专利名称：功能食品中氯霉素残留的hplc-ms-ms检测方法
技术领域：
本发明涉及一种功能性食品中氯霉素残留的检测方法。
背景技术：
改革开放以来，功能性食品行业作为21世纪的朝阳产业愈来愈呈现出勃勃生机，功能性食品也逐渐走进了广大人民群众的生活，对促进机体健康、改善亚健康、祛除疾病等方面发挥了重要作用。动物源性功能性食品如:钙粉、奶粉、蛋白粉和蜂蜜等的生产制备多以畜牧、水产动物产品和半成品为原料，而氯霉素因其对革兰阳性、阴性细菌均有抑制作用，且对后者的作用较强，其中对伤寒杆菌、流感杆菌、副流感杆菌和百日咳杆菌的作用比其他抗生素强，对立克次体感染如斑疹伤寒也有效，因此广泛应用于预防和治疗家畜及水产品的细菌感染性疾病，这就有可能使家畜及水产品中有氯霉素残留。氯霉素对人体的毒害作用主要包括:①主抑制骨髓造血机能。可引起血小板减少性紫殿、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血、溶血性等，多数在长期或多次用药的过程中发生。症状有二:一为可逆的各类血细胞减少，其中粒细胞首先下降，这一反应与剂量和疗程有关，一旦发现，及时停药，可以恢复。二是不可逆的再生障碍性贫血，虽然少见，但死亡率高，此反应属于变态反应，与剂量疗程无直接关系。②氯霉素也可产生胃肠道反应和二重感染。③新生儿与早产儿剂量过大可发生循环衰竭(灰婴综合征)。④可引起视神经炎、视力障碍、多发性神经炎、神经性耳聋以及严重失眠。有时发生中毒性精神病，主要表现为幻视、幻听、定向力丧失、精神失常等。少数患者可出现皮疹及血管神经性水肿等过敏反应，但都比较轻微。据报道，氯霉素在组织中的残留浓度能超过lmg/kg，对食用者威胁很大。已有I例儿童服用2mg氯霉素和老年妇女使用氯霉素眼膏后死亡的报道。发达国家对氯霉素检出限的要求越来越严格，对氯霉素残留的要求是不得检出，检出限量欧盟由原来的10 μ g/kg改为I μ g/kg,继而又降至0.1 μ g/kg,比原标准要求提高了 100倍；美国FDA规定的检出限也由原来的5 μ g/kg降为0.3 μ g/kg,且目前正在研究应用更为灵敏的方法，可使检出限值达0.1 μ g/kg。而因为氯霉素残留超标而被国外查处的事件报道屡见不鲜。美国食品药品管理局(FDA) 2011年6月11日宣布，从费城一个集散中心查获64大桶，价值3万2千美元从中国进口的蜂蜜。这些蜂蜜含有一种烈性的抗生素(氯霉素)，可能导致人重病或死亡。近年来各种关于氯霉素残留的检测方法不断涌现，大致可分为三大类:第一类是生物测定法，第二类是理化分析法，第三类是兼有生物和化学的酶联免疫检测法。功能性食品中成分比较复杂，大多含有多种不同成分，这就给检测其中的氯霉素残留带来困难。目前，功能性食品中氯霉素残留检测尚未有文献报道。

发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种功能食品中氯霉素残留的HPLC-MS-MS检测方法。本发明的检测方法概述如下:一种功能食品中氯霉素残留的HPLC-MS-MS检测方法，包括如下步骤:(I)称取Ig试样，精确至0.0lg，置于50mL离心管中，加入15 μ L浓度为0.4 μ g/mL的氘代氯霉素作内标溶液，加入15mL乙酸乙酯0.45mL氢氧化铵，5g无水硫酸钠，匀质提取30s,以4000r/min离心5min,上清液转移至IOOmL鸡心瓶中；(2)取第二个50mL离心管，加入15mL乙酸乙酯和0.45mL氢氧化铵作为洗涤液，洗涤步骤(I)匀质操作时用的刀头10s，洗涤液移入所述IOOmL鸡心瓶中，再向第二个50mL离心管中加入15mL乙酸乙酯和0.45mL氢氧化铵，用玻璃棒搅拌第二支离心管中的残渣后，于镟润振荡器上润旋提取lmin,超声波提取5min,以4000r/min离心5min,上清液合并至所述IOOmL鸡心瓶中；(3)向第二支离心管的残渣中再加入15mL乙酸乙酯，于漩涡振荡器上涡旋提取lmin,超声波提取5min,以4000r/min离心5min,将上清液至所述IOOmL鸡心瓶中，在45°C旋转浓缩至干；(4)将所述鸡心瓶中的残渣用ImL水溶解，超声5min，加入3mL正己烷涡旋混合30s,静置分层，弃掉上层的正己烷，再加3mL正己烷涡旋混合30s，静置分层，移取水相于1.5mL的离心管中，以10000r/min离心5min，过0.2 μ m滤膜后，供高效液相色谱-串联质谱测定；(5)精确称取氯霉素标准品IOmg于IOOmL容量瓶中，用色谱甲醇超声溶解定容至刻度，为标准储备液；将所述标准储备液用色谱甲醇分别稀释，配成0.1 μ g/mL, 0.2 μ g/mL, 0.4 μ g/mL, 0.8 μ g/mL和I μ g/mL的溶液；分别注入高效液相色谱_串联质谱测定；得到标准曲线；(6)将步骤(4)获得的检验数据通过标准曲线计算待测样品中氯霉素浓度；HPLC测定条件:a)色谱柱:XTerra MS C18,150mmX 2.1mm, 3.5 μ m。