专利名称：一种检测苯甲酸雌二醇的酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
一种检测苯甲酸雌ニ醇的酶联免疫试剂盒，属于免疫分析技术领域。
背景技术：
2008年的三聚氰胺事件，使三鹿集团倒闭，我国乳品企业重新洗牌，使人们对牛奶及其制品质量安全问题愈发关注。2010年8月某奶粉疑致女婴性早熟的激素门事件又将乳制品推上了风ロ浪尖。牛奶中是否有雌激素的存在和奶牛产奶数量是否受到雌激素的作用是目前人民大众急需了解的内容。无论是进ロ奶源，还是国内奶源，均有残留激素的隐患。 奶业和食品营养专家指出，奶牛吃的饲料或草料含有激素的可能性最大，在奶粉业这是ー种隐形的存在；此外，在奶牛饲养中使用的催产素、催奶素等，也可能导致激素残留。尤其近年来由于过量使用外源性性激素作为动物饲料添加剂和植物生长调节剂，导致大量食品中污染了性激素类物质。这些雌激素残留，通过食物链在人体内积累，可诱发癌变，对生殖与神经等系统带来影响，还造成严重的环境问题。虽然国家在2008年制定了《乳品质量安全监瞀管理条例》，要求加强奶畜养殖、生鲜乳收购、乳品生产、经营、进ロ等各环节的监瞀检查，明确规定禁止销售、收购和加工尚处于用药期和休药期内的奶畜产，不符合健康标准或者没有经过检疫合格的奶畜产的，以及不合法规标准的生鮮乳，从源头上控制生鮮乳的兽药残留。但是目前雌激素的检测尚未列入国标中，乳制品企业也未将其作为生鲜乳收购的检测项目，因此尚不能从源头上消除雌激素的隐患。要减小雌激素污染对食品安全和人体健康造成的威胁，必须加强市场监管，完善检测手段。而乳制品中雌激素的残留量一般较少，常规测定方法的应用受到限制，需要比较灵敏的检测方法。目前苯甲酸雌ニ醇的检测方法主要使用大型仪器，如HPLC、GC-MS、LC-MS等。但由于仪器设备价格昂贵，操作复杂、费时，不适用于大批量样品的快速检测，因此不能用于大批量样品的现场快速筛查，不能在基层单位和企业得到推广。而酶联免疫分析(ELISA)法，由于其特异性强、灵敏度高、操作简便、检测速度快，特别适于大批量样品的现场快速检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前在真菌毒素、藻毒素等的快速检测中ELISA法已经是最常用的方法。

发明内容
本发明的目的在于提供一种检测苯甲酸雌ニ醇的酶联免疫分析试剂盒及其检测方法，用于对食品中苯甲酸雌ニ醇的检测。本发明的技术方案该检测苯甲酸雌ニ醇的试剂盒是由(1)96或48孔包被板，(2)苯甲酸雌ニ醇标准品，(3)苯甲酸雌ニ醇的单抗冻干品，(4)酶标记的羊抗鼠抗体冻干品，
(5)洗涤液，(6)显色液A，(7)显色液B，(8)终止液所组成。所述的酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为HRP-羊抗鼠抗体冻干品，洗涤液为含有吐温的Tris-HCl缓冲溶液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢ニ钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯ニ胺的こ醇水溶液，終止液为硫酸溶液。本发明主要采用酶联免疫分析法(ELISA)来检测苯甲酸雌ニ醇。采用ELISA的技术主要有两个方面第一，特异性单克隆抗体的制备，利用抗原免疫小鼠，经细胞融合、选择培养、腹腔注射，经培养后抽取腹水，得到抗苯甲酸雌ニ醇的单克隆抗体；第二，苯甲酸雌ニ醇-ELISA试剂盒的制备。检测苯甲酸雌ニ醇的酶联免疫分析试剂盒的制备详见实施例I和2。苯甲酸雌ニ醇的測定方法为取包被有苯甲酸雌ニ醇与载体蛋白偶联物的微孔包被板，加入苯甲酸雌ニ醇标准或处理好的样品到各自的微孔中，再加入苯甲酸雌ニ醇抗体， 振荡反应，洗涤液洗涤，加酶标记的羊抗鼠抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，暗处静置后加終止液，在450nm处测量吸光度，对照标准曲线计算样品中的苯甲酸雌ニ醇含量。本发明的有益效果该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，检测限可达10ng/mL，特别适于大批量样品的现场快速检测。


图I为苯甲酸雌ニ醇酶联免疫分析法的标准曲线。
