专利名称：Apc基因突变的快速检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种与多种肿瘤包括结直肠癌、肺癌、 胃癌和胰腺癌等诊断相关的APC基因突变的快速检测。
背景技术：
大肠腺瘤息肉基因(APC adenomatous polyposis coli))是最早发现在结直肠癌 中的一种抑癌基因，APC基因的突变与遗传性和散发性结肠癌的发生有着非常密切的关系， 大多数APC基因突变的结果是在其下游形成提前的终止密码，使APC蛋白呈“截短”改变， 从而导致APC蛋白功能的障碍。后来，逐步发现胃癌、肺癌、胰腺癌、肝癌和食道癌等多种癌 症有APC基因突变。APC蛋白与其它肿瘤抑制基因一样，可控制细胞分裂过程中起关键作用 的基因的表达。APC基因是一个大片段的基因，开放阅读框架为8535bp，分为15个外显子，前面14 个外显子很短，而第15号外显子很长，编码区为6577bp。APC基因突变为基因碱基对组成 或排列顺序发生改变，可分为点突变、缺失和插入突变，APC基因突变大约有95%产生终止 密码子，编码蛋白合成提前终止，从而产生截短蛋白(truncated protein) 0 APC基因突变 呈不随机分布，其中1 2号外显子无突变，第15号外显子突变率为58. 3%，而且APC基 因最常见的突变在第15号外显子中1061和1309号密码子的5bp缺失是突变的热点，发生 率分别为9. 2%和18.5%。APC相关的息肉病不仅发病率高，而且其发病的外显率几乎高 达100%，一旦携带致病基因，几乎全部的患者均会出现症状及临床表现，在长期的临床随 访中，几乎100%的息肉病患者会最终发展至癌变.所以检测APC基因变化对预防、早期诊 断及早期治疗结直肠癌具有重大意义。同样APC基因可控制细胞分裂过程中起关键作用的 基因的表达，对胃癌、肺癌、胰腺癌、肝癌和食道癌等多种癌症的预防、早期诊断及早期治疗 也有重要的意义。基因突变检测可以作为肿瘤分子诊断的一种新方法。恶性肿瘤病人血浆或血清中 存在高水平的循环DNA，这种DNA来源于恶性肿瘤细胞。新近研究已经从癌症患者血浆或 血清DNA中发现了几种肿瘤特异的基因改变，表明这是检测肿瘤相关基因改变的一条新途 径。另外，粪便是另一种检测胃肠道肿瘤突变的材料，FDA已经批准了一项粪便中检测基因 突变(包括APC基因)诊断结直肠癌的试剂盒，敏感性超过70%，特异性为81%，阳性预测 值为90%，阴性预测值为63%。检测APC突变还可以了解病人的复发转移风险。大多数刚切除结直肠癌原发病灶 的患者5年内会出现复发转移，病情分期越晚者复发转移的风险越高。通过血清或血浆中 动态监控APC基因突变，可及早发现结直肠癌患者是否复发。对于有突变的胰腺癌、胃癌和 肺癌等多种癌症患者，也可检测是否复发。目前普遍应用的APC基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFLP 法)和DNA直接测序等。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在 以下缺点RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性，非闭管操作，易于污染，难以满足临床检测要求。DNA直接测序该方法存在以下缺点检 测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高。DNA直接测序的灵敏度 较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据， 需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法难适用于临床检测。临床迫切需要开发一种快速、准确、操作简便、设备要求低的APC基因突变检测技 术，满足APC突变相关的肿瘤检测对时效和灵敏性方面的要求。

发明内容
本发明目的在于提供一种快速、准确、操作简便和有效避免污染的检测APC基因 突变的试剂盒，解决了现有技术中进行APC基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污 染和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测。本发明提供的技术方案是一种检测APC基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异 性扩增APC基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有APC基因的第15外显子或第 14外显子中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述第15外显子具有SEQ ID No 1的连续核苷酸序列；所述APC14具有SEQ ID No 29的连续核苷酸序列。优选的，连续核苷酸序列为SEQ ID No :2 27序列之一的正向核苷酸序列或反向 核苷酸序列。优选的，所述引物为SEQ ID No 2 27序列之一的正向引物或反向引物。优选的，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl2、TaqDNA聚合酶、 模板DNA的PCR反应体系，所述PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度1 10X ；
dNTPs0. 01 1. 5mM ；
引物序列终浓度为0. 01 2iiM ；
模板DNA0. 01 10ng/y L ；
TaqDNA 聚合酶 0. 01 1. 0U/ ii L ；
