明确的规定，禁止含有抗生素残留物的牛乳上市，超过允许残留量的牛乳和乳制品全部废弃，不准食用。其中对青霉素类药物的限量是4μg/kg～10μg/kg。
1985年，我国发布GB5408-85消毒牛乳标准中规定，用抗生素或其他对牛乳有影响的药物，或治疗期间的母牛所产的牛乳和停药后3日内的牛乳不得收购。
2001年，农业部发布无公害食品生产鲜牛乳行业标准，对新鲜牛乳的卫生指标明确了抗生素不得检出。
2000年，利用TTC法对西宁市市售全年牛乳77份标品中，检测出抗生素残留样品9份，其阳性为11.7％。
2003年，135份当年乳标品中检测到含有抗生素阳性样品72份，占被检测样品的53.3％，其中含有两种以上抗生素的样品49份，占被检样品的36.3％。
2002年，从北京市50份市售消毒牛乳样品中，TTC法检测出，4份阳性，3份可疑，阳性率为8％，可疑率为6％；微生物法检测出青霉素类残留阳性5份，阳性率占10％。酶标免疫分析法检测出四环素类阳性4份，阳性率为8％；链霉素残留物阳性11份，阳性率为22％。
对福建省生牛乳抗生素残留物进行调查，结果86件鲜乳中共检出抗生素残留阳性样品17件，检出率为19.8％。
从以上检测报道来看，我国目前的行业标准并没有严格执行，致使我国牛乳及制品中抗生生素残留问题一直未能得到解决。
基于上述现实问题，本发明的目的是要研制一种快速检测法，检测原料乳中抗生素残留物。
本发明是这样实现的，利用嗜热脂肪芽胞杆菌的芽胞对多种抗生素物质敏感性高，芽胞发育温度高，不易在常温下生长繁殖的特点进行研究。
生产工艺流程及其说明1.嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞的培养和收集纯化制备工艺嗜热脂肪芽胞杆菌冻干菌种→活化培养，增菌液、55℃、24h→扩大培养，同活化培养→产芽胞培养，产芽胞培养基、0.1ml/平皿；55℃、24h～72h55℃镜检芽胞产率，产量达80％以上→收集→离心洗涤纯化(4000rpm，10min)→再次离心洗涤(2000rpm，10min)→收集芽胞(1500rpm，15min)→纯化分离芽胞悬液，1×1010cfu/ml以上。
2.反应管的生产工艺配料→加热溶解→加指示剂→灭菌121℃，20min→加芽胞悬液混匀→无菌分装→封口→检验→成品试剂盒。
3.菌种及配料表1)嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacilus staerothermophilus Var.calidolactis)，该菌种对于广谱性抗生素残留的检测敏感强，特别对于青霉素类和磺胺类药物很灵敏。
2)增菌液配制酵母浸膏粉(Oxoid)1g胰蛋白胨(Trypton)2g葡萄糖 0.05g蒸馏水 100mlpH值8.0±0.1；121℃，15min灭菌3)保存菌种琼脂培养基配制酵母浸膏粉(Oxoid)2g蛋白胨 5g牛肉膏 1g氯化钠 5g琼脂粉 15g蒸馏水 1000mlpH值7.4±0.1；121℃，15min灭菌4)产芽胞琼脂培养基配制酵母浸膏粉(Oxoid) 0.2g蛋白胨(Bacto-Peptone，Difco) 0.5g牛肉膏(Difco) 0.1gNaCl 0.5g琼脂粉2g蒸馏水1000mlpH值8.0±0.1；121℃，15min灭菌
5)反应管基质配制NaCl 0.8g指示剂(0.2％BCP50％乙醇溶液) 2ml芽胞最终数量 1～5×108cfu/ml琼脂 0.5g蒸馏水100mlpH值8.0±0.1；121℃，15min灭菌6)促反应药物粉配制酵母浸膏粉(Oxoid) 0.5g蛋白胨(Bacto-Peptone，Difco) 0.2g葡萄糖1.0gNaCl 0.5g准确称取配料表中所列各成分，预混后放入研钵内充分研磨混合均匀即可成为促反应药物粉。将其按一定量分装，足够共100支反应管使用量，每支反应管使用量为0.02g。或者将药粉混匀拌好后直接在压片机上压成0.02g/片的药片。
