专利名称：一种肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是用于肠道病毒71型(Enter0VirUS71，简称 EV71)特异性抗体的定性或定量检测，通过酶联免疫吸附测定肠道病毒71型抗体的检测方法。
背景技术：
肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹。引起手足口疾病的主要致病原是肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16。大量的流行病学研究表明，肠道病毒71型病毒的感染多发生于5岁以下的婴幼儿，其感染可能引起多种与神经系统相关的严重疾病，包括致死脑炎、无菌性脑膜炎和急性麻痹等。因而，对EV71病毒的特异性诊断具有非常重大的临床意义。EV71病毒属于小核糖核酸(RNA)病毒科肠道病毒属的成员，其病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在M 30nm。病毒粒子的衣壳由60 个亚单位构成，后者由4种衣壳蛋白(VP1-VP4)拼装成五聚体样，抗原决定簇基本上位于 VP1-VP3上。病毒衣壳与病毒毒力有关，而由297个氨基酸组成的VPl结构蛋白，其大部分结构暴露于病毒表面，含有EV71病毒的重要抗原表位，可以诱发机体产生特异性的EV71中和抗体。因此，可以利用这些特异性的抗原表位来捕获机体中的特异性抗体，从而实现特异性抗体的检测。目前，针对EV71病毒的特异性检测方法包括病毒分离、核酸分子生物学检测和血清学检测。病毒分离常用的细胞系有Vero、RD、!fep-2细胞。目前发现Vero细胞分离病毒的阳性率最高。用于病毒分离的样本有咽拭子、肛拭或粪便、脑脊液、血清及囊泡液。有研究显示病毒分离阳性率最高的样本是咽拭子，可达90% -95% ；其次是肛拭样本，约为 40% -50%;囊泡液也有较高的阳性率，而脑脊液的病毒分离率很低。病毒分离的缺点是繁杂费时，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。核酸分子生物学检测方法具有较高的敏感度和特异性，包括RT_PCR(反转录聚合酶链反应)和荧光定量RT-PCR检测方法。与其他肠道病毒一样，PCR检测主要针对EV71的 VPl区保守的核苷酸序列设计引物和探针。采用半巢式RT-PCR直接从样本中检测EV71，检出率可达53 %。荧光定量RT-PCR方法特异度达100 %，可检测5个拷贝病毒量，可用于直接检测样本。与普通RT-PCR相比，由于其污染可能性小，手上操作时间少，为EV71的快速检测提供了有效手段。但是该方法操作较为复杂，对操作人员的要求较高，且标本中的杂质可能引起聚合酶的失活等问题，在实际的应用过程中存在一些问题，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。血清学检测包括中和试验和ELISA检测方法。其中最常用方法目前仍是中和实验，但该方法的灵敏度和特异性较差。而且该方法在检测过程中需要进行细胞培养，从而导致试验周期变长，往往需要1个月左右的时间才能得到结果，在实际的应用过程中存在一定的局限性。与血清中和试验相比，运用ELISA方法对EV71进行特异性的检测，具有较好的灵敏度和特异性其方法简便、快速，具有很好的应用前景。

发明内容
本发明的目的是利用EV71特异性的抗原作为固定包被抗原，建立一种特异性检测肠道病毒71型抗体的方法，利用间接酶联免疫吸附法(ELISA)，提供一种特异性好、灵敏度高、使用方便、检测快速的肠道病毒71型抗体的检测方法，可以用于血清中肠道病毒71 型抗体检测及效价测定，能适用于大规模的血清学和流行病学调查。本发明肠道病毒71型(Enterovirus 71，简称EV71)特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)的方法，将制备的EV71病毒抗原固定到酶标板上，通过抗原抗体的特异性吸附来实现抗体的检测。由于包被的抗原包含EV71病毒的特异性抗原表位，因而能用来检测出血清中EV71病毒的特异性抗体，从而减少血清检测的假阳性。本发明适合对大批量动物或人体血清标本进行检测，适用于大规模的血清学和流行病学调查。本发明肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，将纯化的肠道病毒71型(EV71)病毒颗粒，合成的病毒样颗粒(VLP)抗原，合成的含病毒特异性抗原表位的多肽固定到酶标板上，通过间接酶联免疫吸附的方法进行测定，其中合成的含病毒特异性抗原表位的多肽主要含有EV71病毒的162-177氨基酸位点、208-222氨基酸位点以及 240-260氨基酸位点。