MgCl2终浓度为0. 5 5mM ；
荧光染料1 3X。
优选的，所述PCR反应体系终浓度组成为
PCR缓冲液终浓度1 5X ；
dNTPs0. 1 0. 5mM ；
引物序列终浓度为0. 1 0. 5 ii M ；
模板DNA0. 05 1. 5ng/ u L ；
TaqDNA 聚合酶 0. 01 0. 10U/ u L ；
MgCl2终浓度为1 3mM ；
荧光染料1 2X。
优选的，所述荧光染料选自EvaGreen饱和性染料、LC Green染料、ResoLight染
料、SYT0 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 10mM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混 合液；所述PCR缓冲液包括Tris *cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20°C下pH值在8. 0-9. 0间。
本发明的另一目的在于提供一种检测APC基因外显子位点突变的方法，其特征在 于所述方法包括以下步骤(1)设计并选取包括含有APC基因的第十五外显子APC15或第十四外显子APC14 中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物对；(2)提取模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中APC基因进行PCR扩 增；(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的APC基因进行突变位点检测。优选的，所述步骤(2)中模板DNA从选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔 道的脱落物、病变组织中提取，进行PCR反应的条件为92 97°C预变性4 15min ；92 97°C变性10 30s，56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s，40 50个循环。优选的，所述步骤(2)和步骤(3)在荧光定量PCR仪上进行，在荧光定量PCR仪上 扩增后，运行溶解曲线进行基因扫描分析，所述高分辨率熔解曲线法的条件为92 97°C 变性lmin ；40°C复性lmin ；然后初始熔解温度60°C开始程序升温熔解至95°C，并在溶解过 程中实时检测荧光信号，30 50次每秒。本发明的另一目的在于提供一种PCR反应试剂盒在肿瘤诊断相关的APC基因突变 检测方面的应用，本试剂盒选用各种组织来源的基因组DNA如血细胞、口腔粘膜细胞和肿 瘤组织，尤其是采用非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段。本发明的APC基因，其序列如SEQ No. 28所示，突变发生在APC基因外显子15，3， 14序列，如下表； 本发明的试剂盒包括PCR引物、阴性对照品、PCR反应体系。所述的PCR引物，用 化学合成或PCR扩增获得的突变位点两端5-20个序列的模板，以及与之配对的反向序列。优选的，所述的PCR引物，下表所示的引物对
最优选的，所述的PCR引物为下表所示的引物对 反应体系中可以用阴性对照品来对照，阴性对照品为用常规方法从正常人组织中 提取获得的核酸，包括DNA和RNA。组织选自外周血、体液、腔道的脱落物、病变组织，以及 用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片。所述的PCR反应体系，包括PCR缓冲液、dNTP混合 液、荧光染料、MgCl2、Taq酶、DNA模板。PCR缓冲液，包括Tris C1，氯化钾，硫酸铵，氯化 镁；pH 8. 0-9. 0 (20°C )。所述的PCR缓冲液，包括10x缓冲液，终浓度15mM的氯化镁，终pH 8.7。dNTP 混合液，包括 10mM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混合液。所述的荧 光染料，包括EvaGreen饱和性染料、LC Green染料、ResoLight染料、SYT0 9染料。所述的MgC12，可以是 10-30mM MgC12。更优选的，所述的 MgC12 为 25mM MgC12。Taq酶，包括浓度5units/ul，反应底物为dNTP，ddNTP,延伸速率2_4kb/minat 72°C，存储缓冲液 10-40mM Tris cl，50_200mM 氯化钾(KCL)，0-5. OmM 二硫苏糖醇(DTT)， 0-1. OmM乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA),0-2. 0% (V/V)乙基苯基聚乙二醇(Nonidet)P-40， 0-2. 0% (V/V)吐温 20(Tween 20) ,30-70% (v/v)甘油(glycerol)，稳定剂(stabilizer) pH 7. 0-10. 0(20°C ) o所述的存储缓冲液,包括终浓度为20mM Tris cl、100mM KCLUmM DTT、0. ImM EDTA.0. 5% (V/V)Nonidet P-40,0. 5% (V/V)Tween 20,50% glycerol (v/v) 稳定剂的终pH值为9.0。所述的DNA模板，是用常规方法从患者组织中提取获得的核酸，包括DNA和RNA。 所述的患者组织选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变组织，以及 用这些组织制成的石蜡块、石蜡切片冰冻切片等。