专利名称：检测肿瘤标志物内皮细胞特异性分子-1的elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测肿瘤标志物的试剂盒，特别是涉及检测内皮细胞特异性分子-I(ESM-I)的试剂盒。
背景技术：
胃癌是最常见的威胁人类健康的恶性肿瘤之一，是致死率位居第二的肿瘤，手术切除是目前唯一可能根治的手段，但大多数患者在发现时已经是晚期，无法进行手术治疗。 因此，及时准确的诊断是挽救患者生命的关键。现有的胃癌检测方法有组织切片免疫组化技术。但免疫组织化学技术，步骤繁多， 对实验人员和实验条件要求高，而且假阳性和假阴性染色多。因此，免疫组化的结果不够稳定(见参考文献6、7、8、9、10)。最不利的是，免疫组化技术所用标本必须要进行手术才可以取得，拖延了诊断和治疗的时间，不能准确反映患者初诊时的情况。因此，需要相关的分子标志物应用于胃癌的早期诊断及预后预测。肿瘤标志物的价值表现在其敏感性和特异性上。理想的肿瘤标志物应该是敏感性高，特异性强，表达量或血清中水平与肿瘤组织扩散或肿块大小呈正相关。临床上目前使用的胃癌血清肿瘤标志物有CEA、CA19-9、CA72-4(电化学发光法进行检测)及CAM2(ELISA法进行检测)的临床检测。对于肿瘤标志物CEA，由于CEA的多克隆抗体容易与样品中无关抗原结合，造成假阳性结果增多。因此，CEA不适合作为诊断胃癌特异指标。肿瘤标志物CA19-9、CA72-4及 CA242也存在着同样的问题，特异性不高。因此，现在还没有一种肿瘤标志物对胃癌完全特异。寻找一种更加合适的血清肿瘤标志物，在应用于临床检测，协助胃癌早期诊断，预测患者预后情况，监测患者病情发展，进一步寻找治疗新靶点，做到胃癌的个体化治疗(见参考文献11、12、13、14)方面具有重要意义。

发明内容
经过深入研究，本发明人发现内皮细胞特异性分子-1(ESM-1，其编码蛋白也称为 endocan)在胃癌和癌旁形态学正常组织间的表达有显著差异。基于上述发现，本发明的一个目的是提供一种检测肿瘤标志物内皮细胞特异性分子-1的试剂盒，所述试剂盒包含(1)包被抗体，所述包被抗体为鼠抗人ESM-I抗体；(2)检测抗体，所述检测抗体为生物素化羊抗人Endocan抗体；C3)酶联抗体，所述酶联抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG ； (4)人Endocan标准品；和( 所述酶联抗体的酶的显色底物。本发明的试剂盒用于检测表达ESM-I的肿瘤。所述表达ESM-I的肿瘤为胃癌、肾癌、乳腺癌、神经胶质瘤和非小细胞癌，所述肿瘤优选为胃癌。本发明的试剂盒用于胃癌的早期诊断、监测治疗效果或预后评估。在本发明的试剂盒中，所述包被抗体的工作浓度为4μ g/mL至1 μ g/mL，所述检测抗体的工作浓度为10 μ g/mL至0. 1 μ g/mL,所述酶联抗体的工作浓度为1 μ g/mL。优选的是，本发明的试剂盒中，所述包被抗体的工作浓度为4 μ g/mL，所述检测抗体的工作浓度为 1 μ g/mL，所述酶联抗体的工作浓度为1 μ g/mL。本发明还提供了内皮细胞特异性分子-I(ESM-I)在肿瘤检测试剂盒制备中的应用，所述试剂盒包含(1)包被抗体，所述包被抗体为鼠抗人ESM-I抗体；( 检测抗体，所述检测抗体为生物素化羊抗人Endocan抗体；C3)酶联抗体，所述酶联抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG; (4)人Endocan标准品；和( 所述酶联抗体的酶的显色底物。在所述应用中，所检测的肿瘤为胃癌、肾癌、乳腺癌、神经胶质瘤和非小细胞癌。所述肿瘤优选为胃癌。在所述应用中，所述包被抗体的工作浓度为4 μ g/mL至1 μ g/mL,所述检测抗体的工作浓度为10 μ g/mL至0. 1 μ g/mL,所述酶联抗体的工作浓度为1 μ g/mL。优选的是，本发明的试剂盒中，所述包被抗体的工作浓度为4μ g/mL，所述检测抗体的工作浓度为1 μ g/ mL，所述酶联抗体的工作浓度为1 μ g/mL。使用本发明的试剂盒，可以提高胃癌的早期诊断率，并且可预测预后结果和治疗效果，为更好、更特异性的治疗提供了有效指导。