本发明采用间接酶联免疫吸附法，通过固定EV71抗原-待测血清-酶标抗体这样一个模型(见图1)来实现。即将EV71抗原固定在酶标板孔上，随后加入待测血清，用相应的酶标抗体指示显色。本发明提供一种肠道病毒71型抗体的检测方法的技术方案，具体步骤如下A.酶标板的预制A. 1EV71抗原的固定用碳酸盐缓冲液(pH9. 6)将EV71病毒特异性抗原稀释至 1 5微克/毫升，按50 100微升/孔的量，加入酶标板的孔中，放于4°C孵育过夜，用磷酸盐缓冲液(PBQ洗液洗板3 5次；A. 2酶标板的封闭用封闭液按200微升/孔的量加入步骤A. 1的酶标板孔中， 37°C孵育1 2小时，PBS洗液洗板3 5次；A. 3加保护剂用5%蔗糖按100 200微升/孔的量，加入步骤A. 2酶标板的孔中，37°C孵育0.5 1小时，拍干，4度储存待用；B.用含有牛血清白蛋白(BSA)的PBS将血清作不同的稀释度，按50 100微升/孔的量，加入步骤A. 3酶标板的孔中，同时设立阴性孔，阳性孔和空白孔，37°C孵育1 2小时，PBS洗液洗板3 5次；C.按50 100微升/孔的量，在步骤B的酶标板的各孔中，加入酶标抗体，放入 37°C孵育0. 5 1小时，PBS洗液洗板3 5次；D.按50 100微升/孔的量，在步骤C的酶标板的各孔中，加入邻苯二胺(OPD) 显色液，放入湿盒中，于37°C保温10 20分钟；E.按50 100微升/孔的量，在步骤D的酶标板的各孔中，加入终止液，而后置于酶标仪上，在492nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度OD值，即得到检测结果。
上述Α. 1步骤所述的EV71病毒特异性抗原为本公司自制。上述Α. 1步骤所述EV71病毒特异性抗原将纯化的肠道病毒71型病毒颗粒，合成的病毒样颗粒抗原，合成的含病毒特异性抗原表位的多肽作为固定抗原。上述Α. 3步骤所述的添加5%蔗糖作为稳定保护剂。上述C步骤所述的酶标抗体为市购。所述洗板为用磷酸盐缓冲液洗液在洗板机上洗板或者手工洗板。所述磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液洗液、碳酸盐缓冲液、邻苯二胺显色液、终止液、 封闭液均为现有技术的常规用液。该方法用于血清中肠道病毒71型特异性抗体的定性或定量检测，减少血清检测的假阳性。


图1为本发明实验模型。图2为小鼠血清中肠道病毒71型抗体测定结果。图3为人体肠道病毒71型阴、阳性血清标本中特异性抗体测定结果比较。图4为不同年龄段正常人群血清的EV71抗体阳性率结果。本发明具有以下优点和效果根据上述方案，采用EV71病毒特异性抗原作为固定相，来检测血清样本中的EV71特异性抗体水平，从而判断机体针对EV71的免疫状况，该方法有助于提高抗体检测的特异性和灵敏度，减少假阳性的产生。本发明操作简单，试验周期短，全程实验不超过2小时，适用于大批量样本筛查，便于进行大规模的血清学和流行病学调查。
具体实施方案实施例1固定纯化EV71病毒抗原检测小鼠血清中的EV71抗体效价1)用碳酸盐缓冲液(ρΗ9. 6)将纯化的EV71病毒抗原稀释至2微克/毫升，按100 微升/孔的量加入酶标板孔中，置于4°C孵育过夜，PBS洗液洗板3次；2)用封闭液按200微升/孔的量加入酶标板孔中，37°C孵育1小时，PBS洗液洗板 3次；3)用5%蔗糖按100微升/孔的量，加入酶标板孔中，37°C孵育0. 5 1小时，拍
干，4度储存待用；4)用0. 9%生理盐水将待测血清稀释10倍，再用含有1 % BSA的PBS将血清作一系列的稀释度1 20、1 40、1 80、1 160,1 320,1 640,1 1280,1 2560，按 100微升/孔的量，加入预制备的酶标板的孔中，37°C孵1小时，PBS洗液洗板4次，同时设立阴性对照孔2个，和空白孔1个；5)按100微升/孔的量，在步骤4)所述的酶标板的各孔中，加入酶标抗体，放入 37°C孵育0. 5小时，PBS洗液洗板3 5次；6)按100微升/孔的量，在步骤幻所述的酶标板的各孔中，加入邻苯二胺显色液， 放入湿盒中，于37°C保温15分钟；
7)按50微升/孔的量，在步骤6)所述的酶标板的各孔中，加入终止液，而后置于酶标仪上，在492nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，即得到检测结果(结果见表 1和图2)。8)判定结果阴性对照空的平均值为0. 06故域值(Cutoff)值=0.06X2. 1 = 0. 126按照样品的A值彡域值(Cutoff)值，该样品判定为阳性样品；样品的A值 < Cutoff值，该样品判为阴性。则本样品1 20 1 1280稀释度均为阳性，1 2560 为阴性，因此，该血清中EV71抗体的效价为1 1观0。所用溶液如下1、包被缓冲液(0. 05M碳酸盐缓冲液，PH9. 