利用试剂盒进行检测时，包括PCR扩增和 HRM程序，其反应条件(PCR反应条件和HRM的条件)如下表所示 优选的PCR反应条件和HRM条件可以如下 本发明的试剂盒以及模板DNA在本发明所述的反应条件下在荧光定量PCR仪上进 行序列扩增，然后分析数据，运行溶解曲线观察是否单峰，再运行Genescan自动分析程序， 得到分型的图谱。所述的荧光定量PCR仪，其特征在于，包括LightCycler 480(罗氏公司， 巴塞尔，瑞士)、ABI 7500FAST(美国应用生物系统公司，纽约，美国)、ABI7900HT FAST(美 国应用生物系统公司，纽约，美国)、Qiagen Rotor-Gene 6000 (德国Qiagen公司，杜塞尔多 夫，德国)、Idaho LightScarmer(美国Idaho公司，爱达荷州，美国)。在使用时，将待测样本稀释到同一浓度，同时放入阴性对照，加入本发明的试剂盒，进行PCR反应，配套的基因 分型软件即可自动区分野生型与突变型。在本发明检测APC基因突变的试剂盒中，将待测样本稀释到同一浓度，同时做阳 性对照和阴性对照，加入试剂盒中相应的试剂，进行一次PCR反应，即可区分野生型与突变 型，可适用于APC基因第15外显子的第1061个密码子和1309个密码子及第十四外显子的 第47个密码子突变的检测。其中，所述的检测方法包括以下步骤(1)在血液包括细胞或血清或血浆、分泌物或是组织中提取核酸样本(2)用上述的试剂盒，以步骤(1)提取的核酸、阴性对照为模板，进行实时定量PCR 检测(3) PCR反应的条件和HRM条件如下表 分析数据，运行溶解曲线观察是否单峰，再运行Genescan自动分析程序，与阴性 对照参比，判断样本DNA中APC基因的各位点是否突变。本发明提供了一种检测APC基因突变的试剂盒在肿瘤诊断中的应用，通过检测待 测样本中是否存在APC基因特定的突变位点，而判断该个体发生癌症的可能。这将有利于 在临床上开展癌症患者的APC基因突变的筛查工作，为癌症患者的及早诊断和治疗提供服 务。所述的肿瘤，包括结直肠癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、皮肤癌、肉瘤、骨肉 瘤、血癌(即白血病)、淋巴癌、腺癌、脑瘤、视网膜母细胞瘤、鼻腔有鼻癌、鼻窦癌、口腔有舌 癌、牙龈癌、甲状腺癌、肺癌、肝癌、食道癌、上皮细胞癌、肉瘤、腺癌、淋巴细胞癌。优选的。所 述的肿瘤，包括结直肠癌，结肠腺癌，结直肠癌，乳腺癌，上皮性卵巢癌，肺癌。本发明采用高分辨熔解曲线(high-resolution melt,HRM)分析技术，对APC基因 突变和基因分型，该技术是一种高效稳健的post-PCR技术，不受突变碱基位点与类型的局 限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品基因型的分 析。这种方法因其操作简便、快速，使用成本低，结果准确，并且实现了真正的闭管操作。在本发明中，术语“试剂盒”是指用于PCR反应的混合物，它包括反应所需的缓冲 液(buffer)、dNTP混合液、引物、荧光染料、MgCl2、Taq酶。在本发明中，术语“引物”是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以 作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条件下可以诱发合成与核酸链相互补的 引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸脱氧核糖核酸及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆 转录酶)存在下，在一种合适的缓冲液并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单 股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但在一般在15 25个核苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板形成充分稳定的杂交复合物。 引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂交并引发DNA合成。引物设计应遵循以下原则1.引物应在核酸系列保守区内设计并具有特异性。 2.产物不能形成二级结构。3.引物长度一般在15 30碱基之间。4.G+C含量在40% 60%之间，Tm值最好接近72°C。5.碱基要随机分布。6.引物自身不能有连续4个碱基的 互补。7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。8.引物5'端可以修饰。9.引物3'端不 可修饰。10.引物3'端要避开密码子的第3位。11.引物3'端不能选择A，最好选择T。 12.扩增产物的单链不能形成二级结构。进行引物设计时，可以通过Primer Premier 5，Beacon Designer 7软件进行设 计，将设计好的序列通过人工合成方法得到。引物合成一般使用亚磷酰胺三酯法将DNA固 定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成 的，相邻的核苷酸通过3' -5'磷酸二酯键连接。其具体步骤可以是1、将预先连接在固 相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5 ‘-羟基的保护基团 DMT，获得游离的5'-羟基。2、合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮 唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶 液中游离的5'-羟基发生缩合反应。