具体实施例方式提供以下实施例是为了更好地理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。实施例I抗苯甲酸雌ニ醇的单克隆抗体的制备苯甲酸雌ニ醇是典型的半抗原，在免疫反应中只具有反应原性，需与大分子物质结合后才有免疫原性。我们采用多元酸酐法活化苯甲酸雌ニ醇，用混合酸酐法将活化的苯甲酸雌ニ醇与载体蛋白(KLH，BSA)偶联，制备了免疫抗原苯甲酸雌ニ醇-KLH和包被抗原苯甲酸雌ニ醇-BSA。以合成的苯甲酸雌ニ醇-KLH作为人工合成的免疫抗原进行动物免疫，制备抗体。I.苯甲酸雌ニ醇-KLH和苯甲酸雌ニ醇-BSA抗原的制备称取苯甲酸雌ニ醇75. 2mg (约O. 2mmol),加入4mL含22. 8mg (约O. 2mmol)戍ニ酸酐的吡啶溶液中，室温搅拌反应22h。反应完成后，氮气吹干吡啶。残留物用8mL溶剂(DMF和1，4_ ニ噁烷I : I混合)溶解，加入O. 0524mL (约O. 2mmol)正三丁胺，冰中搅拌lOmin，加入氯甲酸异丁酯O. 0288mL (约O. 2mmol)，室温搅拌反应lh。将活化的苯甲酸雌ニ醇溶液逐滴加入10mL、0. lmol/L pH 8. 5冰冷载体蛋白硼酸钠溶液中，Ih内加完，室温搅拌反应过夜。载体用量BSA 50mg, KLH IOOmgo偶联物过S印hadex G-25层析柱提纯。用紫外吸收法測定载体浓度作为偶联物浓度。提纯的偶联物于_20°C保存。2.抗苯甲酸雌ニ醇单克隆抗体的制备将免疫抗原苯甲酸雌ニ醇-KLH与等量的福氏完全佐剂乳化，以皮下多点及腹腔注射途径对8周龄左右的BalB/c雌性小鼠进行基础免疫。间隔14天后，改为福氏不完全佐剂追加免疫，14天后再免疫一次。检测多抗效价达到I : 2000后，经尾静脉用水剂抗原加强免疫一次，3 4天后处死取出小鼠脾脏，得到脾细胞进行细胞融合。毎次免疫抗原用量为每只鼠O. 025 O. 05mg。得到的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以8 I混合，用聚こニ醇(PEG，丽4000)作融合剂。融合细胞悬于含20%小牛血清的HAT培养液内，分别于加有BalB/c小鼠腹腔渗出细胞作滋养层的96孔细胞培养板中，置6% CO2中在37°C培养。以苯甲酸雌ニ醇-BSA为包被抗原，用iELISA法对上清液中杂交瘤进行筛选，并用icELISA法确证。对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行亚克隆。置6% CO2中在37°C继续培养，直至所有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止。当连续3次100%阳性时，即可进行单抗的扩大培养。采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行扩大培养。取成年的BalB/c小鼠，于腹腔内注入液体石蜡O. 5mL, I周后于腹腔内注入杂交瘤细胞。用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混匀，并将细胞数调至4 X IO5个/mL，每只BalB/c小鼠腹腔注射O. 5mL杂交瘤细胞。10 14天后收集腹水。iELISA法检测腹水效价，测定结果显示，腹水效价为6400，ELISA最适工作浓度为单抗稀释4000倍。稀释至工作浓度后分装冻干，于-20°C长期冻存。实施例2 96孔ELISA试剂盒的制备I.包被板固相抗原制备将苯甲酸雌ニ醇-BSA用 50mmol/L Na2CO3-NaHCO3 pH9. 6 缓冲液稀释至 10mg/L 的包被液，96孔微孔板各孔加O. ImL, 4°C放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，每孔加O. 15mL含3g/L BSA的上述缓冲液封闭，4°C放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20°C冷冻保存。2.试剂的配制(I)标准品苯甲酸雌ニ醇0ng/mL, 10ng/mL, 20ng/mL, 40ng/mL, 80ng/mL, 2OOng/mL，从苯甲酸雌ニ醇纯品中稀释得到，稀释液为甲醇水体积比为I : 9。(2)抗苯甲酸雌ニ醇抗体冻干品的制备见实施例I。(3) HRP标记的羊抗鼠抗体冻干品(HRP-羊抗鼠抗体)市售。