专利名称：一种抗酵母类真菌抗生素的快速检测方法
技术领域：
本发明属于微生物学技术领域，具体涉及一种抗酵母类真菌抗生素的快速检测方法的发明。
背景技术：
目前，通常用于体外筛选具有抗酵母类真菌活性的方法主要有药典上推荐的琼脂挖块法(中华人民共和国药典1990年，第二部，附录113，化学工业出版社，中国北京)，美国临床实验标准(NCCCLS)(NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibilitytesting of yeast.Tentative standard M27-T，PennsylvaniaNCCLS，1995.1～22.)，以及文献报道的MTT法(金哲洙，王玉书，金京玲，蔡英姬，金河奎，金正勇.烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化.中国生化药物杂志，2001，22(1)13～15)。琼脂挖块法是使用最为广泛的方法，它操作简便，直观，但工作量大，尤其是对于扩散速度慢的样品来说，该法并不适合，目前已经发现有些抗真菌活性物质在琼脂平板上并不表现出活性，而用NCCCLS法能检测到(Hiroyuki Chiba，Hitosi Agematu，Rci Kaneto，Tadashi Terasawa，Kazuya Sakai，Kazuyuki Dobashi and Takeo Yoshioka.Rhodopeptins，Novel Cyclic Tetrapeptides withAntifungal Activity from Rhodococcus sp.J Antibiotics，1999，52(8)695～699)。MTT法是新近文献报道新方法，其结果准确，但价格昂贵，对样品的大量初筛不经济。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，建立一种结果准确，快速，方便，价格经济的检测抗酵母类真菌抗生素的新方法，该方法可应用于研究开发抗酵母类真菌抗生素的过程中，特别是在初筛阶段，以达到灵敏、快捷、用量少且相关性好的目的，并且该活性筛选模型有利于提高筛选成功率，满足高通量筛选的需要。同时可用于抗生素的定量分析，便于进行抗生素合成和分离纯化过程中的活性检测以及产品质量标准的建立。
本发明通过以下技术方案实现本申请人发明了一种用美蓝-酶联免疫检测仪快速测定抗酵母类真菌抗生素的方法。其原理用美蓝对酵母染色可以用来鉴别酵母的死活，活的酵母，由于新陈代谢不停地在进行着，细胞内氧化还原值小，还原力强，能将无毒的美蓝还原脱色成无色，但死酵母则无此还原力，通过显微观察酵母的颜色可分辨酵母的死活(沈萍，范秀荣，李广武主编，微生物学实验，高等教育出版社，中国北京，1999)。酶联免疫检测仪能通过检测被测物的吸光值反映出被测物的颜色深浅，且与酶联免疫检测仪检配套使用的96孔板适用于大批量的检测。基于上述两点理论，申请人将检测品与酵母类真菌混合在一起作用一定的时间，再加入美蓝，若检测品具有抗酵母类真菌活性，则酵母活菌数就少，还原美蓝的能力就低，美蓝颜色就深，用酶联免疫检测仪检测出的吸光值就大；反之，用酶联免疫检测仪检测出的吸光值就小。于是可以将传统的酵母美蓝染色和酶联免疫检测仪结合起来，只需从检测品的OD630数值就能检测其是否具有抗酵母类真菌活性，最终能通过分析酶联免疫检测仪检测出的吸光值来大批量地筛选被检测品是否具有抗酵母类真菌的活性。
本发明包括以下步骤本发明的总体技术步骤包括将靶菌液稀释，抗生素稀释→种板→抗生素与靶菌液共同作用→酶联免疫检测仪(简称酶标仪)测定空白板吸光值→加入美蓝染液→保温→酶联免疫检测仪(简称酶标仪)测定吸光值→最后进行数据处理。其具体步骤是(1)将培养14-20h的白色念珠菌(Candida albicans)用YPD培养基稀释至1～5×105CFU(细胞数，下同)/mL，在无菌的96孔板的第1列各孔中加入YPD培养基200μL为空白对照，从第2列到最后1列每孔中加入稀释好的靶菌液100μL，除最后1列再加入100μL YPD培养基做生长对照外，其余各孔都加入无菌待测样品100μL，每个样品做三个重复；将板于室温振荡培养20-24h，于酶联免疫检测仪(MultiskanMk3酶标仪，芬兰雷勃分析仪器有限公司)检测各孔的OD630(记为A0)。