3、带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数 5'-羟基没有参加反应(少于2% )，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这 种短片段可以在纯化时分离掉。4、在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙 酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上 去。最后通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC，PAGE等手段纯化引 物。相对于现有技术中的方案，本发明的优点是由于采用上述技术方案，本发明的检测APC基因突变的试剂盒，采用新型突变研 究技术——高分辨率熔点曲线分析(High Resolution Melting Analysis，HRM)，无需序 列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限，应用含HRM模块的荧光定量 PCR仪器分析，参照阴性对照，即可完成对样品基因型的判断。本发明试剂盒灵敏度非常 高，可以使用在各种组织来源的基因组DNA如血细胞、口腔粘膜细胞和肿瘤组织，尤其是采 用非细胞体系血清或血浆来源的游离DNA片段，采用现有技术中的检测方法是不可能实现 的。


下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述图1为本发明实施例不同片段大小的引物进行PCR扩增得到的电泳图；图2为本发明实施例引物验证的电泳图；图3为本发明实施例阴性对照DNA的电泳鉴定图；图4为本发明实施例阴性对照DNA的测序结果图；图5为本发明实施例不同活性的酶进行PCR扩增的电泳图6为本发明实施例不同荧光染料的溶解曲线图；图7-1为本发明实施例不同MgC12终浓度进行PCR-HRM得到的PCR产物电泳图； 图7-2为本发明实施例不同MgC12终浓度进行PCR-HRM的溶解曲线图；图8为本发明实施例不同模板DNA来源的溶解曲线图；图9为本发明实施例检测突变的灵敏度实验溶解曲线图；图10为本发明实施HRM检测精度分析溶解曲线11为本发明应用例结直肠癌患者的石蜡切片模板DNA进行扩增后检测的溶解 曲线图。图12为本发明应用例结直肠癌患者的血浆模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线 图。图13为本发明应用例结直肠癌患者的血清模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线 图。图14为本发明应用例肺癌患者的血清模板DNA进行扩增后检测的溶解曲线图。
具体实施例方式以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做 进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。 实施例1引物的设计、合成和验证本实施例采用Primer 5设计引物，首先优化设计引物片段的大小，得到不同片段 大小引物PCR扩增的电泳图，结果如图1和下表所示。图la为5-10bp的引物PCR扩增的 电泳图，图lb为13-16bp的引物PCR扩增的电泳图，图lc为18-24bp的引物PCR扩增的电 泳图，图1 d为25-28bp的引物PCR扩增的电泳图，图1 e为30_37bp的引物PCR扩增的电泳 图，图If为39-45bp的引物PCR扩增的电泳图。由下表或图1可知，最佳引物为18-24bp
大小的引物。
引物大 小(bp)5-913-1618-2425-2930-3739-45特异性特异性很 差特异性差特异性好特异性较 好特异性 差特异性 很差 根据上面的大小范围，设计了以下引物对
11
这些序列由上海Invitrogen公司通过亚磷酰胺三酯法合成，然后进行引物验证。引物验证采用PAGE电泳鉴定，步骤如下使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺 凝胶进行电泳。取0. 2-0. 50D的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到 饱和，上样前加热变性(95°C，2minS)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易 加样。600V电压进行电泳，约2-3小时后，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，得到如 图2所示的电泳图。在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。实施例2阴性对照DNA的制作阴性对照DNA的提取抽取正常人外周血2. 5ml于枸橼酸纳(1 9)抗凝管中，使 用 TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO.，LTD)基因组 DNA 提取试剂盒，按照试 剂盒操作说明，提取DNA。定量使用Nano 1000定量仪，测定DNA浓度，合格指标1，符合0D 值 A260/A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0 要求之间，再将 DNA定量稀释到10ng/ul左右电泳鉴定结果如图3 ；对其进行测序鉴定，将提取的DNA进行PCR扩增后送上海英 潍捷基公司测序，测序结果显示所提取的DNA为正常人的，在APC基因上未发生突变，测序 结果如图4，上述鉴定结果表明，按上述方法所获得的DNA样品符合阴性对照的要求。