快速检测法检测原理原料乳或消毒乳、乳粉等乳制品中含有一定量抗生素时，反应管基质中的嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞的萌发繁殖受到抑制，基质中不能产生有机酸，pH指示剂不显颜色变化；否则相反。
本方法的特征是1.它是由反应试剂管(1)，促反应药片(2)、原乳样品(3)和加热测温器件(9)组成，其特征在于反应试剂管(1)内含营养基质(4)和嗜热芽胞杆菌芽胞(5)组成，促反应应药片(6)由促反应物质按一定比例配制而成，把反应基(7)放入试剂管(8)中，再把反应药片(6)也投入试剂管中，同时放入加热器中，加热器在65℃保温2:30′～3:00′观看颜色变化检测乳中抗生素类药物残留物。
2.试剂管中的溶液颜色变化，颜色由紫变黄表示乳中无有抗生素类药物残留；试剂管(8)中的溶液颜色紫色不变，表示有抗生素类药物残留。
3.芽胞的培养和收集纯化的制备工艺嗜热脂肪芽胞杆菌冻干菌种→活化培养增菌液、55℃、24h→扩大培养同活化培养→产芽胞培养产芽胞培养基、0.1ml/平皿；55℃、24h～72h→镜检芽胞产率，产量达80％以上→收集→离心洗涤纯化，4000rpm，10min→再次离心洗涤，2000rpm，10min→收集芽胞，1500rpm，15min→纯化分离芽胞悬液，1×1010cfu/ml以上。
4.反应试剂管(1)的生产工艺配料→加热溶解→加指示剂→灭菌121℃，20min→加芽胞悬液混匀→无菌分装→封口→检验→成品试剂盒。
5.嗜热芽胞杆菌(5)，该菌种对广谱性抗生素残留物的检测敏感性强，特别是对于青霉素和磺胺类药物很灵敏。
6.增菌液的配制酵母浸膏粉(Oxoid)1g胰蛋白胨(Trypton)2g葡萄糖 0.05g蒸馏水 100mlpH值8.0±0.1；121℃，15min灭菌7.保存菌种用琼脂培养基配制酵母浸膏粉(Oxoid)2g蛋白胨 5g牛肉膏 1g氯化钠 5g琼脂粉 15g蒸馏水 1000mlpH值7.4±0.1；121℃，15min灭菌8.产芽胞琼脂培养基配制酵母浸膏粉(Oxoid)0.2g蛋白胨(Bacto-Peptone，Difco) 0.5g牛肉膏(Difco)0.1gNaCl0.5g琼脂粉 2g蒸馏水 1000mlpH值8.0±0.1；121℃，15min灭菌9.反应管基质配制NaCl0.8g指示剂(0.2％BCP50％醇溶液) 2ml芽胞最终数量 1～5×108cfu/ml琼脂 0.5g蒸馏水 100mlpH值8.0±0.1；121℃，15min灭菌
10.促反应药粉配制酵母浸膏粉(Oxoid) 0.5g蛋白胨(Bacto-Peptone，Difco) 0.2g葡萄糖1.0gNaCl 0.5g本快速检测法的附表、附图及说明如下表1 表示嗜热脂肪芽胞杆菌对各种抗生素敏感性实验结果表1
表2表示对不同浓度青霉素的反应时间表2
表3 表示嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞制备的试管与其它检测方法比较试验结果。
表3


图1表示快速检测法的工艺流程。
本快速检测法的关键、创新与优越性该法是利用嗜热脂肪芽胞杆菌的芽胞在短时间内萌发生长的过程中，若遇生长抑制物质而不能继续代谢繁殖的特点开发的研究课题。其技术关键点在于微生物芽胞最适萌发条件的确定以及促激活剂成分的筛选和剂量的选定。另外，对乳中残留的不同剂量各种抗生素的检测灵敏与反应现象判读时间之间的关系的掌握和使其检测性能稳定化都是本发明成功的关键技术。
权利要求
