专利名称：诊断奶牛隐性乳房炎的试剂、试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种诊断试剂，尤其涉及一种诊断奶牛隐性乳房炎的试剂以及由该试剂制备成的试纸条，本发明进一步涉及它们的制备方法及在临床诊断奶牛隐性乳房炎中的应用，属于奶牛隐性乳房炎的诊断领域。
背景技术：
奶牛乳房炎是奶牛业发病率最高、引起经济损失最严重的疾病之一。全世界每年仅乳房炎一项所造成的损失就高达350亿美元，中国由于乳房炎所造成的损失每年约50多亿美元。根据乳房和乳汁有无肉眼可见变化，奶牛乳房炎分为临床型乳房炎和隐性乳房炎两种类型。奶牛隐性乳房炎，一般不表现临床症状或由于其临床症状不明显，难于发现而常常被人们所忽视，但其发病率极高，当发展为临床型乳房炎时，就失去最佳的治疗时间。所 以在奶牛隐性乳房炎阶段及时作出诊断，可减轻其对奶牛乳腺的损伤及产奶量和奶质的影响。据统计，中国隐性乳房炎阳性率为46. 4-85. 7%，奶牛隐性乳房炎的诊断一直是制约奶牛养殖业的难题。国内外对奶牛乳房炎的早期诊断均进行了大量的研究，并取得了可喜的研究成果，但这些科研成果并没有在基层得到很好的应用与推广，主要原因是理论与生产实际脱节或高昂的费用，基层难以承担，如亚细胞水平方面的诊断与治疗，技术高难，要求有专业人员开展相关工作，但基层缺乏这样人员配备，所以无法推广与实施；二是理论性强，不具备应用价值，如机理方面的研究；三是监测需要昂贵的设备与专业人员，而中国基层难以达到这一要求；四是费用太高，基层难以承担，如一些生物学方面的检测试剂盒及研发的新的抗生素药物等。国外关于隐性乳房炎诊断主要集中在体细胞监测及对奶中成分的监控，现在被美、德、法等许多国家作为监测和控制奶牛隐性乳房炎的主要措施。如丹麦研制FossRBentley SomacountCC-150型体细胞分析仪等,可以及时发现隐性乳房炎,但检测设备和费用较高，不适合中国基层推广应用。在乳房炎诊断方面，国内目前采用的是CMT法或CMT改良法，这些方法基本原理就是诊断液与乳汁混合后出现絮状沉淀，根据沉淀的出现时间及量判断乳房炎程度，这些方法一是存在主观判断不确定性，判断标准难以精确界定，不同的人主观标准不一样，结果也不一样，假阴性高；另一就是需要检测人员具有一定的专业知识，也限制其临床推广应用。故研制一种适合于基层工作人员使用的简便、快捷、经济实惠的隐性乳房炎诊断试纸，对奶牛养殖业的健康发展具有重要的意义。

发明内容
本发明的目的之一是提供一种简便、快捷、准确的诊断奶牛隐性乳房炎的试剂；本发明的目的之二是提供一种制备所述诊断奶牛隐性乳房炎试剂以及由该试剂所制备的诊断试纸条的方法。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的
一种诊断奶牛隐性乳房炎的试剂，包括以下组分儿茶酚紫，中性红，石蕊，耐尔蓝Α，α 一萘酚苯甲醇；优选的，各组分的重量份是儿茶酚紫O. 2-2份，中性红1-10份，石蕊20-80份，耐尔蓝A 5-20份，α —萘酌·苯甲醇1-10份；更优选的，各组分的重量份是儿茶酚紫O. 5-1. 5份，中性红2-8份，石蕊40_60份，耐尔蓝A 8_15份，α —萘酌·苯甲醇2_8份； 最优选的，各组分的重量份是儿茶酚紫I份，中性红5份，石蕊50份，耐尔蓝A 10份，α —萘酚苯甲醇5份。