专利名称：用于分析的细胞和生物学标本的稳定的制作方法
技术领域：
本申请总体上涉及细胞和血液稳定领域，更具体地讲，涉及血液标本中罕见细胞的稳定，最具体地讲涉及全血中循环的肿瘤细胞(CTC)的稳定，以便随后富集和分析。
背景技术：
早在1869年就已经在血液中检测到肿瘤细胞，有证据表明，原发性癌症在出现临床症状之前的早期发病阶段就开始向循环系统中脱落肿瘤细胞。在肿瘤血管化时，脱落到循环系统中的肿瘤细胞可以附着，并且定居在远处的部位，以便形成转移肿瘤。所述循环的肿瘤细胞正常情况下不存在于健康个体内，因此可以构成用于诊断和治疗特殊癌的基础。当肿瘤生长到1-2毫米的直径时就开始发生新的血管化，肿瘤的这种尺寸太小，以至不能通过诸如乳房X光照相的常规方法检测，该方法要求肿瘤的尺寸大约为5毫米，以便检测。能够在以现有金标准乳房X光照相方法更早的阶段检测少量CTC的具有灵敏性和专一性的检测方法，能够显著改善早期癌症诊断和疾病控制。Terstappen等在US6365362中披露了这种检测方法，该专利被收作本文参考。
全血是一种复杂的体液，它含有各种细胞群体和能够进行各种生物化学和酶促反应的可溶性成分，所述反应特别是在超过6小时的体内长期保存时可能发生，体内在本文中被定义为是在患者身体内发生的；以及在体外发生，体外在本文中被定义为是在抽血之后发生的。上述某些反应的结果是作为异源物质破坏循环的肿瘤细胞检测的。患者的免疫反应还可以通过包括吞噬作用和嗜中性白细胞活化在内的正常防御机制削弱或破坏肿瘤细胞。化疗同样可以通过由坏死诱导的细胞死亡减弱细胞功能和增殖。
除了上述外部破坏因素之外，在敌对环境中受到损伤的肿瘤细胞还可能发生细胞程序死亡或凋之。发生凋亡或坏死的细胞，具有改变了的膜通透性，以便能够排出DNA，RNA和其他细胞成分，导致细胞碎片的形成，并且最终导致CTC的完全分解。所述肿瘤细胞碎片可能仍然具有完整细胞所特有的表位，并且可能导致循环癌细胞的疑似增加。即使是来自健康个体的全血标本也会发生细胞组成的明显改变，这种改变被广义地归类为，并且在本文中被确定为血液质量的降低，这种现象可能在超过24小时的长时间保存时发生。红细胞可能破裂，并且释放血红蛋白和产生细胞血影。已知白细胞，特别是粒细胞是不稳定的，并且会在保存时减少。所述改变增加了源于正常血细胞的细胞碎片的数量或者发现蛋白会干扰诸如CTC的罕见靶细胞的分离和检测。所述破坏性过程的综合作用表现出细胞碎片的显著增加，这些碎片能够方便地检测，例如通过流式细胞测定和显微技术分析，用于所述分析的方法披露于共同拥有的题为“循环肿瘤细胞、片段和碎片的分析”的共同未决申请中，该申请被收作本文参考。
通过显微成像检测循环的肿瘤细胞同样会受到可分类的肿瘤细胞的疑似减少和干扰可染色碎片的相应增加的不利影响。因此，保持血液标本的完整性或质量是最重要的，因为在出血和标本加工之间可能存在多达24小时的延迟。
所述延迟是相当常见的，因为并不是在每一个实验室中都具备进行用于加工用于该测定的技术和设备。样品送达样品加工实验室所需要的时间有很大的不同。因此，重要的是确定可以加工样品的时间窗。在常规血液学分析中，血液样品可以在24小时内分析。由于罕见血细胞的分析更为严格，缩短了可以分析血液样品的时间窗。一种例子是血细胞的免疫表型分类，一般，该方法必须在24小时内进行。在癌症血液测定中，必须对更大体积的血液进行加工，并且血液样品的降解可能造成更严重的问题，因为由分解的细胞释放的材料能加强背景，并因此降低检测肿瘤细胞的能力。
有大量公开的或获得专利的技术涉及到正常血液细胞长时间保存的稳定性和稳定化，有若干种获得专利的商业化稳定剂可用于保存白血细胞，例如由Streck Laboratories，Omaha，NE出售的Cyto-ChexTM，由BioErgonomics，St.Paul出售的StabilCyteTM，和由UK NEQAS，Sheffield，UK出售的TRANSfixTM。
在WO 97/45729中，声称TRANSfixTM稳定剂适用于分析病理学标本，特别是分析HIV和白血病血液标本。不过，没有公开所述申请的资料，或公开将TRANSfixTM用于在长时间保存期间稳定和保护CTC的用途。所述文献声称TRANSfixTM含有交联固定剂，低聚甲醛和重金属离子。通过流式细胞测定方法测定发现，可以将包括粒细胞在内的白细胞的完整性保持至少5天时间。没有发表有关CTC或其他病原体的资料。
尽管低聚甲醛或含有低聚甲醛、甲醛、戊二醛和乙二醛的试剂存在缺陷，这种试剂通常被用于固定和稳定血液或组织学标本中的肿瘤细胞(例如，参见D.B.Tse等，US6,004,762)。在用成孔试剂，如皂苷，或表面活性剂对CTC进行透化之后，有效固定是特别重要的。所述透化会进一步削弱脆弱的CTC的细胞膜结构和细胞完整性。为了对细胞内成分进行染色或免疫染色，透化是必要的，例如，用细胞核染料DAPI(4，6-二氨基-2-苯基吲哚)和使用标记过的抗体，如细胞角蛋白，将所述染色剂用于表征CTC，并且将它们与正常血液细胞区分开来。
业已使用了替代双功能或交联醛类的固定剂。某些较老的固定剂是基于重金属的，例如铬或锰，类似于皮毛鞣制中的作用模式，但是，由于它们缺乏特异性和毒性，限制了它的应用。固定的另一种方法使用了甲醛的单功能衍生物，或杂环胺或酰胺的羟甲基衍生物，例如，二偶氮烷基脲和咪唑烷基脲，这两种物质被广泛用作化妆品中的防腐剂。另外，业已披露聚乙二醇(大约20000MW)，是白细胞的有效稳定剂。所述化合物披露于被授予Streck Laboratories，Omaha，NE的若干美国专利中(US 5,459,073；US 5,849,517；US 5,981,282；US 6,017,764；US 6,051,433；US 6,124,089；6,159,682；US6,200,500)，这种化合物主要被用于稳定特殊的血液细胞群体，以便用作血液学的对照。
羟甲基衍生物的作用模式是未知的，不过，根推测与和细胞蛋白的氨基基团之间的弱的可恢复的键相关，所述结合在除去多余的固定剂之后会解离。羟甲基或羟基甲基衍生物在化学上是易变的，并且能够释放少量的甲醛，这些甲醛能与蛋白形成短的或单一的碳交联。据报导，由所谓的甲醛供体释放的甲醛能与核酸碱基起反应，特别是与腺嘌呤起反应，以便可逆地形成羟甲基衍生物和亚甲基桥，以便不可逆地交联核酸，这可能是在化妆品中起作用的抗生模式。不过，据说游离的甲醛在上述专利的Cyto-ChexTM稳定剂中不是有效成分。以上专利没有披露稳定或固定血液或其他生物学标本中的CTC的用途。人们无法推测在血液中循环的肿瘤细胞会像正常的血液细胞那样稳定。因为已知CTC具有脆弱性，并且CTC的任何稳定化(如果发生这种稳定的话)会在所有加工步骤中持续。因此，明确需要鉴定能在储存和加工期间体外稳定CTC的有效试剂，以及能保持血液品质的试剂，在本文中，我们业已证实这种试剂在需要对CTC进行精确分类和计数(如果存在的话)的富集和检测方法中是重要的。
发明概述为了区分体内肿瘤分解和由于体外样品降解所导致的分解，稳定剂是必须的。根据本发明，业已发现了可以用作保持生物学标本质量的稳定剂、固定剂和防腐剂的若干种组合物。另外，业已发现了用于稳定生物学标本的方法和装置。以上改进或发现使得本文所披露的发明能够大大改善现有的系统和方法，并且可用于富集和计数全血中的CTC。
业已发现了多种用于保存生物学标本的组合物。所述组合物是抗凝剂和稳定剂的组合。另外，本发明披露了稳定化的标本、抗凝剂和稳定剂的组合物。另外，本发明披露了让生物学标本与所述组合物接触以便增强稳定性的各种方法。另外，本发明披露了让生物学标本与所述组合物接触以便增强稳定性的各种装置。一般，所述方法和装置可用于保存生物学标本，并且特别是用于保存血液标本中的CTC。