实施例3肿瘤组织DNA的提取样本采集取新鲜组织块50 100mg以PBS或生理盐水清洗干净，所用组织必须 切至厚度在0. 5cm以下，放入装有1. 5ml体积RNAlater的冻存管中，充分混勻。(30分钟内 完成)；室温下放置1-2小时，4°C冰箱过夜，第二天转至-20°C长期保存。DNA 提取使用 TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO.，LTD)基因组 DNA提取试剂盒，按照试剂盒操作说明，提取DNA。DNA 纯化(若提取的 DNA, 0D 值 A260/A230 2. 0-2. 2 ；A260/A280 1. 8-2. 0，没有在标准范围内，则需要此步骤)加入等体积的氯仿-异戊醇(25 1)，向下翻转离心管 5min以充分混勻，13000rpm离心lOmin小心吸出上清液至另一 1. 5ml离心管；加入1/10体 积的醋酸钠(PH5. 2，3M)，再加入两倍上清液体积的无水乙醇，轻轻摇勻，沉淀DNA13000rpm 离心3min，轻轻倒去上清液，加入70 %乙醇洗一次，13000rpm,离心3min，去上清液，倒置 5-10min (倒置时间视DNA块状沉淀大小以及DNA干燥的速度决定，注意DNA不可太干燥，否 则DNA将难以被溶解，但离心管管壁的乙醇一定要除去)；加入30-60ul消毒三蒸水，用吸 管吹打使DNA充分溶解。实施例4血液中血浆DNA的提取采样1、抽取病人外周血l_2ml于枸橼酸纳(1 9)或EDTA抗凝管中，不用肝素抗凝管。2、吸抗凝管中部分的血液至离心管SOOOrpm离心5分钟，分离血浆和细胞。3、血浆小心移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞，-20度保存(1周)，管身标 示病人名字和编号，注明日期。DNA提取血浆Blood Mini kit试剂盒(德国QIAGEN公司生产)进行血液的提 取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20°C保存。实施例5血液中血清DNA的提取抽取病人外周血l-2ml至无抗凝的收集管，8000rpm离心5分钟，吸取血清移入另 一无菌管子，注意不要吸到白细胞，"20度保存(1周)，管身标示病人名字和编号，注明日期 即可。然后进行DNA提取，可以按照如下步骤血清用Blood Mini kit试剂盒(德国 QIAGEN公司生产)进行血液的提取，提取步骤参见试剂盒的说明书进行，其他涉及产品同 样处理，提取的DNA-20 V保存。实施例6石蜡切片组织DNA的提取刮削5-10 ym厚的切片1-5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2_3层)。用 二甲苯脱蜡后用QIAamp DNA FFPE Tissue kit (德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操 作说明提取DNA，其他涉及产品同样处理，提取的DNA-20°C保存。实施例7PCR、HRM条件的选择和优化1)热启动Taq酶的选择用不同厂家的酶进行实验，选择活性比较高的酶，结果如下表和图5，图5中1、2、 3、4 分别为 HotStarTaq 酶、FastStartTaq 酶、Taq CE DNA Polymerase、KAPA2G 快速热启动 DNA聚合酶的酶活性检测结果图，根据该图最终确定HotStarTaq酶和FastStartTaq酶的活
性最高。 2)选择合适的荧光染料用不同厂家的染料进行实验，选择结合效果好的染料；实验结果如图6所示，图6 中 1、2、3、4、5 分别为 Eva Green、LC Green、SYBRGreen、DAPI、Flamingo 荧光染料的实验结 果，据图可知最佳染料为Eva Green和LC Green。 3)PCR反应条件的优化在退火温度、Mgcl2浓度两方面PCR条件进行优化调整，结果如表 60°C时，MgCl2浓度为2. 0Mm,2. 5mM的实验图如图7_1和图7_2所示，可以看出，选
14择退火温度为60°C，Mgcl2终浓度为2. 5mM时为最佳的条件。4) HRM条件的优化从溶解的起始温度、每秒钟监测荧光的次数两方面对HRM条件进行优化调整，结
果如下表 从上表可知，最佳HRM条件为 5) DNA来源样本DNA来源选用外周血、口腔拭子、组织以及制成的石蜡切片这些方面，并对这些来 源的DNA进行检测，检测结果如下表和图8所示 图8Α D分别为外周血血浆、口腔、组织、石蜡切片的检测结果，由图可知，血清、 血浆、口腔拭子、组织和石蜡切片等提取的DNA均可用于本试剂盒检测。6)灵敏度实验实施例1 5获得的材料和优化的条件，确定检测的灵敏度。实验中，同时放入阴 性对照样本、突变样本、5%突变样本、10%突变样本、15%突变样本。本试剂盒与其它检 测方法灵敏度比较如图9和下表所示，经实验确定，试剂盒检测灵敏度最高可达到1%。其 他检测方法对照文献Mutation Research 635(2007) 105-117的检测方法灵敏度数据，如下 表所示，本试剂盒达到目前多种突变检测方法中最高灵敏度1%。 7)HRM检测精度分析用实施例1 5获得的材料和优化的条件，确定检测的精确度。实验中，用 APC-1309的引物检测肺癌患者石蜡切片组织，并与直接测序法相比较。本试剂盒和测序检 测对照的检测结果如下表所示，图10为分型图。