标准曲线，ELISA检测结果应该用实验结果以图表形式来说明。图1显示了高通量的芯片技术分析的差异基因聚类图。图2显示了对43个基因的胃癌预测模型及在第二批样本中的验证。图3显示了各样品中ESM-I在mRNA水平和蛋白水平的表达情况。图4显示了 ESM-I表达与胃癌患者的单因素生存分析(K-M曲线)。图5显示了 ESM-I在胃癌患者及正常人群血清中的表达差异。图6显示了根据公式计算出(a)和调整后的(b)的肿瘤患者和健康对照的ESM-I 浓度比较。
具体实施例方式内皮细胞特异性分子-I(ESM-I)，最初是由LassalIe及其同事1996年从人内皮细胞cDNA文库克隆得到的，定位于人类5号染色体5qll. 2，包含三个外显子和二个内含子， 其编码蛋白也称为endocan(本文中有些情况下，也用ESM-I表示内皮细胞特异性分子_1 蛋白)。Endocan由血管内皮细胞，肾远端小管内皮细胞层及支气管和肺粘膜下腺体分泌而来，在内皮和上皮细胞的表达可被TNF-α，IL-I β，LPS及VEGF上调，被IL-4和IFN-γ下调。肾癌、乳腺癌、神经胶质瘤和非小细胞癌的血管内皮过表达endocan，局部表达水平与血管形成和肿瘤侵袭相关(见参考文献2、3、4、15-19)。目前，除申请人之外，尚没有ESM-I 在胃癌中表达研究的报道。本发明人前期通过高通量的芯片技术和结果分析，发现了胃癌和癌旁形态学正常组织间ESM-I基因表达模式的改变情况，ESM-I是胃癌和癌旁正常组织间差异表达最显著的基因之一，胃癌中ESM-I核酸水平明显上调。随后，通过实时RT-PCR和蛋白质印记进一步证实胃癌组织中ESM-ImRNA和蛋白表达上调。进一步分析ESM-I表达与临床病理参数的关系，发现肿瘤上皮过表达ESM-I与远处转移、脉管侵犯和BorrmarmIV型胃癌相关；单因素生存分析表明ESM-I阳性患者术后生存期短；多因素分析证实ESM-I表达是一个独立预后因子。分子标志物的血清学检测是基础实验结果向临床实际应用迈进的手段，鉴于以上实验结果及ESM-I是一种分泌蛋白，本发明人进一步尝试构建人血清检测试剂盒——双抗夹心ELISA试剂盒。酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，简称 ELISA)是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。ELISA的基础是抗体的固相化及抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗原)与固相载体表面的抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。在有变化的ELISA方法中，向抗原抗体复合物中加入的第二抗体未经标记，而显示反应结果的酶与抗第二抗体的第三抗体偶联。实验结果证实，试剂盒构建成功。该试剂盒对胃癌患者的可信检出率为13.3%， 通过该试剂盒，本发明人发现正常个体与胃癌患者血清ESM-I含量有差异。具体结果见图 6 (a 禾口 b)。本发明试剂盒的优点在于1.引入一种新的预后相关的胃癌分子标志物ESM-1， 通过检测该标志物，可以协助胃癌的临床诊断，进一步判断患者预后情况，指导治疗；同时， 作为胃癌的一个独立预后因子，该标志物也有可能成为治疗新靶点。2.该标志物的检测只需抽血便可进行，患者所受痛苦较小，且可以随时检测，有利于监测病情。3. ELISA检测技术在临床应用已经比较成熟，且简单方便，成本适中，适合临床检测。下面将结合实施例对本发明进行更详细的说明。