本发明中所述的“儿茶酚紫”又名为“邻苯二酚紫”。本发明中所述“中性红”的学名是“3-氨基-7-甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐”，是 细胞活体染色和酸碱性指示剂的一种碱性吩嗪染料。本发明中所述耐尔蓝A又名为硫酸尼罗蓝。本发明中所用到的所有组分或原料都能通过商业途径购买得到，其规格符合行业标准。本发明提供了一种由所述诊断奶牛隐性乳房炎试剂制备得到诊断液的方法，包括以下步骤(I)将儿茶酚紫以及中性红分别用水溶解，备用；(2)将耐尔蓝A以及α —萘酚苯甲醇分别用冰醋酸溶解，备用；(3)将石蕊用乙醇回流煮沸，静置，倾去上层清液；将下层沉淀再用相同方法处理2次；残渣用水洗涤，倾去水洗液，再加水煮沸，放冷，滤过得石蕊溶液，备用；(4)将步骤(I)、( 2 )和(3 )所得到的五种备用液混均，调整pH至7. 2-7. 5，加水定容，静置，即得。其中，步骤(3)中所述的乙醇优选为浓度95%的乙醇40mL ;所述的回流煮沸时间优选为I小时。本发明进一步提供了一种用于诊断奶牛隐性乳房炎的试纸条，该试纸条的制备方法包括将定性滤纸剪成长条形的试纸条，浸入到本发明提供的用于诊断奶牛隐形乳房炎的诊断液中，取出，冷冻负压抽干，制得诊断试纸条。其中，所述的长条形的试纸条可以是宽O. 3-0. 8cm、长I. 5-3cm的试纸条，优选为宽O. 5cm、长2cm的试纸条。本发明进一步提供了诊断试纸条在诊断奶牛隐性乳房炎的使用方法，包括每次弃去待检测奶牛的头两把奶，然后按顺序将四个乳区各挤出I滴奶，分别滴到试纸条上，立即观察试纸条的颜色变化；如果无颜色变化即红色，为阴性；若变成淡绿色为轻度隐性乳房炎，变为蓝色为重度隐性乳房炎。本发明诊断试纸条具有成本低廉，使用方便，诊断精度高等优点，临床诊断检测结果表明，本发明试纸条检测隐性奶牛乳房炎的准确率达95%以上，适合于基层推广应用。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例I诊断试剂的制备取儿茶酚紫lg，加水IOOmL使其溶解，备用；取中性红5g，加水IOOmL使其溶解，备用；取耐尔蓝AlOg，加冰醋酸IOOmL使其溶解，备用；取α —萘酚苯甲醇5g，加冰醋酸IOOmL使其溶解，备用；取石蕊粉末50g，加浓度为95%的乙醇40mL，回流煮沸I小时，静置，倾去上层清液，将沉淀物再用相同方法处理2次，每次用乙醇30mL，残渣用IOmL水洗涤，倾去水洗液，再加水50mL煮沸，放冷，滤过得石蕊溶液，备用；将上述处理好的五种备用液混均，用盐酸或氢氧化钠调整pH至7. 2，加水定容至IOOOmL,静置15天，得到诊断试剂。

实施例2诊断试剂的制备取儿茶酚紫O. 2g，加水IOOmL使其溶解，备用；取中性红lg，加水IOOmL使其溶解，备用；取耐尔蓝A5g，加冰醋酸IOOmL使其溶解，备用；取α —萘酚苯甲醇lg，加冰醋酸IOOmL使其溶解，备用；取石蕊粉末20g，加浓度95%的乙醇40mL，回流煮沸I小时，静置，倾去上层清液，再用相同方法处理2次，每次用乙醇30mL，残渣用IOmL水洗涤，倾去水洗液，再加水50mL煮沸，放冷，滤过得石蕊溶液，备用；将上述处理好的五种备用液混均，用盐酸或氢氧化钠调整pH至7. 