专利名称：一种观察植物根内部显微结构的方法
技术领域：
本发明涉及利用徒手切片技术对植物的根进行切片，经透明和染色处理，用光学显微镜来观察植物根的显微结构ー种观察植物根内部显微结构的方法。
背景技术：
对植物新鮮组织进行徒手切片可以用光学显微镜观察到植物内部的显微结构。药用植物许多都是以根茎为药用部位的，根的形态解剖学研究对于药用植物的分类、发育学、生态学、生理学等都是非常重要的。高清晰的显微结构图像的获取，必须是先得到高质量的切片，然后经过适当的透明和染色处理才能获得。 由于新鲜的植物材料难以长期保存，植物根要经过固定后才可以保存。然而现行的固定方法往往会造成植物组织的软化和收缩变形，因而造成切片的质量较差。常用的固定剂使用了甲醛，会造成植物根的细胞壁紫外光下強烈的自发荧光，同时也会影响荧光染料染色，因而难以清晰观察根的内部结构。现行的徒手切片，对植物切片进行透明处理通常采用的是水合氯醛，实践证明，水合氯醛处理后植物根的切片，在光学显微镜下观察仍不够清晰。对于植物细根进行切片时非常困难的，冰冻切片技术要用价格昂贵冰冻切片机来完成，石蜡切片技术过程复杂，需要长时间的包埋，而且其中使用的各种包埋剂往往使得许多染料难以渗入植物材料，因而无法清晰观察到根的内部结构，如内皮层、外皮层、凯氏带
坐寸o

发明内容
针对上述问题，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种观察植物根内部显微结构的方法，可有效解决用光学显微镜清晰观察植物根的内部结构问题。本发明解决的技术方案是首先，对根进行处理，将挖出植物的根，清洗后剪成小段，再将根用甲醇固定，然后，用琼脂糖溶液包埋，冷却凝固后修成小块，徒手切片后，选择出高质量的切片，置于容器内的蒸馏水中，再进行乳酸透明，盖好，用小檗碱或荧光黄染色后用水漂洗，再用甲苯胺蓝0或番红0进行后染色，再用水漂洗，水封片后，用倒置荧光显微镜观察并摄像，可以得到清晰的图像，实现观察植物根内部显微结构，有效用于药物植物的分类、发育学、生态学、生理学的研究。本发明方法简单，操作容易，成本低，工作量小，成功率高，效果好的特点，是药用植物研究内部结构上的创新，可以用于对根形态解剖的研究，和现行的方法比较，本方法对于植物较细的根切片更为简单有效，可以节约时间，由于使用的是落射荧光，对于切片的厚度要求不高，针对不同的植物材料染料种类和染色时间做出选择和调整后可以达到最佳的效果，也可适用于对茎和叶等材料的徒手切片观察。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明的具体方式作详细说明。
本发明在具体实施中，由以下实施例给出的具体步骤实现
(1)、根的处理，从土壤中挖取植物的根，用清水洗浄，再用剪刀修成5-10mm的小段根；所述植物的根为药用植物的根；
(2)、对小段根用甲醇固定，方法是，将小段根浸入甲醇中固定l-6h，杀死细胞，保持细胞的性状，使组织不易变形，放在冰箱中4°C下保存，备用；
(3 )、琼脂糖溶液包埋，对步骤(2 )处理后的小段根放入铝箔模子中，每个铝箔模子中平行放置2-4个小段根，铝箔模子的规格为高10-15_，长和宽10-20_，每个铝箔模子中加入40-550C的浓度为4-9%的琼脂糖溶液，琼脂糖溶液高度小于铝箔模子的高度，为8-12 mm,冷却至室温后凝固成琼脂糖凝胶块；所述的浓度为4-9%的琼脂糖溶液，是由4-9g的琼脂糖加水至IOOmL制成；
(4)、将琼脂糖凝胶块修成小块，方法是，从铝箔模子中取出步骤(3)中凝固成的琼脂糖凝胶块，用刀片切割、修整成厚度6-10 mm，长和宽各6-10 mm的凝胶小块，，每个凝胶小块中有一小段根，凝胶小块的上、下两面和与根长轴垂直；
(5)、徒手切片，用刀片将凝胶小块横切成厚度0.2-0. 5mm的切片，将切片置入装有蒸馏水的培养皿中，备用；
(6)、乳酸透明，方法是，在容器(如称量瓶)中加0.5-1. 5mL的透明剂，将步骤(5)中制成的切片从培养皿的蒸馏水中转入装有透明剂的容器中，用玻璃片盖好，在65-75°C的水内水浴 0. 5-1. 5 h ；