在每孔中加入美蓝染液20μL，使其终浓度为0.05‰，室温下静置保温10-20min，于酶联免疫检测仪检测各孔的OD630(记为A)；(2)制备美蓝染液配制美蓝(例如吕氏碱性美蓝染液，按照沈萍等主编，微生物学实验，高等教育出版社，中国北京，1999所示的方法)的A液和B液，所述的A液是将5g美蓝溶于100mL95％的酒精中配制成美蓝酒精饱和溶液；所述的B液是配制成0.01％的KOH水溶液。将A液30mL和B液100mL混匀，过滤；(3)制备YPD培养基，其配制比例如下(按照方心芳编著，应用微生物学实验法，中国轻工业出版社，中国北京，1993所示的方法)葡萄糖2％，胰蛋白胨2％，酵母粉1％，pH5.0～5.5，121℃灭菌20min；(4)定性检测以吸光值A-A0作为最终OD630，该OD630值大于1小于2时定为有抗酵母类真菌的活性；(5)定量检测取无菌96孔板，于每一行第一列加入YPD 200μL作为空白对照，从第二列起直到最后一列加入稀释成105CFU/mL的Candida albicans靶菌液，每一行加入同一稀释度的靶菌液，再从第二列起直到倒数第二列加入标准抗生素如氟康唑(中国天津药业集团新郑股份有限公司生产，下同，中华人民共和国国药准字X2000261)100μL，每一列加入同一稀释度的标准抗生素氟康唑，使其终浓度依次为128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1 μg/mL，0.5 μg/mL，0.25μg/mL，最后一列加入YPD培养基100μL，作为生长对照孔；做三个重复；按上述测定方法测定OD630(A-A0值)，以抗生素浓度为横坐标，OD630为纵坐标作标准曲线(如

图1，是以氟康唑为标准抗生素，以C.albicans为靶标菌，使用本发明的方法获得的标准曲线)。待测样品按同样条件操作，根据OD630从标准曲线上求得相应的浓度。
本发明所指的酵母类真菌包括白色念珠菌Candida albicans，，毕赤氏酵母Pichia pastoris，，新型隐球酵母Cyptococcus neoformans，，酿酒酵母Saccharomyces cerevisae，所述的菌属于其活细胞能使美蓝染液褪色的酵母菌。上述菌根据实验的需要既可以作为靶标菌，也可以作为靶菌液使用，附图及其图面的说明图1是以氟康唑为标准抗生素，以Candida albicans为靶标菌，使用本发明的方法获得的标准曲线。图中横坐标为抗生素氟康唑浓度，下同；纵坐标为OD630，下同。
图2是靶菌液为毕赤氏酵母Pichia Pastoris以氟康唑为标准抗生素的曲线图3是靶菌液为新型隐球酵母Cyptococcus neoformans以氟康唑为标准抗生素的曲线图4是本发明的效果，即靶菌液为酿酒酵母Saccharomyces cerevisae，以氟康唑为标准抗生素的曲线。
本发明的积极效果是表1本发明与对照琼脂挖块法和MTT法的实施效果比较方法 优点缺点本发明(美蓝-酶联免疫检 用量少，快速，廉价，准确，灵敏。对样本要求无菌测法)琼脂挖块法(对照) 方便，直观 工作量大，繁琐，与样本在琼脂里的扩散速度有关MTT法(对照) 用量少，快速，准确，灵敏对样本要求无菌，MTT昂贵具体实施方式
实施例1申请人分别用本发明的美蓝法(具体操作见本说明书前面的描述的方法)和琼脂挖块法(见本说明书关于该方法的参考文献所示的方法)(对照)对600个样品进行初步筛选，结果发现用本发明的美蓝法筛选到的具有抗真菌活性的样品69个，用经典的琼脂挖块法(对照)筛选到的具有抗真菌活性的样品有54个，且这54个样本完全被包含在前面的69个样本中，见表2。从表2可以看出本发明的方法较琼脂挖块法灵敏，当样品用本发明筛选不能检测到活性时，用琼脂挖块法也检测不到；当样品用琼脂挖块法筛选能检测到活性时，就一定能用本发明筛选得到。在进行抗酵母类真菌活性物质的初筛时，由于发酵上清液中的活性物质含量很低，用琼脂挖块法就有可能因样品在琼脂里扩散速度慢而漏筛掉具有新结构的活性物质(沈萍等主编，微生物学实验，高等教育出版社，中国北京，1999)；而本发明的方法具有试剂用量少，灵敏性高的特点，不容易漏筛有活性的样品，可以得到较准确的结果。