因此，提供一种改进的方案，该方案包括在抽血之前将稳定剂添加到血液采集管中。本发明还提供了用于在抽血之后立即将稳定剂添加到血液试管中的方法，包括补偿在血液试管中改变标本体积的方法。
本发明还提供了用于向用于加工生物学标本的一种或多种缓冲液中添加所述稳定剂的方法，以便根据需要用作稳定剂和/或固定剂。因此，本发明的主要目的是提供在分析之前使用的生物学标本的稳定剂。本发明的特定用途涉及稳定血液样品中的CTC。本发明的另一个目的是提供用于将全血样品的质量保持至少24小时的稳定剂和防腐剂。不过，在遭遇机械胁迫时保存时间长达72小时，如在转运期间的意外混合或震荡，或在分析之前对标本的再次机械混合所造成的胁迫。
可以了解和理解的是，本发明的上述发现的所述组合物和方法对于本领域技术人员可以想到的多种其他潜在的用途来说仅仅是说明性质的，因此不是要以任何方式对本发明的范围进行限定。因此，通过以下详细说明和所附录的权利要求书，本领域技术人员可以了解本发明的其他目的和优点。


图1表示在室温下保存24小时之后，来自9位癌症患者的全血标本中可检测CTC的下降。
图2表示在0，6，18和24小时，来自3位癌症患者的全血标本中可检测的CTC。
图3表示在转运来自表II中的1位癌症患者#28162的两份标本试管之后Cyto-ChexTM稳定剂对标本质量的影响a.)没有稳定剂的标本试管，b.)含有30％Cyto-ChexTM稳定剂的标本试管。图象显示在添加核酸染料DAPI之后在富集的样品中细胞DNA的染色。大部分圆形物体表示有核细胞，包括CTC内的细胞核，而不规则的聚集物可能包括从受损的细胞中释放的DNA。
图4表示在放置24小时或在nutator上混合之后Cyto-ChexTM稳定剂对标本质量的影响a)不进行混合，并且不添加稳定剂，b)混合，但不添加稳定剂，c)在有30％Cyto-ChexTM稳定剂的条件下混合。在图3b中讨论了在DAPI染色之后进行的图象分析。
图5表示三种类型的CTC降解完整的CTC(图5a)，推测的CTC(图5b)，和“不确定事件”(图5c和5d)。
图6包括在24小时和72小时对来自27位对象的稳定化血液的CTC的比较，表现出显著的类似计数，以及用于比较的统计学显著性。
本发明的详细说明本文中使用了为本领域普通技术人员所熟知的各种术语。这些术语的使用含义不超出被公认的含义。
标本、样品或血液质量，在本文中是通过以下参数确定和通过实验确定的1.相对白细胞数量，它是作为与CTC或接种过的培养肿瘤细胞相比的背景非特异性选择的；2.通过颗粒状材料和较大的聚集物测定的包括DNA或DNA片段的细胞碎片，它们是通过核染料DAPI可检测地染色的；和3.细胞细胞质碎片或聚集物，它们是用藻红蛋白(PE)标记过的抗细胞角蛋白PE抗体或用别藻蓝蛋白(APC)-标记的针对白细胞上的CD-45的抗体非特异性或特异性染色的。
术语“生物学标本”或“生物学样品”可以交互使用，并且表示从被怀疑含有感兴趣的细胞的人类对象体内采集的少量液体或组织，并对它进行分析。生物学标本可以表示流体或细胞部分，或表示含有可溶性物质的部分。生物学标本或生物学样品包括，但不局限于体液，如外周血液，组织匀浆物，乳头吸出物，结肠洗液，唾液，支气管洗液，和可以从人类对象体内获得的任何其他细胞来源。一种典型的组织匀浆物可以从乳腺癌患者的前哨结中获得。
在本文中术语“罕见细胞”被定义为正常情况下不存在于生物学标本中的细胞，但是可以作为异常状况的指标出现，如感染性疾病，慢性病，损伤，或妊娠。罕见细胞还表示可能正常存在于生物学样品中的细胞，但是它出现的频率比通常存在于正常生物学标本中的细胞的出现频率低若干个数量级。
术语“抗凝剂”或“抗凝试剂”可以交互使用，并且表示为了抑制任何不希望的天然或人工凝固、凝集或聚集而添加到生物学标本中的组合物。凝集或聚集又进一步被统称为“成团”或“团块形成”。不过，所述团块必须有别于CTC的“簇”或聚集物，如果这种聚集物满足完整的CTC的分类标准的话，就作为完整的CTC单独统计。由于它们的黏附性以及形成继发转移肿瘤部位的倾向，CTC团被认为比单个CTC具有更强的增殖潜力，因此，它们的存在在诊断上具有很大价值。凝固的一种例子是血液凝结，并且常见的抗凝剂是螯合剂。例如乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)，或配合剂，如肝素，和肝素类，如硫酸肝素和低分子量肝素。
理想的“稳定剂”或“防腐剂”(本文可交互使用)被定义为能保护存在于生物学标本中的感兴趣的靶细胞，同时能减少生物学标本中干扰性聚集物和/或细胞碎片形成的组合物，它们总是会妨碍靶细胞的分离、检测和计数，以及它们与非靶细胞的区分。换句话说，在与抗凝剂组合时，稳定剂应当不会抵消抗凝剂的性能。相反，抗凝剂应当不会干扰稳定剂的性能。另外，所披露的稳定剂还具有第三种固定功能，并因此稳定透化的细胞，其中，术语“透化的”或“透化”和“固定”，“固定的”或“固定化”是以细胞生物学领域的常规定义使用的。本文所披露的稳定剂表示以适当的浓度和用量使用所述制剂。所述浓度和用量对细胞生物学领域的技术人员来说是显而易见的，其中，所述浓度或用量能有效稳定靶细胞，而又不会导致损伤。人们在使用本发明的组合物，方法和装置保护罕见细胞时，显然不会以能损伤或破坏所述罕见细胞的方式使用，并因此必然会选择合适的浓度或用量。例如，业已发现甲醛供体咪唑啉基脲在占所述标本体积的0.1-10％的优选浓度，更优选0.5-5％，最优选大约1-3％的浓度下是有效的。同样发现诸如聚乙二醇的其他制剂在以占样品体积的大约0.1％-大约5％，更优选大约0.1％-1％，和最优选0.1％-大约0.5％的优选浓度添加时是有效的。
稳定剂必须能够保存样品至少数小时。不过，在本文所提供的实施例中，证实可以将样品稳定至少72小时。当样品是从远离要进行加工和分析的场所获得的时候，这种长期的稳定性是重要的。另外，所述样品对运输期间的机械损伤必须是稳定的。
术语“循环的肿瘤细胞”或CTC表示已知能从肿瘤脱落的，通常是以很大数量脱落的细胞。当CTC的破坏速度与脱落速度相等时，能保持稳态水平，这种稳态水平又取决于肿瘤负担的大小(参见JGMoreno等，“转移性前列腺癌患者体内的循环癌细胞的改变与疾病状态相关。”Urology 58.2001)。一般，抗性和增殖能力更强的细胞能够存活，以便建立继发或转移部位。循环的肿瘤细胞是要通过本发明稳定或固定的优选的目标罕见细胞。
术语“细胞组合物”表示多种细胞，最有可能是源于生物学样品的不同类型的细胞。所述细胞组合物包括靶细胞和非靶细胞。例如，在从被怀疑具有癌症的对象体内采集的血液级分中，细胞组成应当包括红血细胞，白血细胞，和循环的肿瘤细胞(如果存在的话)。不过，有技术的生物学家可以理解的是，本文所披露的其他生物学标本，根据生物学标本的来源可以包括不同类型的细胞。