5，加水定容至IOOOmL,静置15天，得到诊断试剂。实施例3诊断试剂的制备取儿茶酚紫2g，加水IOOmL使其溶解，备用；取中性红10g，加水IOOmL使其溶解，备用；取耐尔蓝A20g，加冰醋酸IOOmL使其溶解，备用；取α —萘酚苯甲醇10g，加冰醋酸IOOmL使其溶解，备用；取石蕊粉末80g，加浓度95%的乙醇40mL，回流煮沸I小时，静置，倾去上层清液，再用相同方法处理2次，每次用乙醇30mL，残渣用IOmL水洗涤，倾去水洗液，再加水50mL煮沸，放冷，滤过得石蕊溶液，备用；将上述处理好的五种备用液混均，用盐酸或氢氧化钠调整pH至7. 4，加水定容至IOOOmL,静置15天，得到诊断试剂。实施例4诊断试剂的制备取儿茶酚紫0. 5g，加水IOOmL使其溶解，备用；取中性红2g，加水IOOmL使其溶解，备用；取耐尔蓝A8g，加冰醋酸IOOmL使其溶解，备用；取α —萘酚苯甲醇2g，加冰醋酸IOOmL使其溶解，备用；取石蕊粉末40g，加浓度95%的乙醇40mL，回流煮沸I小时，静置，倾去上层清液，再用相同方法处理2次，每次用乙醇30mL，残渣用IOmL水洗涤，倾去水洗液，再加水50mL煮沸，放冷，滤过得石蕊溶液，备用；将上述处理好的五种备用液混均，用盐酸或氢氧化钠调整pH至7. 3，加水定容至IOOOmL,静置15天，得到诊断试剂。实施例5诊断试剂的制备取儿茶酚紫I. 5g，加水IOOmL使其溶解，备用；取中性红8g，加水IOOmL使其溶解，备用；取耐尔蓝A15g，加冰醋酸IOOmL使其溶解，备用；取α —萘酚苯甲醇Sg，加冰醋酸IOOmL使其溶解，备用；取石蕊粉末60g，加浓度95%的乙醇40mL，回流煮沸I小时，静置，倾去上层清液，再用相同方法处理2次，每次用乙醇30mL，残渣用IOmL水洗涤，倾去水洗液，再加水50mL煮沸，放冷，滤过得石蕊溶液，备用；将上述处理好的五种备用液混均，用盐酸或氢氧化钠调整pH至7. 5，加水定容至IOOOmL,静置15天，得到诊断试剂。实施例6诊断试纸条的制备将定性滤纸剪成宽O. 5cm、长2cm的试纸条,浸入实施例I所制备的诊断试剂中，5分钟后取出，冷冻负压抽干，制得诊断试纸条。实施例7诊断试纸条的制备将定性滤纸剪成宽O. 5cm、长2cm的试纸条,浸入实施例2所制备的诊断试剂中，4分钟后取出，冷冻负压抽干，制得诊断试纸条。实施例8诊断试纸条的制备 将定性滤纸剪成宽O. 8cm、长2cm的试纸条,浸入实施例3所制备的诊断试剂中，6分钟后取出，冷冻负压抽干，制得诊断试纸条。实施例9诊断试纸条的制备将定性滤纸剪成宽O. 5cm、长2cm的试纸条,浸入实施例4所制备的诊断试剂中，5分钟后取出，冷冻负压抽干，制得诊断试纸条。实施例10诊断试纸条的制备将定性滤纸剪成宽O. 8cm、长2. 5cm的试纸条,浸入实施例5所制备的诊断试剂中，5分钟后取出，冷冻负压抽干，制得诊断试纸条。实验例I本发明诊断试剂在检测奶牛隐形乳房炎中的应用实验I.实验药品(I)加州乳房炎诊断液(CMT)，乳房炎检验盘；(2)诊断试纸条,实施例6-10所制备的诊断试纸条；(3)丹麦福斯公司Fossmatic 5000系列体细胞快速测定仪,完达山乳业集团提供。2.实验动物在黑龙江省哈尔滨市选择3个中大型奶牛场，奶牛品种为荷斯坦奶牛，2009年I月至2009年12月，在所选的奶牛场中去除临床型乳房炎病牛，每月对眼观正常的泌乳期健康奶牛进行隐性乳房炎检验试验。