专利名称：筛选醛糖还原酶抑制剂的方法
技术领域：
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种筛选醛糖还原酶抑制剂的方法。
背景技术：
醛糖还原酶主要存在于晶状体、血管、神经、红细胞以及肾脏等组织中，属于还原型辅酶II (NADPH)依赖的醛-酮还原酶超家族。它是体内多元醇代谢途径的限速酶，可以催化多种亲水性的醛还原为相应的醇。在体内，醛糖还原酶催化底物葡萄糖还原生成山梨醇。

在糖尿病病人体内的高血糖生理环境下，醛糖还原酶被激活引发多元醇通路，山梨醇的细胞膜通透性较差造成组织内山梨醇聚积，引发白内障、视网膜病变、肾脏病变等慢性并发症。目前，由日本Ono制药公司1992年上市的依帕司他(Epalrestat)作为醒糖还原酶抑制剂被批准使用于临床，用于治疗糖尿病性神经病变，但是它还没有获得美国食品药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)的批准。所以寻找醒糖还原酶抑制剂和研究醛糖还原酶抑制剂在临床中的应用对于开发新药有着非常重要的意义。现有醛糖还原酶抑制剂的筛选一般使用紫外光谱法，其是以DL-甘油醛为底物，利用辅酶NAD(P)H在340nm处有特征吸收这一特点，根据反应体系在340nm处吸光度的变化进行抑制剂的筛选(Chihiro Nishimura, Takashi Yamaoka, MasakazuMizutani, Kamejiro Yamashita, Tai Akera, Tsuyoshi Tanimoto. Purificationand characterization of the recombinant human aldose reductase expressed inbaculovirus system. Biochimica et Biophysica Acta, 1991， 1078， 171-178)。光谱法筛选酶抑制剂使用DL-甘油醛为底物，与人体葡萄糖环境有较大差异，且由于在溶液中NAD(P)H自然氧化引起吸光度的变化，使得光谱法灵敏度低，且在340nm处吸光度容易受外界干扰，引起假阳性和假阴性结果(Arjen R. de Boer, Henk Lingeman,Wilfried M. A. Niessen, Hubertus Irth. Mass spectrometry-based biochemicalassays for enzyme—inhibitor screening. Trends in Analytical Chemistry, 2007,26，867-883.)。现代质谱仪的高精确度和灵敏度为我们提供了不受干扰的分子指纹图谱，串联质谱高度特异性和精确性揭示待分析化合物的结构信息，且质谱方法可以同时检测和定量多种组分，近年来在药物筛选中得到了广泛的应用(Gejing Deng, GautamSanyal. Applications of mass spectrometry in early stages of target baseddrug discovery. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, 40,528-538)。但现有技术中还未有用质谱检测方法筛选醛糖还原酶抑制剂的方法。酶促反应缓冲液中往往含有不挥发的盐和为保持酶活性稳定的添加物，盐和添加物可能会污染质谱仪的离子源并导致离子化抑制，样品进入质谱前使用高效液相色谱进行分离可以避免反应体系中的盐和添加物对检测的影响(Arjen R. de Boer, ThomasLetzel, Danny A. van Elswijk, Henk Lingeman, Wilfried M. A. Niessen, HubertusIrth. On-Line Coupling of High-Performance Liquid Chromatography toa Continuous-Flow Enzyme Assay Based on Electrospray Ionization MassSpectrometry. Anal. Chem. 2004，76，3155-3161)。

发明内容