6)碳酸钠1. 59克，碳酸氢钠2. 93克， 加蒸馏水至1000毫升。2、磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.4)磷酸二氢钾0. 2克，磷酸氢二钠2. 9克，氯化钠8. 0 克，氯化钾0. 2克，Tween-200. 5毫升，加蒸馏水至1000毫升。3、PBS洗液1000毫升磷酸盐缓冲液中，加入0. 5毫升吐温20。4、封闭液100毫升PBS洗液中加入1克牛血清白蛋白，溶解混勻。5、OPD显色液称取20mg邻苯二胺，溶于50毫升0. 1摩尔浓度/升pH 5.0的柠檬酸钠-磷酸盐缓冲液，再加入20微升双氧水，混勻后避光保存。6、终止液(2N硫酸)取浓硫酸10毫升，缓慢加入80毫升水中，冷却待用。表1、小鼠血清中肠道病毒71型抗体测定结果(A4i32值)
权利要求
1.一种肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于将纯化的肠道病毒71型病毒颗粒，合成的病毒样颗粒抗原，合成的含病毒特异性抗原表位的多肽固定到酶标板上，通过间接酶联免疫吸附的方法进行测定。
2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于具体步骤如下A.酶标板的预制A. 1EV71病毒抗原的固定用碳酸盐缓冲液(pH9. 6)将纯化的EV71病毒抗原稀释至 1 5微克/毫升，按50 100微升/孔的量，加入酶标板的孔中，放于4°C孵育过夜，用磷酸盐缓冲液(PBQ洗液洗板3 5次；A. 2酶标板的封闭用封闭液按200微升/孔的量加入步骤A. 1的酶标板孔中，37°C孵育1 2小时，PBS洗液洗板3 5次；A.3加保护剂用5%蔗糖按100 200微升/孔的量，加入步骤A. 2酶标板的孔中， 37°C孵育0. 5 1小时，拍干，4度储存待用；B.用含有牛血清白蛋白(BSA)的PBS将血清作不同的稀释度，按50 100微升/ 孔的量，加入步骤A. 3酶标板的孔中，同时设立阴性对照，阳性对照和空白孔，37°C孵育1 2小时，PBS洗液洗板3 5次；C.按50 100微升/孔的量，在步骤B的酶标板的各孔中，加入酶标抗体，放入37°C 孵育0. 5 1小时，PBS洗液洗板3 5次；D.按50 100微升/孔的量，在步骤C的酶标板的各孔中，加入邻苯二胺显色液，放入湿盒中，于37°C保温10 20分钟；E.按50 100微升/孔的量，在步骤D的酶标板的各孔中，加入终止液，而后置于酶标仪上，在492nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度OD值，即得到检测结果。
3.根据权利要求1所述的肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于含有病毒特异性抗原表位的多肽抗原用作固定抗原。
4.根据权利要求2所述的肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于A. 3步骤所述的添加5%蔗糖作为稳定保护剂。
5.根据权利要求2所述的肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于洗板用磷酸盐缓冲液洗液在洗板机上洗板或手工洗板。
6.根据权利要求2所述的肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液洗液、碳酸盐缓冲液、终止液、邻苯二胺显色液、封闭液为常规用液。
7.根据权利要求1所述的肠道病毒71型特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法，其特征在于用于血清中肠道病毒71型特异性抗体的定性或定量检测。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，特别是用于血清中肠道病毒71型(Enterovirus 71，简称EV71)特异性抗体的酶联免疫吸附检测方法。通过间接酶联免疫吸附法(ELISA)的方法，将制备的EV71病毒抗原固定到酶标板上，通过抗原抗体的特异性吸附来实现抗体的检测。由于包被的抗原包含EV71病毒的特异性抗原表位，因而能用来检测出血清中EV71病毒的特异性抗体，从而减少血清检测的假阳性。本发明适合对大批量动物或人体血清标本进行检测，适用于大规模的血清学和流行病学调查。
文档编号G01N33/543GK102539776SQ201010594390
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者周康凤, 唐彩华, 姜云水, 庄昉成, 朱莲, 毛子安, 毛子旭, 毛江森, 王一虎, 罗永能, 高丽美, 高孟 申请人:浙江普康生物技术股份有限公司