所述的透明剂是由乳酸和浓度为50%的水合氯醛制成的溶液，乳酸和浓度50%水合氯醛的体积比为I : 1，浓度50%的水合氯醛是由水合氯醛50g加水至IOOmL制成；
(7)、染色，方法是，将步骤(6)乳酸透明后的切片从乳酸溶液中取出放入另备的容器(如称量瓶)中，加入0. 5-1. 5mL浓度为0. 05-0. 2% (w/v)的小檗碱，或者加0. 5-1. 5mL浓度为0. 01% (w/v)的荧光黄088，在65-75°C的水内水浴染色0. 5-1. 5 h ；
所述的浓度为0. 05-0. 2% (w/v)的小檗碱，是由0. 05-0. 2g小檗碱加乳酸至IOOmL制成；所述的浓度为0.01% (w/v)的荧光黄088，是由0. Olg荧光黄088加乳酸至IOOmL制成；
(8)、后染色，方法是，取出步骤(7)染色后的切片，用水漂洗脱色后，再用浓度
0.05-0. 2% (w/v)的甲苯胺蓝0溶液或浓度0. 1-0. 5%番红0溶液染色l_3min，用水漂洗干净后，用水封片；
所述的浓度0. 05-0. 2% (w/v)的甲苯胺蓝0溶液，是由0. 05-0. 2g甲苯胺蓝0加水至IOOmL制成；所述的浓度0. 1-0. 5%番红0溶液，是由0. 1-0. 5g番红0加水至IOOmL制成；
(9)、显微镜观察，用倒置荧光显微镜(落射光)观察照相，将同一切片同一视野下分别用亮光和紫外光分别照相，利用操作及分析软件的图像叠加功能，将图像叠加后可以得到清晰完整的图像。在上述各步骤的具体实施中，所述的步骤(I)中药用植物的根用剪刀修成5-10mm的小段根，在具体的实施中，可以是修成5-6mm、7-8mm、9-10mm的小段根，或修成5. 5mm、7. 5mm、9. 5mm的小段根；
所述的步骤(2)中小段根用甲醇固定l_6h，在具体实施中，可固定l-2h、3-4h、5-6h，或
1.5h、3. 5h、5. 5h ；
所述的步骤(3)中铝箔模子的高10-llmm、长10-12mm、宽10_12mm，每个铝箔模子中平行放置两个小段根，铝箔模子中加入40°C、4%琼脂糖溶液，琼脂糖溶液的高度为8-9mm，所述的4%琼脂糖溶液是由琼脂糖4g加水至IOOmL制成；所述的铝箔模子还可以是高12-13mm、长、宽均为13-16臟，每个铝箔模子中平行放置3个小段根，铝箔模子中加入45°C、6%琼脂糖溶液，琼脂糖溶液的高度为10-llmm，所述的6%琼脂糖溶液是由琼脂糖6g加水至IOOmL制成；在具体实施时，所述的铝箔模子还可以是高14-15mm、长、宽均为17_20mm，每个铝箔模子中平行放置4个小段根，铝箔模子中加入55°C、9%琼脂糖溶液，琼脂糖溶液的高度为ll_12mm，所述的9%琼脂糖溶液是由琼脂糖9g加水至IOOmL制成；
所述的步骤(6)乳酸透明在具体实施中，是在ー个称量瓶中加入0. 5mL的透明剂，将步骤(5)中制成的切片从培养皿的蒸馏水中转入装有透明剂的称量瓶中，用玻璃片盖好，在65-67°C的水内水浴1-1. 5 h ；
乳酸透明在具体实施中，还可在一个称量瓶中加入ImL的透明剂，将步骤(5)中制成的 切片从培养皿的蒸馏水中转入装有透明剂的称量瓶中，用玻璃片盖好，在68-70°C的水内水浴 0. 8-1 2h ；
乳酸透明在具体实施中，还可是在一个称量瓶中加入I. 5mL的透明剂，将步骤(5)中制成的切片从培养皿的蒸馏水中转入装有透明剂的称量瓶中，用玻璃片盖好，在71-75°C的水内水浴0. 5-1 h ；
所述的步骤(7)染色在具体实施中，是将步骤(6)乳酸透明后的切片从乳酸溶液中取出放入另备的称量瓶中，加入0. 5mL浓度为0. 2% (w/v)的小檗碱，或者加0. 5-1. 5mL浓度为0.01% (w/v)的荧光黄088，在65-67°C的水内水浴染色I-L 5 h ；