(4)洗漆液14. Smmol /T, NaCl、0. 2mL/L Tween-80 和 O. 2 % NaN3 的 SOmmoI /I,Tris-HCl ρΗ7·8。(5)显色液 A 0. 2MNa2HP04 25. 7mL, O. IM 柠檬酸 24. 3mL 和 O. 04% 的 H2O2 50mL。(6)显色液B :称取20mg四甲基联苯ニ胺(TMB)加入IOmL无水酒精中，可加热至37°C 40°C直到TMB完全溶解，加去离子水至lOOmL。(7)终止液2mol/L 的 H2SO4。3.试剂盒的组成⑴96孔板(8条X 12孔，可以拆分为单孔)，包被有苯甲酸雌ニ醇-BSA。(2)苯甲酸雌ニ醇标准液，6瓶，O. 5mL/瓶，标准液浓度为0、10、20、40、80、200ng/mL。(3)苯甲酸雌ニ醇抗体冻干品，I瓶，用时6mL蒸馏水溶解。(4)HRP-羊抗鼠抗体冻干品，I瓶，用时12mL蒸馏水溶解。(5)洗涤液，I瓶，10mL，用时以蒸馏水I : 25稀释。(6)显色液 A, I 瓶,6mL。
(7)显色液 B，I 瓶，6mL。(8)终止液，I 瓶，6mL。实施例3牛奶及乳粉样品中苯甲酸雌ニ醇的检测I.样品前处理量取5mL牛奶样品于小烧杯中，加20mL石油醚,将样品移于125mL分液漏斗中，准确移取15mL提取液(甲醇水为I : I)分次洗小烧杯，洗液一井移入分液漏斗中，振摇5min,静置分层后，放出下层提取液层，再准确移取5mL提取液重复振摇提取一次，合井下层提取液层。取2mL提取液(提取液如果不清澈需过膜)，加水SmL摇匀即为待测液。乳粉样品水溶后前处理同牛奶。 2. ELISA 操作ELISA试剂盒的制备见实施例2。取苯甲酸雌ニ醇-BSA板条室温下放置lOmin。每孔加O. 25mL洗涤液洗二次，拍干。加入O. 05mL的苯甲酸雌ニ醇标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头。加O. 05mL苯甲酸雌ニ醇抗体，移液器管尖不要接触到孔中的液体。37°C下暗处静置30min后，甩掉反应液，洗涤液洗三次，拍干。每孔加O. ImLHRP-羊抗鼠抗体，37°C下暗处静置30min后，甩掉反应液，洗涤液洗三次，拍干。每孔加O. 05mL显色液A和
O.05mL显色液B，暗处静置15min后，每孔加O. 05mL终止液测量吸光度值，从标准曲线计算样品中的苯甲酸雌ニ醇含量。3.结果计算(I)定量苯甲酸雌ニ醇标准溶液浓度为0、10、20、40、80、200ng/mL，用酶标仪(450nm)测得
每孔的吸光度值(A)，绘制标准曲线。通过标准曲线，可准确定量样品中苯甲酸雌ニ醇含量。标准曲线用坐标纸进行绘制，横坐标为苯甲酸雌ニ醇标准溶液浓度的对数，纵坐标为百分比，即各标准品孔和样品孔吸光度值除以Ong/mL标准品孔吸光度值(AO)再乘以100%所得。相应每个样品的苯甲酸雌ニ醇浓度可从曲线上获得，乘以样品稀释倍数可计算样品中苯甲酸雌ニ醇含量。有计算机软件可对ELSIA数据进行处理，特别适用于大量数据的处理。用免疫测定软件Ridasoft Win所得标准曲线见附图I。(2)半定量半定量的结果可通过对比样品与某一标样孔的颜色获得样品的顔色比标样孔的顔色浅则苯甲酸雌ニ醇的浓度比标样孔的浓度高，样品的顔色比标样孔的顔色深则苯甲酸雌ニ醇的浓度比标样孔的浓度低。可根据质控限直接判定是否为阳性，无需仪器測定吸光度值和数据计算。
权利要求
1.一种检测苯甲酸雌ニ醇的酶联免疫试剂盒，其中包括96或48孔包被板(1)，苯甲酸雌ニ醇标准品(2)，抗苯甲酸雌ニ醇的单抗冻干品(3)，酶标记的羊抗鼠抗体冻干品(4)，洗涤液(5)，显色液A (6)，显色液B (7)和终止液(8)。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记的羊抗鼠抗体冻干品为HRP-羊抗鼠抗体冻干品，洗涤液为含有吐温的Tris-HCl缓冲溶液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢ニ钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯ニ胺的こ醇水溶液，終止液为硫酸溶液。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在干所述的包被板(I)包被固相抗原苯甲酸雌ニ醇-BSA或苯甲酸雌ニ醇-KLH或苯甲酸雌ニ醇-OVA ;用50mmol/L pH9. 