在富集方法中，如由Terstappen等在US#6,365,362(被收作本文参考)中所披露的方法中，富集的细胞级份主要包括白细胞和数量少的多的CTC(如果有的话)。在加工期间，用温和的表面活性剂ImmunipermTM(含有0.05％皂苷的PBS-Immunicon Corp，HuntingdonValley，PA)透化细胞，以便形成直径大约为8纳米的小孔，使得免疫染色抗体，抗细胞角蛋白PE，和核染料DAPI能够进入。DAPI是荧光嵌入染料，它能选择性地结合细胞内和细胞外DNA中的腺嘌呤-胸腺嘧啶。所述孔进一步削弱了细胞膜的结构完整性，并且在染色之后需要细胞固定剂或稳定剂“堵塞”所述孔，正如上文所提到过的，发现用于加强透化膜的本领域的常规醛类和重金属基固定剂与本发明所使用的磁力收集方法和染色方法不兼容。相反，出人意料地发现本发明所使用的Cyto-ChexrmTM稳定剂在染色后步骤中作为固定剂是高度有效的，并因此包含在本发明所推荐的制剂配方中。因此，本发明所披露和使用的稳定剂被同时或依次发现具有三种关键功能1.稳定所述生物学标本中的CTC和非靶细胞，以便转运、储存、样品制备和随后分析，2.通过抑制碎片和/或聚集物形成保持血液标本的质量，和3.在透化之后用作固定剂。
发现上述一种或多种功能是精确分析在本发明所使用的富集测定中的CTC或罕见细胞所必需的。
可染色细胞核的存在(可以通过诸如DAPI的核染料染色)是有核细胞的重要形态学特征。阳性DAPI染色是确定和分辨细胞角蛋白阳性细胞是“完整的CTC”的关键因素(图5a)，它不同于以弱DAPI或DAPI一阴性和/或由抗细胞角蛋白抗体识别的细胞骨骼蛋白的不规则的或斑点状细胞质染色为特征的“怀疑的CTC”。完整的和怀疑的CTC不同于DAPI阳性白细胞，但是能表达白细胞特异性标记CD45。“怀疑的CTC”仍然具有可能与完整的CTC相关的形态学特征，并且可能是坏死的、凋亡的细胞，或源于“完整的CTC”的上皮细胞来源的“凋亡体”，或者是从肿瘤部位脱落到循环系统中的(图5b)。
在表2和图5c和5d中标注为“不确定事件”的第三种类型的颗粒或可检测的事件可能具有类似于“怀疑的CTC”的染色特征，但是缺乏细胞的结构形态学特征，即它们主要是不规则的聚集物或团块，与稳定化血液标本相比，发现它们在未稳定化标本中在统计学上更占优势(p＝0.0327)。与“完整的CTC”相比，显著数量的“怀疑的CTC”的存在可以给医生提供有关患者的生长/肿瘤负担，免疫状态和/或治疗反应的重要的诊断信息。表I表示不同稳定剂对8个癌症患者的完整的CTC，怀疑的CTC，和“不确定事件”的相对数量的稳定化作用。表II表示在患有各种癌的31位患者中与无稳定剂相比，Cyto-ChxTM稳定剂对“不确定事件”数量的显著减少(p＝0.0327)，以及与无稳定剂相比，Cyto-ChexTM稳定剂对CTC的显著稳定作用(p＝0.0004)。在稳定化的和未稳定化血液之间的怀疑的CTC的数量在统计学上没有差别(p＝0.1548)。在未稳定的血液中背景加强的可能原因是伪迹无法与“真实的”怀疑的CTC区分。伪迹和怀疑的CTC或在体内形成的肿瘤碎片之间的区分可能具有临床价值，并且强调了血液/CTC稳定剂的必要性。该稳定剂使得能够评估患者血液中的CTC状态，而没有来自由抽血和CTC分析所导致的样品降解所引起的伪迹的作用(即体外)。
在以下实施例里所使用的富集方法中，通过磁标记的抗体捕获CTC(在这里，总体上由完整的和怀疑的CTC组成，除非分别说明)，细胞片段，和细胞碎片，所述抗体能识别CTC上的特殊表面标记(例如，通过附着在直径为大约0.2μm(200nm)的磁性颗粒上的抗EpCAM抗体，正如在被收作本文参考的US#6,120,856中所披露的)。多个小的，但是密集的磁性颗粒在CTC表面上的存在，能够在所述磁标记的细胞在强磁场中快速移动期间进一步胁迫削弱的未稳定化细胞膜，所述强磁场是磁力(在磁场中)温育和磁力收集期间在高梯度磁力分离机(例如，Immunicon quadrupole QMS17；获得的美国专利号为#5,186,827和#5,466,574)产生的。
发现本发明的稳定剂能够抑制对磁标记的细胞的损伤，所述损伤可能是由于甚至发生在正常的样品加工，如离心，涡旋搅拌和移液期间的磁力和非磁力胁迫所导致的。例如，在使用诸如由Dynal Inc.，Lake Success，NY出售的直径为2.8微米和4.5微米的较大的磁性颗粒或珠进行免疫磁标记时，业已发现了对罕见细胞和CTC的更显著的破坏。
在抽血以及随后的标本加工期间，存在于外周循环系统中的存活的受损肿瘤细胞，会受到在将血液抽入抽真空的试管期间的紊流，和受到在分析之前的血液试管转运和混合的进一步胁迫和损伤。所述机械损伤是在体外以时间依赖方式持续发生的导致CTC破坏的免疫学、细胞凋亡和坏死过程的补充。我们业已发现，标本保存的时间越长，CTC的损失越大，并且干扰性碎片和/或聚集物的数量越多。实际上，在本说明书中提供的资料(图1和2)表明，在室温下保存24小时或更长时间的若干血液标本的CTC计数显著下降，表明了在抽血之后CTC的显著体外破坏。尽管在保存期间造血细胞的减少是众所周知的现象，但是上面所引用的Streck Labs和其他人的专利的主题，到目前为止都没有将由于混合或转运所导致的机械损失确认为CTC或罕见细胞减少的因素。细胞碎片的形成和所积累的碎片和聚集物对CTC或其他罕见细胞的分析的干扰作用，迄今为止同样没有被认识到。在高度灵敏的富集测定中，看上去最明显和问题最突出的是，需要加工较大体积的血液(5-50mL)，并且随后在体积减少(小于1mL)之后，进行显微镜检测或靶细胞成像。所述碎片要么不能正常看到，要么不会干扰常规非富集测定，例如，流式细胞测定或通过密度梯度方法进行的富集。
总之，上述因素中的全部或某些能够并且发现导致体外碎片和/或团块形成，业已发现富集方法对CTC检测的干扰，正如本文中所披露的。业已出人意料地发现，本文所披露的稳定剂组合物及其用途能够保存CTC，显著改善血液标本的质量，主要是通过减少可检测细胞碎片和聚集物的形成，并且用作富集方法的稳定剂和固定剂。最重要的是，发现了有效稳定剂能减少对CTC的体外损伤和血液标本质量的降低，提供了患者CTC的更完整的体内状态的图象。在图5中示出的完整CTC，受损的或怀疑的CTC的数量以及对CTC的破坏程度是肿瘤负担，肿瘤细胞的增殖潜力和/或治疗效果的诊断上重要的指标。相反，使用未稳定化样品的现有技术对CTC造成了无法避免的体内损伤或可以避免的体外保存和加工损伤，并因此产生有关患者CTC和肿瘤负担的错误信息。分析来自受损CTC的片段和碎片对于了解在患者体内所发生的情况是重要的。因此，在题为“循环的肿瘤细胞、片段和碎片的分析”的共同未决申请中，披露了进行所述分析的方法和试剂。所述共同拥有的专利申请被收作本文参考。
将通过以下实施例对本发明进行说明，这些实施例并不是要限定本发明的范围，而是要提供本发明的一般用途的案例。
实施例1血液中循环的肿瘤细胞的稳定Cyto-ChexTM，StabilCyteTM和TRANSfixTM是商业出售的三种稳定剂的例子，并且业已证实了在长期稳定血液标本中的血细胞方面的用途。对所述稳定剂进行优化，以便保持细胞大小(主要是通过减少收缩)并且保护细胞表面上的抗原，主要是通过流式细胞测定技术确定的。预期的用途一般涉及直接分析，并且不需要对样品进行过多的操作或富集特定细胞群。相反，在本发明中分离并检测的循环的肿瘤细胞或其他罕见靶细胞，包括并且被确定为以非常低的频率出现的病理学异常或罕见细胞，因此，在检测之前需要显著富集。
CTC通常可以在血液中检测到，最好是在室温下或在2-8℃下保存24小时之后也能检测到，但是由于上述原因这些细胞可能变得更脆弱。业已证实，任何操作或富集方法都能破坏所述脆弱的细胞，因此导致潜在的细胞减少和在分离过程中碎片或聚集物的形成。图1和2表示在保存长达24小时的时候某些标本中CTC的显著减少。