为了解决现有筛选醛糖还原酶抑制剂技术中，光谱法灵敏度低、容易受外界干扰的技术问题，本发明提供一种筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，应用本发明筛选醛糖还原酶抑制剂精确度高、特异性好。本发明提供的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，包括以下步骤(I)酶促反应缓冲液的配制 缓冲液为pH值为6. 0-6. 4的醋酸铵水溶液；
(2)标准品的配制将山梨醇分别配成浓度为0. I微摩尔/升、0. 2微摩尔/升、0. 5微摩尔/升、I微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的木糖醇作为内标；(3)空白样品和样品的酶促反应空白样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度0. 1-50微摩尔/升的待测物、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；空白样品和样品在25-37摄氏度反应15-40分钟，分别加入甲醇或乙腈终止反应，分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标木糖醇；(4)标准品、空白样品和样品的检测对(2)中标准品进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取山梨醇和木糖醇的色谱图，分别积分求峰面积，以标准品浓度为横坐标，以山梨醇与木糖醇峰面积比值为纵坐标，或以标准品浓度为纵坐标，以山梨醇与木糖醇的峰面积比值为横坐标，得到山梨醇浓度的线性方程；对空白样品、样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测；所述的超高效液相色谱的检测条件色谱柱WatersACQUITY UPLC BEH C18 2. I X 50 毫米，I. 7 微米；流动相甲醇和水；等度洗脱程序0-2分钟，20%甲醇，所指的百分比均为体积百分比；流速0. 2毫升/分钟；进样量3微升；所述的质谱检测条件毛细管电压3000伏特；去溶剂气氮气温度350摄氏度；
锥孔电压14伏特；去溶剂气氮气流速800升/小时；锥孔气氮气流速60升/小时；碰撞气IS气流速0. 15毫升/分钟；(5)待测物对醛糖还原酶的抑制率分别计算空白样品、样品中山梨醇峰面积和内标木糖醇峰面积的比值，根据(4)得到的线性方程，求得空白样品和样品中山梨醇的浓度，计算出待测物对醛糖还原酶的抑制率。优选的是，所述的缓冲液的pH值为6. 2。 优选的是，所述的缓冲液由醋酸铵和醋酸配制而成，缓冲液的浓度为100毫摩尔/升。优选的是，步骤(2)中，所述的标准品溶液是由缓冲液和甲醇配制而成的，或由缓冲液和乙腈配制而成的。优选的是，步骤(3)中，所述的样品中待测物的终浓度为10-50微摩尔/升。优选的是，步骤(3)中，所述的空白样品和样品在37摄氏度反应25分钟。优选的是，步骤(3)中，所述的甲醇或乙腈的体积为800-1000微升；更有优选的是，所述的甲醇或乙腈的体积为800微升。本发明的有益效果(I)葡萄糖在醛糖还原酶的作用下，产生山梨醇，醛糖还原酶抑制剂抑制醛糖还原酶的活性，从而导致酶促反应产物山梨醇生成量减少，通过产物山梨醇含量的变化可以计算待测物对醛糖还原酶的抑制率；(2)本发明筛选醛糖还原酶抑制剂，样品检测准确、快速，线性方程相关系数高达
0.999，避免了光谱法筛选醛糖还原酶抑制剂使用DL-甘油醛为底物，在溶液中由于NAD(P)H自然氧化引起吸光度的变化，导致灵敏度低，且筛选中容易出现的假阳性和假阴性结果的问题；(3)本发明可用于分析天然产物提取物、单体及合成类醛糖还原酶抑制剂对醛糖还原酶的体外抑制率，进而筛选出醛糖还原酶抑制剂；本发明还可用于醛糖还原酶的动力学研究(生物化学(第三版)上册，351-381，王镜岩，朱圣庚，徐长法，主编)。


图I为实施例I中10微摩尔/升的标准品山梨醇和内标木糖醇的的总离子流色谱图；图2为实施例I中内标木糖醇的提取色谱图；图3为实施例I中10微摩尔/升的标准品山梨醇的的提取色谱图；图4为实施例I中不同浓度山梨醇标准品的标准曲线；图5为实施例I中空白样品中内标木糖醇的提取色谱图；图6为实施例I中空白样品中山梨醇的提取色谱图；图7为实施例I中样品中内标木糖醇的提取色谱图；图8为实施例I中样品中山梨醇的提取色谱图9为实施例2中样品中内标木糖醇的提取色谱图；图10为实施例2中样品中山梨醇的提取色谱图；图11为实施例3中样品中内标木糖醇的提取色谱图；图12为实施例3中样品中山梨醇的提取色谱图；图13为实施例4中样品中内标木糖醇的提取色谱图；图14为实施例4中样品中山梨醇的提取色谱图。