b)流动相及梯度洗脱条件:0-6分钟流动相乙腈从20 %到90 %，流动相水从80 %到10 % ；6-8分钟流动相乙腈从90 %到20 %，流动相水由10 %到80 % ；8-15分钟流动相乙腈保持20%不变，流动相水保持80%不变；c)进样量:5yL;d)柱温:35°C ;e)流速:0.2mL/min ；MS/MS参考条件a)电离方式:电喷雾电离，负离子(ES1-)；b)毛细管电压:3.0OkV ；c)离子源温度:110°C ;d)锥孔气:氮气，50L/Hr ；e)脱溶剂气:氮气，700L/Hr，温度400°C ；f)碰撞气:IS气；
g)扫描模式:多反应检测(MRM)模式。本发明的有益效果是=HPLC-MS-MS技术灵敏度高，选择性和特异性好，不仅可对样品中低浓度的多药物残留进行定性确认，克服样品基质干扰，而且能够有效排除假阳性，进行功能性食品中残留物准确的定量分析。本发明的方法准确度好、精度高、线性良好，且便于开展功能性食品中氯霉素残留含量的测定。为以后功能性食品中兽药残留监测提供了有效的技术支撑。


图1为实施例1的氯霉素标准品液相色谱质谱图。图2为实施例1的样品液相色谱质谱图。
具体实施例方式下面通过实例对本发明做进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所做的等同替换或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。实施例1一种功能性食品中氯霉素残留的HPLC-MS-MS检测方法，包括如下步骤:(以营养闻隹丐冲剂为待测样品)(I)称取Ig高钙冲剂为试样，精确至0.0lg，置于50mL聚丙烯离心管中，加入15 μ L浓度为0.4 μ g/mL的氘代氯霉素作内标溶液，加入15mL乙酸乙酯0.45mL氢氧化铵，5g无水硫酸钠,勻质提取30s,以4000r/min离心5min,上清液转移至IOOmL鸡心瓶中；(2)取第二个50mL离心管，加入15mL乙酸乙酯和0.45mL氢氧化铵作为洗涤液，洗涤步骤(I)匀质操作时用的刀头10s，洗涤液移入所述IOOmL鸡心瓶中，再向第二个50mL离心管中加入15mL乙酸乙酯和0.45mL氢氧化铵，用玻璃棒搅拌第二支离心管中的残渣后，于镟润振荡器上润旋提取lmin,超声波提取5min,以4000r/min离心5min,上清液合并至所述IOOmL鸡心瓶中；(3)向第二支离心管的残渣中再加入15mL乙酸乙酯，于漩涡振荡器上涡旋提取lmin,超声波提取5min,以4000r/min离心5min,将上清液至所述IOOmL鸡心瓶中，在45°C旋转浓缩至干；(4)将所述鸡心瓶中的残渣用ImL水溶解，超声5min，加入3mL正己烷涡旋混合30s,静置分层，弃掉上层的正己烷，再加3mL正己烷涡旋混合30s，静置分层，移取水相于1.5mL的离心管中，以10000r/min离心5min，过0.2 μ m滤膜后，供高效液相色谱-串联质谱测定；(5)精确称取氯霉素标准品IOmg于IOOmL容量瓶中，用色谱甲醇超声溶解定容至刻度，为标准储备液；将所述标准储备液用色谱甲醇分别稀释，配成0.1 μ g/mL, 0.2 μ g/mL, 0.4 μ g/mL, 0.8 μ g/mL和I μ g/mL的溶液；分别注入高效液相色谱_串联质谱测定；得到标准曲线；(6)将步骤(4)获得的检验数据通过标准曲线计算待测样品中氯霉素浓度；HPLC测定条件:
f)色谱柱:XTerra MS C18,150mmX 2.1mm，3.5 μ m。g)流动相及梯度洗脱条件:0-6分钟流动相乙腈从20 %到90 %，流动相水从80 %到10 % ；6-8分钟流动相乙腈从90 %到20 %，流动相水由10 %到80 % ；8-15分钟流动相乙腈保持20%不变，流动相水保持80%不变；h)进样量:5 μ L ；i)柱温:35°C ;j)流速:0.2mL/min ；MS/MS参考条件h)电离方式:电喷雾电离，负离子(ES1-)；i)毛细管电压:3.0OkV ；j)离子源温度:110°C ;k)锥孔气:氮气，50L/Hr ；

I)脱溶剂气:氮气，700L/Hr，温度400°C ；m)碰撞气:IS气；η)扫描模式:多反应检测(MM)模式。表I各种化合物的离子对和电压
权利要求
1.一种功能食品中氯霉素残留的HPLC-MS-MS检测方法，其特征是包括如下步骤: (1)称取Ig试样，精确至0.0lg,置于50mL离心管中，加入15 μ L浓度为0.4 μ g/mL的氣代氯霉素作内标溶液，加入15mL乙酸乙酯、0.45mL氢氧化铵，5g无水硫酸钠，匀质提取30s,以4000r/min离心5min,上清液转移至IOOmL鸡心瓶中； (2)取第二个50mL离心管，加入15mL乙酸乙酯和0.45mL氢氧化铵作为洗涤液，洗涤步骤(I)匀质操作时用的刀头10s，洗涤液移入所述IOOmL鸡心瓶中，再向第二个50mL离心管中加入15mL乙酸乙酯和0.45mL氢氧化铵，用玻璃棒搅拌第二支离心管中的残渣后，于漩润振荡器上润旋提取Imin,超声波提取5min,以4000r/min离心5min,上清液合并至所述IOOmL鸡心瓶中； (3)向第二支离心管的残渣中再加入15mL乙酸乙酯，于漩涡振荡器上涡旋提取lmin，超声波提取5min,以4000r/min离心5min,将上清液至所述IOOmL鸡心瓶中，在45°C旋转浓缩至干； (4)将所述鸡心瓶中的残渣用ImL水溶解，超声5min，加入3mL正己烷涡旋混合30s，静置分层，弃掉上层的正己烧，再加3mL正己烧润旋混合30s,静置分层,移取水相于1.5mL的离心管中，以10000r/min离心5min，过0.2μπι滤膜后，供高效液相色谱-串联质谱测定； (5)精确称取氯霉素标准品IOmg于IOOmL容量瓶中，用色谱甲醇超声溶解定容至刻度，为标准储备液；将所述标准储备液用色谱甲醇分别稀释，配成0.1 μ g/mL, 0.2 μ g/mL,.0.4 μ g/mL, 0.8 μ g/mL和I μ g/mL的溶液；分别注入高效液相色谱-串联质谱测定；得到标准曲线； (6)将步骤(4)获得的检验数据通过标准曲线计算待测样品中氯霉素浓度； HPLC测定条件:a)色谱柱:XTerraMS C18,1 SOmmX 2.1mm, 3.5 μ m。
b)流动相及梯度洗脱条件: 0-6分钟流动相乙腈从20%到90%，流动相水从80%到10% ； 6-8分钟流动相乙腈从90%到20%，流动相水由10%到80% ； 8-15分钟流动相乙腈保持20%不变，流动相水保持80%不变； c)进样量:5yL; d)柱温:35°C；e)流速:0.2mL/min ； MS/MS参考条件 a)电离方式:电喷雾电离，负离子(ES1-)； b)毛细管电压:3.0OkV ；c)离子源温度:110°C; d)锥孔气:氮气，50L/Hr； e)脱溶剂气:氮气，700L/Hr，温度400°C； f)石並撞气:気气； g)扫描模式:多反应检测(MRM)模式。
全文摘要
本发明公开了一种功能食品中氯霉素残留的HPLC-MS-MS检测方法，包括如下步骤称取试样，加入氘代氯霉素作内标溶液，加入乙酸乙酯、氢氧化铵、无水硫酸钠，匀质提取，离心，上清液转移至鸡心瓶中；将鸡心瓶中上清液浓缩至干；用水溶解，超声，加入正己烷涡旋混合，静置分层，弃掉上层的正己烷，再加正己烷涡旋混合，静置分层，移取水相于离心管中，离心，过滤膜后，供高效液相色谱-串联质谱测定；另精确称取氯霉素标准品用色谱甲醇超声溶解定容，配成不同浓度的溶液；经高效液相色谱-串联质谱测定；得到标准曲线；将获得的检验数据通过标准曲线计算待测样品中氯霉素浓度；本发明的方法准确度好、精度高、线性良好。
文档编号G01N30/88GK103175929SQ20111042919
公开日2013年6月26日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者赵晓娟, 李星芝, 王俊全 申请人:天津天狮生物发展有限公司, 天狮集团有限公司, 天津天狮生命源有限公司