在该实施例中，检查了在从保存24小时的标本中富集之后，不同的稳定剂对CTC回收的影响。从晚期癌患者体内获得血液样品，并且在抽血之后2小时内用稳定剂处理。将从每一位患者体内抽取到不同的装有EDTA的试管中的血液合并，并且将相同的体积分装到不同试管中。将包括Cyto-ChexTM稳定剂和StabilCyteTM稳定剂和TRANSfixTM稳定剂的各种添加剂添加到所述不同试管中，使用量为30％Cyto-ChexTM稳定剂，20％StabilCyteTM稳定剂和10％TRANSfixTM稳定剂，其中，所述比例是血液体积的百分比。将一个试管用作对照，其中不添加缓冲液或稳定剂。然后混合所述样品，并且在室温下保存24小时。将等体积的Immunicon System缓冲液(含有0.5％BSA，0.2％酪蛋白和0.1％叠氮化钠的PBS)添加到每一种样品中。在混合之后，以800xg的速度离心样品10分钟，以便除去血浆。以1.5倍起始血液体积的最终体积将Immunicon AB缓冲液(含有链亲和素作为受控制的可恢复聚集的System缓冲液，披露于美国专利#09/351,515和#09/702中的技术，以上专利申请被收作本文参考)添加到每一只试管中。在混合样品之后，将CAEpCAM铁流体(与抗EpCAM抗体偶联的0.20微米的磁性颗粒，并且用脱硫生物素作为受控制的可恢复聚集的介质)添加到所述样品中，以便磁标记CTC。
将所述样品用CAEpCAM铁流体在Immunicon四极高梯度磁力分离机(QMS17；美国专利号5,186,827和5,466,574，这两份专利都被收作本文参考)温育两个10分钟的时间，在每一个10分钟之后，在QMS17磁铁外面再次混合，正如在本收作本文参考的美国申请号#09/240,939中所披露的。在所述磁温育之后，对所述样品进行磁力分离20分钟。将未收集的级份吸出，并且将所述试管从QMS17中取出。将磁力收集的级份重新悬浮在System缓冲液中，并且在QMS17中再次分离10分钟。再次将未收集的级分吸出，并且将收集的细胞重新悬浮在200微升ImmunipermTM(含有0.05％皂苷的PBS)中，以便透化所捕获的细胞，以便能够进行细胞内染色。用由若干种荧光标记组成的混合物对透化的样品进行染色15分钟，所述荧光标记为20微升抗细胞角蛋白-PE，20微升抗-CD45-APC和20微升DAPI。抗细胞角蛋白能对上皮细胞染色，而抗CD45能对白细胞进行染色，以便区分任何非特异性染色的白细胞和目标CTC。将DAPI用于鉴定所有有核的细胞，并用于从无核的细胞碎片中区分细胞。在通过磁力分离洗掉多余的染色剂之后，将所述样品重新悬浮在300微升ImmuniconCellFixTM中(System缓冲液也含有0.5％BSA，10mg/mL生物素和25％Cyto-ChexTM稳定剂)。
将每一种样品转移到一个Immunicon CellSpotter室中(如在被收作本文参考的美国专利申请号10/074,900中所披露的)，将一个具有光学平面、透明的上部观察窗口的样品池状外壳设计成安装到双极倾斜的磁性组件中(如在被收作本文参考的US#6,136,182中所披露的)。将磁标记的靶细胞磁力收集在观察窗口的下面，以便能够通过荧光显微镜成像。用四个不同的滤光器对样品室表面进行自动扫描。由软件收集并且分析图象，但是仅提供细胞角蛋白-PE和DAPI都是阳性的图象作为潜在的CTC候选物，用于随后的再次观察和分类。在证实形态学和细胞角蛋白PE和DAP I的阳性染色，但全白细胞标记CD45-APC为阴性染色之后，计数分类的完整的CTC，怀疑的CTC和“不确定事件”(碎片颗粒)。表1表示在分析之前将来自8个癌症患者的样品在各种稳定剂中保存2 4小时的影响。有关结果是以“完整的CTC”，“怀疑的CTC”，和“不确定事件”事件形式表示的。
表1稳定剂在临床样品中的作用(在室温下24小时之后)

N＝无稳定剂T＝TRANSfixTM稳定剂S＝StabilCyteTM稳定剂C＝Cyto-ChexTM稳定剂与不添加稳定剂的血液样品相比，在用所有三种稳定剂保存血液样品24小时之后，在大部分患者样品中检测到更大数量的完整的和怀疑的CTC。有可能在未稳定的标本中发生了完整的CTC向怀疑的CTC的显著转变，或者所述细胞消失了。对所述数据进行统计学分析，发现了在使用稳定剂和不使用稳定剂时CTC总数的显著差别(p值＝0.02)。这种差别在乳腺癌和前列腺癌样品中都出现了。不过，三种实验过的稳定剂之间没有差别(p-值＝0.18)。在存在稳定剂的情况下检测到的较大数量的完整的和怀疑的CTC，不被认为是由于非特异性染色产生的假象，因为在来自正常供体的保存24小时的样品中，没有观察到这种作用。以上数据明确表明，向来自癌症患者的血液样品中添加稳定剂在保存期间，以及在样品加工步骤中能保存循环的肿瘤细胞，因此能够对完整的CTC和推测的CTC的体内水平进行更精确的分类。
实施例2为了分析而保持样品质量CTC以低的频率存在于血液中，并且需要大的样品体积和有效的富集方法以便检测。CTC的富集方法包括若干洗涤步骤，包括磁力分离方法，该方法可能损坏细胞，并且由于DNA从细胞中渗露而产生碎片和团块。不过，意外地，并且相当吃惊地发现，在nutator上对血液试管进行温和的立式圆筒混合(大多数血液学实验室通常都是通过这种方式保持血细胞的悬浮状态)，会导致大量细胞碎片的形成，这些碎片可能干扰CTC的检测和统计。另外，业已发现不完全填充抽血或分析试管，进一步加重了这种混合损伤，但是，在静止的试管中没有出现损伤。如图3所示，在运输或其他机械胁迫期间对患者样品的任何混合，都被证实能意外地增加干扰性碎片。表2表示在运输血液样品过夜之后，Cyto-ChexTM稳定剂对CTC回收的影响。CTC的检测需要大的样品体积，以及特殊的技能和设备，这些通常不是每一个临床实验室都具备的。结果，需要将这些血液样品运送到中央实验室进行加工。正如前面所提到过的，CTC是脆弱的，并且在运输期间的任何机械混合或震动，都可能损伤这种细胞。正如在本发明中所披露的，我们的资料表明，决对有必要添加稳定剂，以便在血液标本的转运、保存、和加工之前，保持CTC和样品质量。
到目前为止，对CTC和样品质量的这种不利影响有可能逃脱检测，因为所述受到胁迫的样品，可能仍然能满足大部分实验室或临床分析的需要。例如，通过流式细胞测定技术进行的免疫表型分类，不需要任何富集方法，并且碎片的存在明显不会干扰分析。不过，我们的发现表明，在通过显微镜或其他光学方法分析富集的罕见靶细胞时，保持血液样品质量是非常重要的。
实施例3Cyto-ChexTM稳定剂对混合2-3小时的正常标本的样品质量的影响如果细胞核完整的话，DAPI对细胞核的染色通常可以在透化的活或死亡的细胞内检测到。如果DNA渗露到细胞外面，在细胞片段或细胞碎片中，同样能检测DNA染色如细胞外面的可染色的聚集物。因此，用DAPI染色，并且在荧光显微镜下检查，可以方便地检查样品质量。
将来自正常供体的三管血液吸入10毫升的EDTA抗凝试管中。在不取下盖子的情况下，通过使用CellStabilizeTM注射装置按以下方法将Cyto-ChexTM稳定剂添加到一个血液试管中。将所述血液试管放入具有刻度的校正装置中，并且可以估算血液体积，以便能够添加适量的稳定剂至需要的最终浓度。将一个针头(27G，1/2英寸)插入试管的盖子，形成一个排气管，并且使用第二个针头(20G，1.5英寸)和注射器将需要体积的稳定剂注入所述试管。将所述标本试管从所述装置中取出，并且通过颠倒试管若干次，进行混合。在nutator混合器上将两种血液标本一种不使用稳定剂，另一个试管添加了30％Cyto-ChexTM稳定剂，混合2-3小时，以便模拟运输条件。将没有混合的第三个血液试管用作不含稳定剂的对照。在2-3小时之后，将7.5mL的血液从每一个“无稳定剂”试管中，以及将9.75mL的血液从“Cyto-ChexTM稳定剂”试管中，转移到不同的15ml聚丙烯离心管中，以便按实施例1的方法加工。