具体实施例方式本发明提供的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，包括以下步骤 (I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液为醋酸铵溶液，用醋酸调节pH值为6. 0-6. 4，缓冲液浓度为100毫摩尔/升;(2)标准品的配制将山梨醇分别配成浓度为0. I微摩尔/升、0. 2微摩尔/升、0. 5微摩尔/升、I微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的木糖醇作为内标；(3)空白样品和样品的酶促反应空白样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；样品反应总体积200微升，含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度0. 1-50微摩尔/升的待测物、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；空白样品和样品在25-40摄氏度反应15-40分钟，分别加入800-1000微升的甲醇或乙腈终止反应，分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标木糖醇；空白样品和样品中的酶是同一种酶；(4)标准品、空白样品和样品的检测对(2)中的标准品进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取山梨醇和木糖醇的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以山梨醇与木糖醇峰面积比值为纵坐标，或以标准品浓度为纵坐标，以山梨醇与木糖醇的峰面积比值为横坐标，在所述的标准品浓度为0. I微摩尔/升至50微摩尔/升范围内，使用仪器的软件MassLynx4. I或微软公司(Microsoft)的Excel软件得到山梨醇浓度的线性方程y=ax+b式中，y为所述的标准品山梨醇与内标木糖醇峰面积比值；x为标准品山梨醇的浓度，量纲为微摩尔/升；a、b为计算得到的常数；同时计算得到相关系数R2 ；对空白样品、样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测；所述的超高效液相色谱的检测条件超高效液相色谱仪Waters ACQUITY ；色谱柱WatersACQUITY UPLC BEH C18 2. 1X50 毫米，I. 7 微米；
流动相甲醇和水；等度洗脱程序0-2分钟，20%甲醇，所指的百分比均为体积百分比；流速0. 2毫升/分钟；进样量3微升；所述的质谱检测条件质谱仪WatersXevo TQ ；离子源电喷雾电离源(ESI)正离子模式；毛细管电压3000伏特； 锥孔电压14伏特；去溶剂气氮气温度350摄氏度；去溶剂气氮气流速800升/小时；锥孔气氮气流速60升/小时；碰撞气IS气流速0. 15毫升/分钟；所述质谱条件在检测山梨醇和内标木糖醇时是相同的；碎裂能量和选择的碎片离子在检测山梨醇和内标木糖醇时是不同的检测山梨醇时碎裂能量是12，碎片离子是68. 94 ;检测内标木糖醇时碎裂能量是10，碎片离子是56. 95 ；(5)待测物对醛糖还原酶的抑制率分别计算空白样品、样品中山梨醇峰面积和内标木糖醇峰面积，得到空白样品、样品中山梨醇峰面积和内标木糖醇峰面积的比值，根据(4)得到的线性方程，求得空白样品和样品中山梨醇的浓度，待测物对醛糖还原酶的抑制率按照以下公式计算I 样品=(I-C样品 / C 空白)X 100%式中，I#s为待测物对醛糖还原酶的抑制率；C#s为根据线性方程求得的样品中山梨醇浓度，量纲为微摩尔/升；Cse为根据线性方程求得的空白样品中山梨醇浓度，量纲为微摩尔/升。优选的是，所述的缓冲液的pH值为6. 2。优选的是，步骤(2)中，所述的标准品溶液是由缓冲液和甲醇配制而成的，或由缓冲液和乙腈配制而成的。优选的是，步骤(3)中，所述的样品中待测物的终浓度为10-50微摩尔/升。优选的是，步骤(3)中，所述的空白样品和样品在37摄氏度反应25分钟。优选的是，步骤(3)中，所述的甲醇或乙腈的体积为800微升。根据步骤(5)计算出的待测物的抑制率，可以筛选醛糖还原酶抑制剂抑制率高，说明待测物对醛糖还原酶的抑制效果好，可以作为醛糖还原酶抑制剂；抑制率低，说明待测物对醛糖还原酶的抑制效果差，不适合作为醛糖还原酶抑制剂。本发明的醛糖还原酶可以是商购，也可以是实验室制备，其制备方法为4°C条件下进行，取新鲜牛晶状体，经匀浆、离心、盐析、超滤后得到酶的粗提取液，分装，储藏于-80 °C 冰箱中备用(Anjana Basak Haider, M. James C. Crabbe. Bovine lensaldehyde reductase (aldose reductase). Biochemical Journal, 1984, 219, 33-39)。本发明的其他材料均可以通过商购途径获得。