结论APC_1309引物检测40例石蜡组织切片样本实验中，本试剂盒检测出10例 样本检测有突变分型，实际测序有9例突变，HRM和测序检测成功率100%，阳性检测出率达 测序比较一致性100%，两种方法检测一致率为95%。从检测结果分析，HRM技术本试剂盒 检测突变的准确灵敏度超过测序。应用例1结直肠癌患者石蜡切片组织标本的基因扫描取结直肠癌患者的石蜡切片30例，提取DNA作为模板。使用仪器LlightCyClerTM 480荧光定量PCR仪器分析DNA模板提取1、刮削5-10 u m厚的切片1-5片(如果标本已暴露空气中，弃去最初的2-3层)。2、用QIAamp DNA FFPE Tissue kit (德国QIAGEN公司生产)，按照试剂盒的操作 说明提取DNA 采用的PCR反应体系 实时荧光定量PCR过程(LightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析) 检测结果如图11，图IlAUlB分别表示APC-1061、APC-1309的检测结果；用以上 优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，结果在结直肠癌病人中检出APC-1061 突变的有3例(检出率大约为10% )，APC-1309突变的有7例(检出率大约为23. 3% )， APC14突变的有1例(检出率大约为3. 33%)。符合国内外研究报道的结直肠癌中APC基 因突变的几率。应用例2结直肠癌患者血浆的基因扫描抽取病人(共20例)外周血l_2ml于枸橼酸钠(1 9)抗凝管中，吸取部分血液 至离心管SOOOrpm离心5分钟，分离血浆和细胞。血浆小心移入另一无菌管子，注意不要吸 到白细胞。提取血浆中的DNA作为模板。使用仪器LightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析
DNA模板提取1、将抗凝血8000转离心5分钟，取上层血浆。2、用Qiagen Blood Mini kit (德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明 提取血浆DNA。引物序列 采用的PCR反应体系 实时荧光定量PCR过程(LightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析)
检测结果如图12，图12A、12B分别表示APC-1061、APC-1309的检测结果；用以上 优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，结果在结直肠癌病人中检出APC-1061突 变的有2例(检出率大约为10% )，APC-1309突变的有5例(检出率大约为25% )，APC14 突变的有1例(检出率大约为5%)。符合国内外研究报道的结直肠癌中APC基因突变的几率。应用例3结直肠癌患者血清的基因扫描抽取病人(20例)外周血l_2ml于枸橼酸钠(1 9)抗凝管中，吸取部分血液至 离心管SOOOrpm离心5分钟，分离血清和细胞。血清小心移入另一无菌管子，注意不要吸到 白细胞。提取血清中的DNA作为模板。使用仪器LightCycler 480荧光定量PCR仪器分析DNA模板提取1、将抗凝血8000转离心5分钟，取上层血清。2、用Qiagen Blood Mini kit (德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明 提取血清DNA。引物序列 采用的PCR反应体系 实时荧光定量PCR过程(LightCyclerTM 480荧光定量PCR仪器分析) 检测结果如图13，图13A、13B分别表示APC-1061、APC-1309的检测结果；用以上 优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，结果在结直肠癌病人中检出APC-1061突 变的有2例(检出率大约为10% )，APC-1309突变的有4例(检出率大约为20% )，APC14 突变的有1例(检出率大约为5%)。应用例4肺癌患者血清的基因扫描抽取病人(30例)外周血l_2ml于非抗凝管中，吸取部分血液至离心管8000rpm 离心5分钟，分离血清和细胞。血清小心移入另一无菌管子，注意不要吸到白细胞。提取血 清中的DNA作为模板。使用仪器LightCycler 480荧光定量PCR仪器分析DNA模板提取1、将非抗凝血8000转离心5分钟，取上层血清。2、用Qiagen Blood Mini kit (德国QIAGEN公司生产)。按照试剂盒的操作说明 提取血清DNA。
引物序列 PCR反应体系 PCR和HRM反应条件 结果讨论检测结果如图14，图14A、14B分别表示APC-1061、APC-1309的检测结果；用以上 优化的PCR反应体系和条件对DNA样本进行检测，结果在肺癌病人中检出APC-1061突变的有2例(检出率大约为6. 67% )，APC-1309突变的有6例(检出率大约为20% )，APC14突 变的有1例(检出率大约为3. 33% )。 上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精 神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种检测APC基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增APC基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有APC基因的第15外显子或第14外显子中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述第15外显子具有SEQ ID No1的连续核苷酸序列；所述APCI4具有SEQ ID No29的连续核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的检测APC基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述连续 核苷酸序列为SEQ ID No 2 27序列之一的正向核苷酸序列或反向核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的检测APC基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述引物 为SEQ ID No 2 27序列之一的正向引物或反向引物。