3.实验方法乳汁体细胞计数试验2009年I月至2009年12月，每月中旬采集奶牛乳汁，每次弃去头两把奶后，挤取奶样50mL，进行乳汁体细胞计数分析，记录检测数据。乳汁体细胞计数检测隐性乳房炎，阳性判定阈值为5X IO5个/mL，乳汁体细胞计数高于该阈值为隐性乳房炎阳性。对于确诊为隐性乳房炎阳性牛再用下述两种方法检测。加州乳房炎试验(CMT):奶牛场现场取奶牛四个乳区的乳样分别加入对应的检测皿检测区内，倾斜检验盘45°C左右，流出多余的乳汁，于四个检测区内分别加入等量(3mL)的CMT诊断液，随即平持转动检测盘，使诊断液与乳汁充分混合，IOs后观察结果。表ICMT检测判定标准
权利要求
1.一种诊断奶牛隐性乳房炎的试剂，其特征在于，包括以下各组分组成儿茶酚紫，中性红，石蕊，耐尔蓝A和a —萘酚苯甲醇。
2.按照权利要求I所述的试剂，其特征在于，各组分的重量份是儿茶酚紫0.2-2份，中性红1-10份，石蕊20-80份，耐尔蓝A5-20份，a —萘酚苯甲醇1_10份。
3.按照权利要求2所述的试剂，其特征在于，各组分的重量份是儿茶酚紫0.5-1. 5份，中性红2-8份，石蕊40-60份，耐尔蓝A8-15份，a —萘酚苯甲醇2_8份。
4.按照权利要求3所述的试剂，其特征在于，各组分的重量份是儿茶酚紫I份，中性红5份，石蕊50份，耐尔蓝AlO份，a —萘酚苯甲醇5份。
5.由权利要求1-4任何一项所述试剂制备得到的诊断液。
6.一种制备权利要求5所述诊断液的方法，包括以下步骤 (1)将儿茶酚紫以及中性红分别用水溶解，备用； (2)将耐尔蓝A以及a—萘酚苯甲醇分别用冰醋酸溶解，备用； (3)将石蕊用乙醇回流煮沸，静置，倾去上层清液；再用相同方法处理2次；残渣用水洗涤，倾去水洗液，再加水煮沸，放冷，滤过得石蕊溶液，备用； (4)将步骤(I)、(2)和(3)所得到的五种备用液混均，调整pH至7.2-7. 5，加水定容，静置，即得。
7.—种诊断奶牛隐性乳房炎的试纸条，其特征在于含有权利要求1-4任何一项所述的试剂。
8.—种诊断奶牛隐性乳房炎的试纸条，其特征在于含有权利要求5所述的诊断液。
9.一种制备权利要求7所述试纸条的方法，包括将定性滤纸剪成长条形的试纸条，将其浸入权利要求5所述的诊断液中，取出试纸条，冷冻负压抽干，制得。
10.权利要求1-4任何一项所述试剂或权利要求5所述诊断液在制备诊断奶牛隐性乳房炎的药物或试剂中的用途。
全文摘要
本发明公开了诊断奶牛隐性乳房炎的试剂、试纸条及其制备方法。所述试剂包括以下各组分儿茶酚紫，中性红，石蕊，耐尔蓝A和α-萘酚苯甲醇。本发明进一步公开了由所述试剂制备成的奶牛隐性乳房炎的诊断试纸条及其使用方法。本发明诊断试纸条具有成本低廉，使用方便，诊断精度高等优点。临床诊断检测结果表明，本发明试纸条检测隐性奶牛乳房炎的准确率达95%以上，能应用于奶牛隐性乳房炎的临床检测。
文档编号G01N21/78GK102818805SQ20121029265
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者高利, 肖建华, 范洪刚, 李艳飞, 张建涛, 魏成威, 刘本军, 王洪斌 申请人:高利, 肖建华, 范洪刚