表2本发明与对照琼脂挖块法用于筛选样品时的灵敏性比较本发明(美蓝-琼脂挖块法(对 检出样品数 检出样品所占百分比(％)酶联免疫检测照)- + 00+ - 15 2.5+ + 54 9- - 531 88.5注表中“+”代表有活性，“-”代表无活性实施例2海洋微生物抗C.albicans活性的筛选申请人从中国海南岛沿海采集海泥、红树林土壤、海藻等样品，从中分离海洋细菌(包括放线菌)、海洋真菌(主要是丝状真菌)等，通过发酵，离心或过滤得到无细胞发酵上清液，以C.albicans为靶标菌，用本发明进行初筛。表3为其中一96孔板的对94个海洋微生物发酵上清液样品测定结果。将OD630＞1的样品视为具有抗C.albicans活性。由表3可以看出，在94个待测的海洋微生物样品中(除去一个生长对照孔和空白对照孔)，有22个样品的OD630＞1(表3中有下划线部分)，可作为进一步筛选的出发菌。
表394个海洋微生物发酵液样品的抗测定结果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 1.9201.5230.63 0.8771.3180.882 0.511.2491.2070.6471.3930.673B1.7090.729 0.597 0.537 0.6541.5881.1590.728 0.481 0.478 0.42 0.835C 0.584 0.7221.1450.594 0.9551.4090.842 0.4841.0520.623 0.636 0.844D 0.847 0.906 0.549 0.482 0.671 0.956 0.704 0.5671.1880.4491.3350.534E 0.4351.390.848 0.956 0.451 0.628 0.903 0.907 0.608 0.6131.0710.478F1.190.6841.2560.4541.5030.465 0.6071.4540.846 0.410.808 0.664G 0.7511.0380.995 0.877 0.534 0.472 0.573 0.736 0.939 0.619 0.921 0.806H 0.8071.4640.871 0.786 0.87 0.659 0.605 0.745 0.698 0.5341.0670.386注第一排第一孔(A1)为空白对照，最末一排最后一孔(H12)为生长对照孔。
实施例3海洋微生物抗C.albicans活性的定量分析按本发明所述的定量分析方法做标准曲线，如图1所示。在同样条件下对样品测定，如表3。表3中A2孔的OD630＝1.523，从图1可以得出它的活性相当于浓度为8μg/mL的标准抗生素(氟康唑)；又如表3中，E2孔的OD630＝1.39，同样地可以从图1得出它的活性相当于浓度为4μg/mL的标准抗生素(氟康唑)。从这两个例子说明只要借助于标准抗生素曲线图，本方法可以快速地通过样品的OD630进行定量分析。
注本实施例的样品来源与制备方法如实施例3的相同。
实施例4本发明用于其它酵母类真菌靶标菌分别以毕赤氏酵母Pichia pastoris，新型隐球酵母Cyptococcus neoformans，酿酒酵母Saccharomycescerevisae As2.346等三株酵母为靶标菌，以氟康唑为标准抗生素，对这三株酵母在不同抗生素浓度下的活性时应用本发明的方法检测，得到三条标准曲线(图2-4，其中图2靶菌液为毕赤氏酵母Pichia pastoris以氟康唑为标准抗生素的曲线；图3靶菌液为新型隐球酵母Cyptococcus neoformans以氟康唑为标准抗生素的曲线图4靶菌液为酿酒酵母Saccharomyces cerevisae As2.346，以氟康唑为标准抗生素的曲线)。