4.根据权利要求1所述的检测APC基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂 盒还包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl2、TaqDNA聚合酶、模板DNA的PCR反应体系， 所述PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度1 10 X;dNTPs0. 01 1. 5mM弓丨物序列终浓度为0. 01 2 y M ；模板 DNA0. 01 10ng/ii L ；TaqDNA 聚合酶0. 01 1. 0U/ ii L ；MgC12终浓度为0. 5 5mM ；荧光染料1 3X。
5.根据权利要求1所述的检测APC基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述PCR 反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度1 5X;dNTPs0. 1 0. 5mM ；引物序列终浓度为0. 1 0. 5 y M ；模板 DNA0. 05 1. 5ng/ u L ；TaqDNA 聚合酶0. 01 0. 10U/ u L ；MgC12终浓度为1 3mM ；荧光染料1 2X。
6.根据权利要求1所述的检测APC基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述荧光 染料可选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、LCGreen PLUS染料、ResoLight染料、 SYT0 9 染料；所述 dNTP 混合液包括 10mM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 的混合 液；所述PCR缓冲液包括Tris cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20°C下pH值在8. 0-9. 0间。
7.—种检测APC基因外显子位点突变的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)设计并选取包括含有APC基因的第十五外显子APC15或第十四外显子APC14至少 15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列构成的若干个引物对；(2)提取模板DNA，利用步骤(1)得到的引物对对模板DNA中APC基因进行PCR扩增；(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的APC基因进行突变位点检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中提取模板DNA从选自外周 血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变新鲜组织、冰冻病变切片、石蜡病变 切片中提取，进行PCR反应的条件为92 97°C预变性4 15min ；92 97°C变性10 30s，56 60°C退火10 30s，70 75°C延伸10 30s，40 50个循环。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述步骤(2)和步骤(3)在荧光定量PCR 仪上进行，在荧光定量PCR仪上扩增后，运行溶解曲线进行基因扫描分析，所述高分辨率熔 解曲线法的条件为92 97°C变性lmin ；40°C复性lmin ；然后初始熔解温度60°C开始程序 升温熔解至95°C，并在溶解过程中实时检测荧光信号，30 50次每秒。
10.一种PCR反应试剂盒在肿瘤诊断相关的APC基因突变检测方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测APC基因突变的PCR反应试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括用于特异性扩增APC基因靶向序列的若干个引物对，所述引物对含有APC基因的第15外显子或第14外显子中至少15个连续的核苷酸构成的连续核苷酸序列，所述第15外显子具有SEQ ID No1的连续核苷酸序列；所述APC14具有SEQ ID No29的连续核苷酸序列。本发明的试剂盒采用饱和探针和高分辨率溶解曲线分析技术，完成对样品基因型的判断，从而诊断包括结直肠癌、肺癌、胰腺癌和胃癌等肿瘤。
文档编号G01N21/64GK101875970SQ20101013420
公开日2010年11月3日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者唐太清, 王弢, 秦勇, 陈菲 申请人:苏州工业园区为真生物医药科技有限公司