1.一种原料乳中抗生素残留物的快速检测方法，它是由反应试剂管(1)，促反应药片(2)、原乳样品(3)和加热测温器件(9)组成，其特征在于反应试剂管(1)内含营养基质(4)和嗜热芽胞杆菌(5)组成，促反应应药片(6)由促反应物质按一定比例配制而成，把反应基(7)放入试剂管(8)中，再把反应药片(6)也投入试剂管中，同时放入加热器中，加热器在65℃保温2:30′～3:00′观看颜色变化检测乳中残留物。
2.根据权利要求1所述的原料乳中抗生素残留物的快速检测方法，其特征在于试剂管中的溶液颜色变化，颜色由紫变黄表示乳中无有抗生素残留；试剂管(8)中的溶液颜色紫色不变，表示有抗生素残留。
3.根据权利要求1所述的原料乳中抗生素残留物的快速检测方法，其特征在于嗜热脂肪芽胞杆菌芽胞的培养和收集纯化的制备工艺嗜热脂肪芽胞杆菌冻干菌种→活化培养增菌液、55℃、24h→扩大培养同活化培养→产芽胞培养产芽胞培养基、0.1ml/平皿；55℃、24h～72h→镜检芽胞产率，产量达80％以上→收集→离心洗涤纯化，4000rpm，10min→再次离心洗涤，2000rpm，10min→收集芽胞，1500rpm，15min→纯化分离芽胞悬液，1×1010cfu/ml以上。
4.根据权利要求1所述的原料乳中抗生素残留物的快速检测方法其特征在于反应试剂管(1)的生产工艺配料→加热溶解→加指示剂→灭菌121℃，20min→加芽胞悬液混匀→无菌分装→封口→检验→成品试剂盒。
5.根据权利要求1所述的原料乳中抗生素残留物的快速检测方法，其特征在于嗜热脂肪芽胞杆菌(5)，该菌种对广谱性抗生素残留物的检测敏感性强，特别是对于青霉素和磺胺类药物很灵敏。
6.根据权利要求1所述的原料乳中抗生素残留物的快速检测方法，其特征在于增菌液的配制酵母浸膏粉(Oxoid)1g胰蛋白胨(Trypton)2g葡萄糖 0.05g蒸馏水 100mlpH值8.0±0.1；121℃，15min灭菌
7.根据权利要求1所述的原料乳中抗生素残留物的快速检测方法，其特征在于保存菌种用琼脂培养基配制酵母浸膏粉(Oxoid) 2g蛋白胨5g牛肉膏1g氯化钠5g琼脂粉15g蒸馏水1000mlpH值7.4±0.1；121℃，15min灭菌
8.根据权利要求1所述的原料乳中抗生素残留物的快速检测方法，其特征在于产芽胞琼脂培养基配制酵母浸膏粉(Oxoid)0.2g蛋白胨(Bacto-Peptone，Difco) 0.5g牛肉膏(Difco)0.1gNaCl 0.5g琼脂粉 2g蒸馏水 1000mlpH值8.0±0.1；121℃，15min灭菌
9.根据权利要求1所述的原料乳中抗生素残留物的快速检测方法，其特征在于反应管基质配制NaCl0.8g指示剂(0.2％BCP50％乙醇溶液)2ml芽胞最终数量1～5×108cfu/ml琼脂0.5g蒸馏水 100mlpH值8.0±0.1；121℃，15min灭菌
10.根据权利要求1所述的原料乳中抗生素残留物的快速检测方法，其特征在于促反应药粉配制酵母浸膏粉(Oxoid) 0.5g蛋白胨(Bacto-Peptone，Difco)0.2g葡萄糖 1.0gNaCl0.5g
全文摘要
本发明涉及一种原料乳中抗生素残留的快速检测方法，是测定乳中含有微量的抗生素残留物，它属于微量物质的检测领域。其特点是在反应试剂管内含有营养基质和嗜热脂肪芽胞杆菌，放入促反应药片，再把反应基放入试剂管中并在加热器中加热，观看颜色变化检测原料乳中残留物。该法价格低廉，准确灵敏、操作方便，是一种实用性很强的检测技术。
文档编号G01N33/50GK1696692SQ20041003782
公开日2005年11月16日 申请日期2004年5月11日 优先权日2004年5月11日
发明者张和平, 孟和毕力格, 孙志宏 申请人:张和平, 孟和毕力格, 孙志宏