将所述样品转移到Immunicon CellSpotter室中，用荧光成像显微镜进行CellSpotter分析。在四种不同的滤光器中对所述样品的靶细胞进行扫描，所述靶细胞业已通过磁力排列在所述样品室的观察窗口下面。保存来自不同滤光器的图象。根据可检测DAPI染色事件的数量(完整的CTC，怀疑的CTC和可染色的“不确定事件”或碎片)的数量确定样品质量，与可检测的有核CTC和非靶细胞的数量进行比较。为了获得最佳样品质量，可染色的细胞碎片和聚集物必须保持较小，以便能够精确检测和计数完整的CTC和怀疑的CTC。
图3中的图象表示在不使用稳定剂的情况下转运血液试管的破坏作用(图3a)，与添加了30％Cyto-ChexTM稳定剂的试管进行了比较(图3b)。类似地，图4a，4b和4c表示DAPI对细胞核的染色。与不使用稳定剂或混合的对照样品(图4a)和使用Cyto-ChexTM稳定剂并且混合的样品(图4c)相比，在不存在任何稳定剂的条件下对样品进行混合时，有大量DAPI可染色的细胞团块和DNA碎片(图4b)。以上结果意外地证实了混合血液样品，不仅损伤脆弱的CTC，而且还能损伤正常的造血细胞，因此在富集之后产生了可以检测的碎片和聚集物。令人吃惊的是，发现了在混合样品之前向血液样品中添加稳定剂，能够减少细胞损伤并且保持样品质量。
实施例4在运输期间Cyto-ChexTM稳定剂对循环的肿瘤细胞的影响在本实施例中，两试管的EDTA抗凝血是从31位晚期癌症患者体内抽取的(其中3位患者是在不同时间接收的重复的患者)。用实施例3所披露的CellStabilizeTM装置，通过通风将Cyto-ChexTM稳定剂直接注入一组试管中，以便Cyto-ChexTM的最终体积占总体积的30％。第二组试管是未处理的对照。然后通过夜间服务在不使用冰包的情况下将两种样品运送到Immunicon。通过富集CTC对保存1天的样品进行加工，并且通过CellSpotterTM分析检测。在本实施例中用于富集和检测CTC的方法，类似于在实施例1中所使用的方法。在表2中示出了添加和不添加Cyto-ChexTM稳定剂的血液样品的结果。
表II

无-不添加稳定剂有-添加30％(最终体积)Cyto-ChexTM*＝5ml标本，所有其他标本为7.5ml出现一个以上完整的CTC的所有样品都被认为是阳性的。对无和有稳定剂的数据组进行Wilcoxon符号秩检验，得到了以下p-值·完整的CTC，p＜0.0004(非常显著)·怀疑的CTC，p＜0.155(不显著)，·不确定事件，p＜0.0327(显著)。
在添加Cyto-ChexTM稳定剂时，大部分标本成阳性或表现出完整CTC的增加。在未稳定化标本中检测到更多完整的CTC或推测的CTC的情况可能是假象，并且导致在区分被确定为“不确定事件”的无特殊性细胞形态学的可染色的碎片和聚集物与完整的或推测的CTC时的难度。与未稳定化标本相比，在稳定化标本中检测到平均多出大约3倍的完整CTC。以上结果证实了全血稳定剂在保护肿瘤细胞和标本质量方面的意外的保护作用。
实施例524小时和72小时稳定化在运输研究中(实施例4)，证实了稳定化能在抽血之后处理24小时的样品中保存细胞。不过，还可能需要细胞稳定至少72小时。在本实施例中，在抽血之后对血液样品进行24和72小时的加工，并且按以下方式分析从转移性癌症患者体内获得最少两个10ml EDTAVacutainersTM试管的血液(每个试管大约8mL血液)。在抽血之后15分钟之内，将适量的CytoChexTM人工添加到每一个EDTA试管中，以便使CytoChexTM的体积占30％，使用在实施例3中所披露的CellStabilizeTM注射装置。
在接收到血液标本之后，合并血液，并且在24小时和/或72小时，用相同的测定方法检测7.5mL稳定化的血液，并且使用与实施例1中所披露的相同的CellSpotter系统进行分析。在这两个时间点上比较CTC。在90％幂的条件下，为了检测两侧p值为0.01的0.95的预期相关系数，一共需要具有成对值的8个标本。在24小时和72小时的对比中，一共有28个具有成对值的标本，不过，一个样品具有极高的CTC，并且在图6中没有出现。
图6表示在24小时和72小时具有正常的CTC结果的27个标本的曲线图。在曲线上示出了回归方程，r2值，相关系数，和t检验p值。r2值和Pearson′s相关系数表明，24小时之后的CTC数量与72小时的数量高度相关，并且t检验表明，这两个数量的平均值在统计学上没有显著差异(24小时＝11，72小时＝11)。曲线的斜率(1.0803)表明，在用血液稳定剂温育24小时和72小时之后，具有大致相同数量的CTC。Wilcoxon′s非参数符号秩检验进一步证实了在这两个时间点上的两种CTC数量没有显著差别(p＝0.9105)。以上结果表明，在用稳定剂温育72小时之后没有CTC的损失。并且在72小时的时候CTC的数量几乎与在24小时的之后的数量相同。
实施例6添加稳定剂的方式正如上文所提到过的，血液中的CTC是以不同形式(如完整的，受损的等)存在的，并且，它们通常是脆弱的。一旦将血液抽入试管中，需要马上添加稳定剂，以便防止细胞在试管中进一步受损。不过，控制添加时间是一个困难的过程，它取决于抽血的场所。某些抽血的场所可能不一定具有稳定剂，因此，需要将样品送到另一个场所去添加稳定剂。由此产生了不同的稳定剂添加时间。即使是在所述场所，稳定剂的添加时间也取决于抽取的试管的数量。抽血的放血医师可能不添加稳定剂，但是会将样品转移给其他技术人员以便添加稳定剂。
然后，优选的稳定剂能够以浓缩的液体或水溶液的稀释形式或缓冲液形式使用，以便减少瞬时接触高渗条件，并且对细胞造成潜在损伤。优选在抽血之前将液体或固体稳定剂添加到抽血容器中，或者起码在抽血之后马上添加，以便获得最大保护作用，防止因为在抽血期间的紊流所导致的损伤。
预先填充的血液采集试管，例如10ml Vacutainer试管(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)或Vacuette试管(购自GreinerAmerica，Lake Mary，FL)是通过商业渠道获得的，在抽真空之前，预先填充大约2mL的液体试剂或颗粒状包衣材料。生产预先填充的试管的其他方法包括冷冻液体的常规原位冷冻干燥。另一项专利技术采用分离的冷冻干燥的珠，即所谓的LyoSpheres(US#6,106,836；AkzoNobel N.V.，Netherlands)，和Biolyph，(Minneapolis，MN)，它是通过将250微升的液滴滴入液氮中，然后通过在容器内部对冷冻的珠进行常规冷冻干燥而制备的，以便形成磁力的刚性珠。
总之，实施例1-6证实了向血液样品中添加稳定剂能保持样品质量，以及在用于本发明的富集测定方法中保护CTC。应当理解的是，稳定剂的最佳用量可以改变，并且取决于稳定剂的类型和物理状态，所述物理状态如在实施例6中所披露的，包括液体，冷冻干燥的小团以至粉末。例如，尽管业已发现Cyto-ChexTM稳定剂的浓度范围可以在1-50％之间，优选大约5-40％，对于TRANSfixTM稳定剂来说，最优选大约10-30％，以及0.1-30％，优选大约1-25％，最优选大约1-10％，应当理解的是，其他类型稳定剂的浓度或用量可能不同于以上特定范围，并且必须针对每一种稳定剂和用途进行优化。理想的是，抗凝剂和所述稳定剂以占生物标本总体积的大约0.1-50％，更优选大约0.3-30％，最优选0.3-5％的体积添加，同时保持同样有效浓度的稳定剂。更重要的是，较小的稀释是更理想的。