染色在具体实施中，还可将步骤(6)乳酸透明后的切片从乳酸溶液中取出放入另备的称量瓶中，加入ImL浓度为0. 1% (w/v)的小檗碱，在68-70°C的水内水浴染色0. 8-1. 2h ；染色在具体实施中，还可将步骤(6)乳酸透明后的切片从乳酸溶液中取出放入另备的称量瓶中，加入I. 5mL浓度为0.05% (w/v)的小檗碱，在71_75°C的水内水浴染色0. 5_1 h。本发明方法经多次反复试用和实验均取得了相同或相近的结果，表明方法稳定可靠，观察结果清晰，根的内部结构可以看清，与现有方法相比，具有取材少，节约试剂，成本低，可节约资材和成本50%以上，实验时间短，工作量小，观察结果比已有的方法的效果都好，成功率高，大大提高工作效率，可有效用于各类植物根的观察，特别是根类药用植物的分类、植物生态学、植物生理学相关的形态解剖学研究有重要的价值。本发明有三大特点，ー是利用甲醇作为固定剂，可以保持根的弾性，也不会影响细胞壁的荧光染色和观察。ニ是利用琼脂糖凝胶包埋材料，琼脂糖只是起到一个机械支持作用，不会渗进植物组织内部，对于植物材料染色影响甚微。该方法也可以用于地上部分材料的切片，如茎、叶等。三是利用乳酸透明和作为染料的溶剂，乳酸分子量小，滲透快，透明效果好，又能减小透明和染色中的细胞内外渗透压力差，较小引起材料变形。特别是找到ー种针对植物细根徒手切片和染色的简易方法是其他方法无可相比的，为药物植物的分类、发育学、生态学、生理学的研究提供了有效的技术手段，经济和社会效益巨大。
权利要求
1.一种观察植物根内部显微结构的方法，其特征在于，由以下步骤实现 (1)、根的处理，从土壤中挖取植物的根，用清水洗净，再用剪刀修成5-10mm的小段根；所述植物的根为药用植物的根； (2)、对小段根用甲醇固定，方法是，将小段根浸入甲醇中固定l-6h，杀死细胞，保持细胞的性状，使组织不易变形，放在冰箱中4°C下保存，备用； (3 )、琼脂糖溶液包埋，对步骤(2 )处理后的小段根放入铝箔模子中，每个铝箔模子中平行放置2-4个小段根，铝箔模子的规格为高10-15_，长和宽10-20_，每个铝箔模子中加入40-550C的浓度为4-9%的琼脂糖溶液，琼脂糖溶液高度小于铝箔模子的高度，为8-12 mm,冷却至室温后凝固成琼脂糖凝胶块；所述的浓度为4-9%的琼脂糖溶液，是由4-9g的琼脂糖加水至IOOmL制成； (4)、将琼脂糖凝胶块修成小块，方法是，从铝箔模子中取出步骤(3)中凝固成的琼脂糖凝胶块，用刀片切割、修整成厚度6-10 mm，长和宽各6-10 mm的凝胶小块，，每个凝胶小块中有一小段根，凝胶小块的上、下两面和与根长轴垂直； (5)、徒手切片，用刀片将凝胶小块横切成厚度O.2-0. 5mm的切片，将切片置入装有蒸馏水的培养皿中，备用； (6)、乳酸透明，方法是，在容器中加O.5-1. 5mL的透明剂，将步骤(5)中制成的切片从培养皿的蒸馏水中转入装有透明剂的容器中，用玻璃片盖好，在65-75 V的水内水浴O.5-1. 5 h ； 所述的透明剂是由乳酸和浓度为50%的水合氯醛制成的溶液，乳酸和浓度50%水合氯醛的体积比为I : 1，浓度50%的水合氯醛是由水合氯醛50g加水至IOOmL制成； (7)、染色，方法是，将步骤(6)乳酸透明后的切片从乳酸溶液中取出放入另备的容器中，加入O. 5-1. 5mL浓度为O. 05-0. 2%的小檗碱，或者加O. 5-1. 5mL浓度为O. 01%的荧光黄088，在65-75°C的水内水浴染色O. 5-1. 5 h ； 所述的浓度为O. 05-0. 2%的小檗碱，是由O. 05-0. 2g小檗碱加乳酸至IOOmL制成；所述的浓度为O. 01%的荧光黄088，是由O. Olg荧光黄088加乳酸至IOOmL制成； (8)、后染色，方法是，取出步骤(7)染色后的切片，用水漂洗脱色后，再用浓度O.05-0. 2%的甲苯胺蓝O溶液或浓度O. 1-0. 5%番红O溶液染色l_3min，用水漂洗干净后，用水封片； 所述的浓度O. 05-0. 2%的甲苯胺蓝O溶液，是由O. 05-0. 2g甲苯胺蓝O加水至IOOmL制成；所述的浓度O. 1-0. 5%番红O溶液，是由O. 1-0. 5g番红O加水至IOOmL制成； (9)、显微镜观察，用倒置荧光显微镜观察照相，将同一切片同一视野下分别用亮光和紫外光分别照相，利用操作及分析软件的图像叠加功能，将图像叠加后可以得到清晰完整的图像。