实施例1肿瘤组织中ESM-I核酸水平明显上调，胃癌组织中ESM-ImRNA和蛋白表达上调前期我们利用高密度寡核苷酸芯片技术对胃癌相关基因进行了全面、较大样本的研究，用含42，292条长寡核苷酸( ，000条为基因数据库中的参考序列(Refkqdatabase release 17)，另 24，000 条为 EST 和 Unigene 序列(Unigene buildl88))探针芯片对首批 46例胃癌、20例非肿瘤性胃粘膜进行研究，筛选出胃癌与癌旁正常组织间差异表达及胃癌生物学特性相关的基因。这些基因可以用来进行肿瘤的分类，探索肿瘤可能的病因、预测肿瘤患者的预后以及确定肿瘤分子治疗的相关靶点。在既往研究基础上，利用收集的第二批 100例样本，筛选质控合格的47例，包括33例肿瘤和14例非肿瘤性癌旁胃粘膜对前期芯片结果进行了平台验证和进一步综合数据分析。以FDR < 0. 01%为阈值，运用SAM在第一批样本中筛选到3768个差异基因，在第二批样本中筛选到1499个差异基因，利用这些差异基因，分别对第一批样本和第二批样本进行有监督的聚类，结果第一批66例样本和第二批47例样本分别被成功区分成癌和癌旁正常组织两组。第一批样本和第二批样本中找到的差异基因之间有较大重叠，有1211个基因在两批样本中都表达差异显著，分别占第一批样本和第二批样本的31. 3%和80. 7%。利用K-最近邻法(k-nearest neighbors, KNN)，从首批样本中筛选到43个基因作为肿瘤特异分子标志物，在这43个基因中，COLlAl，C0L4A1, SULFl，TMPRSS2，TTL等已报道与胃癌相关，其它基因尚未见报道，用该marker对第二批样本聚类，只有两例肿瘤样本被聚类到正常组织中，96% (45/47)的样本聚类正确，marker的准确性和一致性佳。利用主成分分析和线性回归相组合的方法，综合两批肿瘤样本，筛选出10个基因用于预测胃癌患者预后， 该套marker在首批样本中验证结果可以将病人区分成预后好与差的两组，5年生存率分别为63%和10.5% (P = 4. 69e-5)，在第二批样本中验证，可以将第二批样本分成5年生存率分别为83%和4. 76%的两组(P = 0. 001)，证实该marker有效、可靠。利用基因富集分析GSEA，发现在胃癌和癌旁组织中以及预后好和预后差的患者组中存在差异的信号通路、 转录因子和miRNA等，其中88%肿瘤显示有MYC信号通路的异常。利用半监督的聚类，结合样本病例的临床病理学参数，发现了与胃癌肿瘤侵犯深度、淋巴结转移、脉管癌栓及贲门癌与胃癌间差异表达相关基因，这些基因密切参与胃癌的发生、发展和预测肿瘤结局。差异基因聚类图见图1。(a).第一批66例组织有监督聚类图。3768个基因在胃癌组织和正常胃粘膜组织中有表达差异(FDR值为0.01% )。高表达基因2088个，低表达的为1680个。(b).第二批47例组织有监督聚类图。1499个基因在胃癌组织和正常胃粘膜组织中有表达差异(FDR值为0.01%)。高表达基因243个，低表达的为1157个。图中列代表样本，行代表基因，不同颜色代表基因的变化状态，红色基因表达水平上调；绿色 基因表达水平下调；黑色基因表达变化不明显。图2显示了对43个基因的胃癌预测模型及在第二批样本中的验证。(a).由43个基因组成的预测模型可以将第一批的66例癌和癌旁组织分开；(b).根据此43个基因对第二批样本进行聚类，仅2例肿瘤组织误分到正常组织中，预测的正确率为96% (45/47)。在芯片结果的基础上，本发明人对差异表达显著的基因ESM-I进行了进一步的研究。并通过实时定量RT-PCR、免疫组化验证了 ESM-I在胃癌组织中表达水平的改变，通过蛋白质印记验证了 ESM-I在蛋白水平的表达变化。具体实验过程如下1. RT-PCR 与实时 RT-PCR(1)胃癌及配对正常组织总RNA提取胃癌及配对正常粘膜组织在液氮下研磨，留取一部分组织用于提取DNA，一部分组织用于RNA及蛋白质的提取。50-100mg组织加入Iml TRIZOL CTrizolTMReagent，QIAGEN公司)。室温放置5分钟，使其充分裂解，使用氯仿抽提(每ImlTRIZOL加0.2ml)，异丙醇沉淀(每ImlTRIZOL加0. 