本领域技术人员通过参考上面所引用的美国专利及其所披露的优选实施方案，可以方便地理解本发明所提供的改进。本发明的一个特别的优点特征是，它披露了用于在保存和富集过程中保护全血中的罕见靶细胞和CTC的稳定剂。本发明所提供的其他优点是通过在抽血之前或在抽血之后马上添加稳定剂，并且以液体和固体形式使用所述稳定剂而产生的。本发明所进行的改进业已通过上述实施例1-6中的优选实施方案形式进行了说明和解释。
本发明还改进了完整的CTC、怀疑的CTC、不确定事件的分析，后者包括在抽血时出现的或在加工期间形成的碎片和/或聚集物。本发明是为了开发本发明的改进的组合物和方法而进行的深入研究项目的结果，本发明特别采用所述组合物和方法来稳定罕见细胞，特别是CTC。相信本文所披露的采用了上述改进的本发明的优选实施方案，使得本发明能够用于除了癌症诊断以外的领域和用途。本领域技术人员可以理解的是，本发明的改进的诊断方法并不局限于上述优选实施方案的说明。最后，尽管上面所提供的某些实施方案提供了详细说明，以下权利要求书并不局限于所述详细说明的范围。实际上，在不超出以下权利要求书的构思的前提下，可以对它进行各种改进。
权利要求
1.一种用于保存生物学标本的组合物，由以下成分组成a.抗凝剂，和b.稳定剂。
2.如权利要求1的组合物，其中，所述抗凝剂是螯合剂。
3.如权利要求2的组合物，其中，所述抗凝剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，和亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)。
4.如权利要求1的组合物，其中，所述抗凝剂是配合剂。
5.如权利要求4的组合物，其中，所述抗凝剂选自肝素和柠檬酸盐。
6.如权利要求1的组合物，其中，所述稳定剂是甲醛供体。
7.如权利要求6的组合物，其中，所述甲醛供体选自下组胺或酰胺的羟甲基或羟基甲基衍生物，二偶氮烷基脲，咪唑烷基脲，乌洛托品，和低聚甲醛。
8.如权利要求1的组合物，其中，所述稳定剂是醛。
9.如权利要求8的组合物，其中，所述醛类选自下组甲醛，戊二醛和乙二醛。
10.如权利要求1的组合物，其中，所述稳定剂是甲醛供体或与至少一种重金属元素结合的醛类。
11.如权利要求10的组合物，其中，所述重金属元素选自下组铬、锰和锌。
12.如权利要求1的组合物，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇。
13.如权利要求12的组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约1000-大约35000。
14.如权利要求12的组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约5000-大约20000。
15.如权利要求12的组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约8000-大约20000。
16.一种用于保存被怀疑含有循环的肿瘤细胞的血液标本的组合物，由以下成分组成a.抗凝剂，和b.稳定剂。
17.如权利要求16的组合物，其中，所述抗凝剂是螯合剂。
18.如权利要求17的组合物，其中，所述抗凝剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，和亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)。
19.如权利要求16的组合物，其中，所述抗凝剂是配合剂。
20.如权利要求19的组合物，其中，所述抗凝剂选自肝素和柠檬酸盐。
21.如权利要求16的组合物，其中，所述稳定剂是甲醛供体。
22.如权利要求21的组合物，其中，所述甲醛供体选自下组胺或酰胺的羟甲基或羟基甲基衍生物，二偶氮烷基脲，咪唑烷基脲，乌洛托品，和低聚甲醛。
23.如权利要求16的组合物，其中，所述稳定剂是醛类。
24.如权利要求23的组合物，其中，所述醛类选自下组甲醛，戊二醛和乙二醛。
25.如权利要求16的组合物，其中，所述稳定剂是甲醛供体或与至少一种重金属元素结合的醛类。
26.如权利要求25的组合物，其中，所述重金属元素选自下组铬、锰和锌。
27.如权利要求16的组合物，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇。
28.如权利要求27的组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约1000-大约35000。
29.如权利要求27的组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约5000-大约20000。
30.如权利要求27的组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约8000-大约20000。
31.一种稳定化细胞组合物，由以下成分组成a.生物学标本，b.抗凝剂，和b.稳定剂。
32.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，所述生物学标本是怀疑含有循环的肿瘤细胞的血液部分。
33.如权利要求32的稳定化细胞组合物，其中，所述循环的肿瘤细胞业已通过所述稳定剂稳定化。
34.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，所述抗凝剂是螯合剂
35.如权利要求34的稳定化细胞组合物，其中，所述抗凝剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，和亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)。
36.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，所述抗凝剂是配合剂。
37.如权利要求36的稳定化细胞组合物，其中，所述抗凝剂选自肝素和柠檬酸盐。
38.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，所述稳定剂是甲醛供体。
39.如权利要求38的稳定化细胞组合物，其中，所述甲醛供体选自下组胺或酰胺的羟甲基或羟基甲基衍生物，二偶氮烷基脲，咪唑烷基脲，乌洛托品，和低聚甲醛。
40.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，所述稳定剂是醛类。
41.如权利要求40的稳定化细胞组合物，其中，所述醛类选自下组甲醛，戊二醛和乙二醛。
42.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，所述稳定剂是甲醛供体或与至少一种重金属元素结合的醛类。
43.如权利要求42的稳定化细胞组合物，其中，所述重金属元素选自下组铬、锰和锌。
44.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇。
45.如权利要求44的稳定化细胞组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约1000-大约35000。