6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液将苯甲酸雌ニ醇-BSA或苯甲酸雌ニ醇-KLH或苯甲酸雌ニ醇-OVA稀释至10mg/L做为包被液,96或48孔微孔板姆孔加O. ImL包被液,4°C放置过夜,弃去包被液，冲洗三次，每孔加 O. 15mL 含 3g/L BSA 或 KLH 或 OVA 的 50mmol/L pH9. 6 的 Na2CO3-NaHCO3缓冲液封闭，4°C放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20°C冷冻保存。
4.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在干所述的苯甲酸雌ニ醇标准品(2)，共6瓶，浓度分别为0ng/mL, 10ng/mL, 20ng/mL, 40ng/mL, 80ng/mL, 200ng/mL。
5.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于所述的抗苯甲酸雌ニ醇的单抗冻干品(3)，为抗苯甲酸雌ニ醇的单克隆抗体的冻干品。
6.根据权利要求5所述的抗苯甲酸雌ニ醇的单克隆抗体，其制备方法如下将苯甲酸雌ニ醇和BSA或KLH或OVA偶联作为抗原，免疫雌性BalB/c小鼠，检测多抗效价达到I 2000后，在PEG-4000作用下将免疫的小鼠脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合，经过HAT选择培养，用间接ELISA法检测培养上清，对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行亚克隆，雌性小鼠BalB/c腹腔注射液体石蜡、杂交瘤细胞，经培养后抽取腹水，腹水中即含有抗苯甲酸雌ニ醇的特异性单克隆抗体。
7.一种用权利要求I所述的试剂盒检测苯甲酸雌ニ醇的方法，其特征在于取包被有苯甲酸雌ニ醇-BSA或苯甲酸雌ニ醇-KLH或苯甲酸雌ニ醇-OVA的微孔包被板，加入苯甲酸雌ニ醇标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入苯甲酸雌ニ醇抗体，暗处静置反应，洗涤液洗涤，加酶标记的羊抗鼠抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，暗处静置后加終止液，在450nm处测量吸光度值，对照标准曲线计算样品中的苯甲酸雌ニ醇含量。
8.根据权利要求7所述的检测苯甲酸雌ニ醇的方法，其操作为样品前处理；取包被有苯甲酸雌ニ醇-BSA或苯甲酸雌ニ醇-KLH或苯甲酸雌ニ醇-OVA的微孔包被板，加入O. 05mL的苯甲酸雌ニ醇标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加O. 05mL抗苯甲酸雌ニ醇抗体，37°C暗处静置30min，洗涤液洗三次，加O. ImL酶标记的羊抗鼠抗体，37°C暗处静置30min， 用洗涤液洗三次，加O. 05mL显色液A和O. 05L显色液B，暗处静置15min后加终止液，在450nm处测吸光度值，从标准曲线计算样品中的苯甲酸雌ニ醇含量。
全文摘要
一种检测苯甲酸雌二醇的酶联免疫试剂盒，属于免疫分析技术领域。本试剂盒采用特异性强的抗苯甲酸雌二醇单克隆抗体。微孔板包被有苯甲酸雌二醇与载体蛋白偶联物，加入苯甲酸雌二醇标准品或样品，再加入苯甲酸雌二醇单抗。游离的苯甲酸雌二醇与微孔板上的苯甲酸雌二醇与载体蛋白偶联物竞争苯甲酸雌二醇单抗，没有连接的苯甲酸雌二醇单抗被洗涤除去，加入HRP-羊抗鼠抗体，标记免疫反应后没有连接的HRP-羊抗鼠抗体被洗涤除去。加显色液、终止液后，用酶标仪测定其吸光度，吸光度的值与样品中的苯甲酸雌二醇浓度成反相关，对照标准曲线即可确定被测样品中苯甲酸雌二醇的含量。本试剂盒结构简单、使用方便、廉价、灵敏度高，检测限可达10ng/mL，主要用于大批样品的现场快速筛查。
文档编号G01N33/531GK102721811SQ20121016728
公开日2012年10月10日 申请日期2012年5月28日 优先权日2012年5月28日
发明者吕春霞, 张晓伟, 王加华, 王德国, 肖付刚 申请人:许昌学院