除新型隐球酵母Cyptococcus neoformans相关性偏低以外，其它两株菌的相关性都很好，而新型隐球酵母Cyptococcus neoformans相关性偏低，与它的生长量有关，根据NCCCLS标准，该酵母的培养时间也比其它酵母长(National Committee for Clinical Laboratory Standards.Reference method for broth dilutionantifungal susceptibility testing of yeast.Tentative standard M27-T，PennsylvaniaNCCLS，1995.1～22.)，可以通过延长靶菌培养时间使相关性更好。
权利要求
1.一种抗酵母类真菌抗生素的快速检测方法，它包括将靶菌液稀释、抗生素稀释、种板、抗生素与靶菌液共同作用、酶联免疫检测仪测定空白板吸光值、加入美蓝染液、保温、酶联免疫检测仪测定吸光值、最后进行数据处理，其步骤是(1)将培养14-20h的白色念珠菌(Candida albicans)用YPD培养基稀释至1～5×105CFU/mL，在无菌的96孔板的第1列各孔中加入YPD培养基200μL为空白对照，从第2列到最后1列每孔中加入稀释好的靶菌液100μL，除最后1列再加入100μL YPD培养基做生长对照外，其余各孔都加入无菌待测样品100μL，每个样品做三个重复；将板于室温振荡培养20-24h，于酶联免疫检测仪检测各孔的OD630(记为A0)，在每孔中加入美蓝染液20μL，使其终浓度为0.05-0.1‰，室温下静置保温10-20min，于酶联免疫检测仪检测各孔的OD630(记为A)；(2)制备美蓝染液配制美蓝A液和B液，所述的A液是将5g美蓝溶于100mL95％的酒精中配制成美蓝酒精饱和溶液；所述的B液是配制成0.01％的KOH水溶液，将A液30mL和B液100mL混匀，过滤；(3)制备YPD培养基，其配制比例如下葡萄糖2％，胰蛋白胨2％，酵母粉1％，pH5.0～5.5，121℃高压蒸汽灭菌20min；(4)定性检测以吸光值A-A0作为最终OD630，该OD630值大于1小于2时定为有抗酵母类真菌的活性；(5)定量检测取无菌96孔板，于每一行第一列加入YPD 200μL作为空白对照，从第二列起直到最后一列加入稀释成105CFU/mL的Candida albicans靶菌液，每一行加入同一稀释度的靶菌液，再从第二列起直到倒数第二列加入标准抗生素如氟康唑100μL，每一列加入同一稀释度的标准抗生素氟康唑，使其终浓度依次为128μg/mL，64μg/mL，32μg/mL，16μg/mL，8μg/mL，4μg/mL，2μg/mL，1μg/mL，0.5μg/mL，0.25μg/mL，最后一列加入YPD培养基100μL，作为生长对照孔；做三个重复；用上述测定方法测定OD630(A-A0值)，以抗生素浓度为横坐标，OD630为纵坐标制作标准曲线；待测样品按同样条件操作，根据OD630从标准曲线上求得相应的浓度。
全文摘要
本发明公开了一种抗酵母类真菌抗生素的快速检测方法。应用美蓝—酶联免疫检测仪快速测定抗酵母类真菌抗生素。其原理是活的酵母，由于新陈代谢不停地进行，能将无毒的美蓝还原脱色成无色，但死酵母无此还原力。抗生素与酵母作用后，通过酶联免疫检测仪检测吸光度的变化，可反映抗生素的活性。具体步骤包括将抗生素稀释、种板、抗生素与靶菌液共同作用、酶联免疫检测仪测定空白板吸光值、加入美蓝染液、保温、酶联免疫检测仪测定吸光值，最后进行数据处理。本发明具有准确，快速，方便，经济等优点。可应用于抗酵母类真菌抗生素的研发过程中，特别是初筛阶段。同时可用于定量分析，便于进行抗生素合成和分离纯化过程中的活性检测以及产品质量标准的建立。
文档编号G01N33/569GK1553187SQ0312809
公开日2004年12月8日 申请日期2003年6月4日 优先权日2003年6月4日
发明者洪葵, 肖春, 洪 葵 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 中国热带农业科学院热带生物技术研究