46.如权利要求44的稳定化细胞组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约5000-大约20000。
47.如权利要求44的稳定化细胞组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约8000-大约20000。
48.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，所述抗凝剂和所述稳定剂是以占所述生物学标本总体积大约0.1-大约50％的体积添加的。
49.如权利要求47的稳定化细胞组合物，其中，所述体积占所述生物学标本总体积大约0.3-大约30％。
50.如权利要求47的稳定化细胞组合物，其中，所述体积占所述生物学标本总体积大约0.3-大约5％。
51.一种用于保存生物学标本的方法，由以下步骤组成a.获得包括细胞的生物学标本，和b.让所述生物学标本与能够稳定所述细胞的稳定剂接触。
52.如权利要求51的方法，其中，所述稳定剂是甲醛供体。
53.如权利要求52的方法，其中，所述甲醛供体选自下组胺或酰胺的羟甲基或羟基甲基衍生物，二偶氮烷基脲，咪唑烷基脲，乌洛托品，和低聚甲醛。
54.如权利要求51的方法，其中，所述稳定剂是醛类。
55.如权利要求54的方法，其中，所述醛类选自下组甲醛，戊二醛和乙二醛。
56.如权利要求51的方法，其中，所述稳定剂是甲醛供体或与至少一种重金属元素结合的醛类。
57.如权利要求56的方法，其中，所述重金属元素选自下组铬、锰和锌。
58.如权利要求51的方法，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇。
59.如权利要求58的方法，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约1000-大约35000。
60.如权利要求58的方法，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约5000-大约20000。
61.如权利要求58的方法，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约8000-大约20000。
62.如权利要求51的方法，其中，所述标本还与一种抗凝剂接触。
63.如权利要求62的方法，其中，所述抗凝剂是螯合剂。
64.如权利要求63的方法，其中，所述抗凝剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，和亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)。
65.如权利要求62的方法，其中，所述抗凝剂是配合剂。
66.如权利要求65的方法，其中，所述抗凝剂选自肝素和柠檬酸盐。
67.如权利要求62的方法，其中，所述抗凝剂和所述稳定剂是在接触生物学标本之前混合的。
68.如权利要求67的方法，其中，所述抗凝剂是螯合剂。
69.如权利要求68的方法，其中，所述抗凝剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，和亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)。
70.如权利要求67的方法，其中，所述抗凝剂是配合剂。
71.如权利要求70的方法，其中，所述抗凝剂选自肝素和柠檬酸盐。
72.如权利要求67的方法，其中，所述抗凝剂和所述稳定剂的体积占所述生物学标本总体积的大约0.1-大约50％。
73.如权利要求72的方法，其中，所述体积占所述生物学标本总体积的大约0.3-大约30％。
74.如权利要求72的方法，其中，所述体积占所述生物学标本总体积的大约0.3-5％。
75.一种用于保存怀疑含有循环的肿瘤细胞的血液样品的方法，由以下步骤组成a.获得含有细胞的生物学标本，和b.让所述生物学标本与能够稳定所述细胞的稳定剂接触。
76.如权利要求75的方法，其中，所述稳定剂是甲醛供体。
77.如权利要求76的方法，其中，所述甲醛供体选自下组胺或酰胺的羟甲基或羟基甲基衍生物，二偶氮烷基脲，咪唑烷基脲，乌洛托品，和低聚甲醛。
78.如权利要求75的方法，其中，所述稳定剂是醛类。
79.如权利要求78的方法，其中，所述醛类选自下组甲醛，戊二醛和乙二醛。
80.如权利要求75的方法，其中，所述稳定剂是甲醛供体或与至少一种重金属元素结合的醛类。
81.如权利要求80的方法，其中，所述重金属元素选自下组铬、锰和锌。
82.如权利要求75的方法，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇。
83.如权利要求82的方法，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约1000-大约35000。
84.如权利要求82的方法，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约5000-大约20000。
85.如权利要求82的组合物，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约8000-大约20000。
86.如权利要求75的方法，其中，所述标本还与一种抗凝剂接触。
87.如权利要求86的方法，其中，所述抗凝剂是螯合剂。
88.如权利要求87的方法，其中，所述抗凝剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，和亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)。
89.如权利要求86的方法，其中，所述抗凝剂是配合剂。
90.如权利要求89的方法，其中，所述抗凝剂选自肝素和柠檬酸盐。
91.如权利要求86的方法，其中，所述抗凝剂和所述稳定剂是在接触生物学标本之前混合的。
92.如权利要求91的方法，其中，所述抗凝剂是螯合剂。
93.如权利要求92的方法，其中，所述抗凝剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，和亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)。
94.如权利要求91的方法，其中，所述抗凝剂是配合剂。
95.如权利要求93的方法，其中，所述抗凝剂选自肝素和柠檬酸盐。
96.如权利要求86的方法，其中，所述抗凝剂和所述稳定剂的体积占所述生物学标本总体积的大约0.1-大约50％。
97.如权利要求96的方法，其中，所述体积占所述生物学标本总体积的大约0.3-大约30％。
98.如权利要求96的方法，其中，所述体积占所述生物学标本总体积的大约0.3-大约5％。
99.一种用于保存血液标本的由抽真空的抽血试管组成的装置，所述试管装有a.抗凝剂，和b.稳定剂。
100.如权利要求99的装置，其中，所述抗凝剂是螯合剂。
101.如权利要求100的装置，其中，所述抗凝剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，和亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)。