5ml)后，75%乙醇(每ImlTRIZOL加0. 5ml)洗涤沉淀(用以去除杂质，提高RNA纯度)，沉淀干燥后以适量DEPC水溶解，1 %琼脂糖凝胶鉴定，紫外分光光度计测RNA浓度，-80°C保存。(2) RT-PCR取1 μ g总RNA逆转录为cDNA，过程如下1 μ g总RNA在70 °C变性10分钟， 之后立即插入冰中。然后加入2. Ομ IOXReverse Transcription缓冲液、25mM MgCl2^O. 5 μ g Oligo(dT)、2· 0μ 1 IOmM dNTPs mix.O. 5 μ 1 RNasin (40U/1)禾口 15u
6AMV ReverseTranscriptase (此处使用 Promega 反转录试齐Ll 盒(A3500-Reverse
TranscriptionSystem, Promega公司))。反应体系(见表1)混勻后42°C孵育15分钟， 95°C孵育5分钟，最后4°C 5分钟终止反应。表1反转录体系
权利要求
1.一种检测肿瘤标志物内皮细胞特异性分子-1的ELISA试剂盒，所述试剂盒包含 (1)包被抗体，所述包被抗体为鼠抗人ESM-I抗体；( 检测抗体，所述检测抗体为生物素化羊抗人Endocan抗体；(3)酶联抗体，所述酶联抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG ； (4)人Endocan标准品；和( 所述酶联抗体的酶的显色底物。
2.如权利要求1所述的ELISA试剂盒，所述试剂盒用于检测表达ESM-I的肿瘤。
3.如权利要求2所述的ELISA试剂盒，其中所述表达ESM-I的肿瘤为胃癌、肾癌、乳腺癌、神经胶质瘤和非小细胞癌。
4.如权利要求3所述的ELISA试剂盒，所述肿瘤为胃癌。
5.如权利要求4所述的ELISA试剂盒，所述试剂盒用于胃癌的早期诊断、监测治疗效果或预后评估。
6.如权利要求1至5中任一项所述的ELISA试剂盒，所述包被抗体的工作浓度为4μ g/ mL至1 μ g/mL，所述检测抗体的工作浓度为10 μ g/mL至0. 1 μ g/mL，所述酶联抗体的工作浓度为 1 μ g/mL。
7.如权利要求6所述的ELISA试剂盒，所述包被抗体的工作浓度为4μ g/mL,所述检测抗体的工作浓度为1 μ g/mL。
8.内皮细胞特异性分子-1在肿瘤检测ELISA试剂盒的制备中的应用，所述试剂盒包含(1)包被抗体，所述包被抗体为鼠抗人ESM-I抗体；(2)检测抗体，所述检测抗体为生物素化羊抗人Endocan抗体；C3)酶联抗体，所述酶联抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊 IgG; (4)人Endocan标准品；和( 所述酶联抗体的酶的显色底物。
9.如权利要求8所述的应用，其中所述肿瘤为胃癌、肾癌、乳腺癌、神经胶质瘤和非小细胞癌。
10.如权利要求9所述的应用，其中所述肿瘤为胃癌。
全文摘要
一种检测肿瘤标志物内皮细胞特异性分子-1的试剂盒，所述试剂盒包含(1)包被抗体，所述包被抗体为鼠抗人ESM-1抗体；(2)检测抗体，所述检测抗体为生物素化羊抗人Endocan抗体；(3)酶联抗体，所述酶联抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG；(4)人Endocan标准品；和(5)所述酶联抗体的酶的显色底物。利用本发明的试剂盒，可以在创伤较小的情况下，提高胃癌的早期诊断率，并且由于该生物标志物是一个独立预后因子，且与脉管侵犯、远处转移和胃癌大体分型有关，因此可以预测预后，监测病情，指导治疗。
文档编号G01N33/53GK102175850SQ20101061671
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者刘妮, 季加孚, 张连海, 朱昱冰, 杜红, 王晓红, 胡颖, 邢晓芳 申请人:北京肿瘤医院