2.根据权利要求I所述的观察植物根内部显微结构的方法，其特征在于，所述的步骤Cl)中药用植物的根用剪刀修成5-6mm，或7-8mm，或9-10mm的小段根。
3.根据权利要求I所述的观察植物根内部显微结构的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中小段根用甲醇固定时间为l_2h，或3-4h，或5-6h。
4.根据权利要求I所述的观察植物根内部显微结构的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中铝箔模子的高10-llmm、长10_12mm、宽10_12mm，每个铝箔模子中平行放置两个小段根，铝箔模子中加入40°C、4%琼脂糖溶液，琼脂糖溶液的高度为8-9mm ;或铝箔模子高为12-13mm、长、宽均为13_16mm，每个铝箔模子中平行放置3个小段根，铝箔模子中加入.45°C、6%琼脂糖溶液，琼脂糖溶液的高度为10-llmm;或铝箔模子高为14_15mm、长、宽均为.17-20mm,每个铝箔模子中平行放置4个小段根，铝箔模子中加入55°C、9%琼脂糖溶液，琼脂糖溶液的高度为ll_12mm。
5.根据权利要求I所述的观察植物根内部显微结构的方法，其特征在于，所述的步骤(6)乳酸透明是在一个称量瓶中加入O. 5mL的透明剂，将步骤(5)中制成的切片从培养皿的蒸馏水中转入装有透明剂的称量瓶中，用玻璃片盖好，在65-67°C的水内水浴1-1. 5h ； 或在一个称量瓶中加入ImL的透明剂，将步骤(5)中制成的切片从培养皿的蒸馏水中转入装有透明剂的称量瓶中，用玻璃片盖好，在68-70°C的水内水浴O. 8-1 . 2h ； 或在一个称量瓶中加入I. 5mL的透明剂，将步骤(5)中制成的切片从培养皿的蒸馏水中转入装有透明剂的称量瓶中，用玻璃片盖好，在71-75 °C的水内水浴O. 5-lh。
6.根据权利要求I所述的观察植物根内部显微结构的方法，其特征在于，所述的步骤(7)染色是将步骤(6)乳酸透明后的切片从乳酸溶液中取出放入另备的称量瓶中，加入.O.5mL浓度为O. 2%的小檗碱，或者加O. 5-1. 5mL浓度为O. 01%的荧光黄088，在65_67°C的水内水浴染色1-1. 5h ； 或将步骤(6)乳酸透明后的切片从乳酸溶液中取出放入另备的称量瓶中，加入ImL浓度为O. 1%的小檗碱，在68-70°C的水内水浴染色O. 8-1. 2h ； 或将步骤(6)乳酸透明后的切片从乳酸溶液中取出放入另备的称量瓶中，加入I. 5mL浓度为O. 05%的小檗碱，在71-75°C的水内水浴染色O. 5-lh。
全文摘要
本发明涉及观察植物根内部显微结构的方法，可有效解决用光学显微镜清晰观察植物根的内部结构问题，方法是，首先，将挖出植物的根，清洗后剪成小段，再将根用甲醇固定，然后，用琼脂糖溶液包埋，冷却凝固后修成小块，徒手切片后，置于容器内的蒸馏水中，再进行乳酸透明，盖好，用小檗碱或荧光黄染色后用水漂洗，再用甲苯胺蓝O或番红O进行后染色，再用水漂洗，水封片后，用倒置荧光显微镜观察并摄像，可以得到清晰的图像，实现观察植物根内部显微结构，有效用于药物植物的分类、发育学、生态学、生理学的研究，本发明方法简单，操作容易，成本低，工作量小，成功率高，效果好，可以用于对根形态解剖的研究，对于植物较细的根切片更为简单有效。
文档编号G01N1/30GK102768209SQ201210275738
公开日2012年11月7日 申请日期2012年8月6日 优先权日2012年8月6日
发明者冯卫生, 刘孟奇, 王小巧, 董诚明, 陈随清 申请人:河南中医学院