102.如权利要求99的装置，其中，所述抗凝剂是配合剂。
103.如权利要求102的装置，其中，所述抗凝剂选自肝素和柠檬酸盐。
104.如权利要求99的装置，其中，所述稳定剂是甲醛供体。
105.如权利要求104的装置，其中，所述甲醛供体选自下组胺或酰胺的羟甲基或羟基甲基衍生物，二偶氮烷基脲，咪唑烷基脲，乌洛托品，和低聚甲醛。
106.如权利要求99的装置，其中，所述稳定剂是醛类。
107.如权利要求106的装置，其中，所述醛类选自下组甲醛，戊二醛和乙二醛。
108.如权利要求99的装置，其中，所述稳定剂是甲醛供体或与至少一种重金属元素结合的醛类。
109.如权利要求108的装置，其中，所述重金属元素选自下组铬、锰和锌。
110.如权利要求99的装置，其中，另一种稳定剂业已经过冷冻干燥。
111.如权利要求99的装置，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇。
112.如权利要求111的装置，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约1000-大约35000。
113.如权利要求112的装置，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约5000-大约20000。
114.如权利要求112的装置，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约8000-大约20000。
115.如权利要求111的装置，其中，另一种稳定剂业已经过冷冻干燥。
116.如权利要求99的装置，其中，所述抗凝剂和所述稳定剂的体积占所述抽血试管总体积的大约0.1-大约50％。
117.如权利要求116的装置，其中，所述体积占所述抽血试管总体积的大约0.3-大约30％。
118.如权利要求116的装置，其中，所述体积占所述抽血试管总体积的大约0.3-大约5％。
119.一种用于保存怀疑含有循环的肿瘤细胞的血液样品的由抽真空的抽血试管组成的装置，所述试管装有a.抗凝剂，和b.稳定剂。
120.如权利要求119的装置，其中，所述抗凝剂是螯合剂。
121.如权利要求120的装置，其中，所述抗凝剂选自下组乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，2-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)，和亚乙基双(氧亚乙基次氮基)四乙酸(EGTA)。
122.如权利要求119的装置，其中，所述抗凝剂是配合剂。
123.如权利要求122的装置，其中，所述抗凝剂选自肝素和柠檬酸盐。
124.如权利要求119的装置，其中，所述稳定剂是甲醛供体。
125.如权利要求123的装置，其中，所述甲醛供体选自下组胺或酰胺的羟甲基或羟基甲基衍生物，二偶氮烷基脲，咪唑烷基脲，乌洛托品，和低聚甲醛。
126.如权利要求119的装置，其中，所述稳定剂是醛类。
127.如权利要求126的装置，其中，所述醛类选自下组甲醛，戊二醛和乙二醛。
128.如权利要求119的装置，其中，所述稳定剂是甲醛供体或与至少一种重金属元素结合的醛类。
129.如权利要求128的装置，其中，所述重金属元素选自下组铬、锰和锌。
130.如权利要求119的装置，其中，另一种稳定剂业已经过冷冻干燥。
131.如权利要求119的装置，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇。
132.如权利要求131的装置，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约1000-大约35000。
133.如权利要求131的装置，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约5000-大约20000。
134.如权利要求131的装置，其中，所述聚乙二醇的分子量范围为大约8000-大约20000。
135.如权利要求131的装置，其中，另一种稳定剂业已经过冷冻干燥。
136.如权利要求119的装置，其中，所述抗凝剂和所述稳定剂的体积占所述抽血试管总体积的大约0.1-大约50％。
137.如权利要求136的装置，其中，所述体积范围占所述抽血试管总体积的大约0.3-大约30％。
138.如权利要求136的装置，其中，所述体积范围占所述抽血试管总体积的大约0.3-大约5％。
139.如权利要求1的组合物，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇，其浓度占标本体积的大约0.1-大约5％，优选大约0.5-大约1％，最优选大约0.1-大约0.5％。
140.如权利要求16的组合物，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇，其浓度占标本体积的大约0.1-大约5％，优选大约0.5-大约1％，最优选大约0.1-大约0.5％。
141.如权利要求31的稳定化细胞组合物，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇，其浓度占标本体积的大约0.1-大约5％，优选大约0.5-大约1％，最优选大约0.1-大约0.5％。
142.如权利要求51的方法，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇，其浓度占标本体积的大约0.1-大约5％，优选大约0.5-大约1％，最优选大约0.1-大约0.5％。
143.如权利要求75的方法，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇，其浓度占标本体积的大约0.1-大约5％，优选大约0.5-大约1％，最优选大约0.1-大约0.5％。
144.如权利要求99的装置，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇，其浓度占标本体积的大约0.1-大约5％，优选大约0.5-大约1％，最优选大约0.1-大约0.5％。
145.如权利要求119的装置，其中，另一种稳定剂是聚乙二醇，其浓度占标本体积的大约0.1-大约5％，优选大约0.5-大约1％，最优选大约0.1-大约0.5％。
全文摘要
披露了用于稳定血液标本中的罕见细胞，保持血液标本的质量，以及还可用作细胞固定剂的组合物和方法，所述组合物和方法能减少靶细胞(例如，循环的肿瘤细胞)的损失，和由靶细胞，非靶细胞和血浆成分形成碎片和聚集物，以便能够更精确地分析循环的肿瘤细胞(CTC)，并对它们进行分类，并且最终分析癌症患者的肿瘤负担。在需要对来自从癌症患者抽取的血液标本中富集罕见细胞的方法中，标本的稳定化是特别必要的。业已发现，让所述标本接触有可能遇到的胁迫条件，例如正常的加工，混合，震荡，由转运血液所导致的延迟，不仅会减少CTC的数量，而且还能在血液标本中产生碎片和聚集物，发现如果存在所述碎片和聚集物的话，会干扰对靶细胞的精确计数。为了区分体内CTC分解和体外样品降解，稳定剂是必需的。
文档编号G01N33/543GK1571634SQ02820820
公开日2005年1月26日 申请日期2002年8月23日 优先权日2001年8月23日
发明者G·C·劳, M·赫尔曼, H·鲁特纳, L·特尔斯塔彭 申请人:免疫公司