为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述。实施例I结 合图1-8说明实施例I筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，步骤如下(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液为醋酸铵溶液，用醋酸调pH值为6. 2，缓冲液浓度为100毫摩尔/升；(2)标准品的配制用缓冲液和甲醇将山梨醇分别配成浓度为0. I微摩尔/升、0. 2微摩尔/升、0. 5微摩尔/升、I微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的木糖醇作为内标；(3)空白样品和样品的酶促反应空白样品反应总体积200微升，含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；样品反应总体积200微升，含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10微摩尔/升的依帕司他、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；37摄氏度反应25分钟，分别加入800微升甲醇终止反应，分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标木糖醇；(4)标准品、空白样品和样品的检测对标准品检测米用木糖醇为内标，以内标法定量，对(2)中的标准品进行超闻效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取山梨醇m/z=68. 94和木糖醇m/z=56. 95的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以山梨醇与木糖醇峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为0. I微摩尔/升至50微摩尔/升范围内，使用微软公司(Microsoft)的Excel软件得到山梨醇浓度的线性方程y=0. 7221x+0. 1992式中，y为所述的标准品山梨醇与内标木糖醇峰面积比值；x为标准品山梨醇的浓度，量纲为微摩尔/升；计算得到相关系数R2=O. 9998 ；对空白样品、样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测；所述的超高效液相色谱的检测条件超高效液相色谱仪Waters ACQUITY ；色谱柱WatersACQUITY UPLC BEH C18 (2. 1X50 毫米，I. 7 微米);流动相甲醇(A)和水(B)；等度洗脱程序0-2分钟，20%A，所指的百分比均为体积百分比；流速0. 2毫升/分钟；进样量3微升；所述的质谱检测条件质谱仪WatersXevo TQ ；
离子源电喷雾电离源(ESI)正离子模式；毛细管电压3000伏特；去溶剂气氮气温度350摄氏度；锥孔电压14伏特；去溶剂气氮气流速800升/小时；
·
锥孔气氮气流速60升/小时；碰撞气IS气流速0. 15毫升/分钟；第一个四极杆的低端分辨率为2. 82 ;高端分辨率为15. 2 ;离子能量为0. 4 ；第二个四极杆的低端分辨率为2. 80 ;高端分辨率为14. 8 ;离子能量为0. 5 ；以上所述质谱条件在检测山梨醇和内标木糖醇时是相同的；碎裂能量和选择的碎片离子在检测山梨醇和内标木糖醇时是不同的检测山梨醇时碎裂能量是12，碎片离子是68. 94 ;检测内标木糖醇时碎裂能量是10，碎片离子是56. 95 ；(5)待测物对醛糖还原酶的抑制率分别计算空白样品、样品中山梨醇和内标木糖醇的峰面积比值，根据⑷得到的线性方程，求得空白样品和样品中山梨醇浓度，待测物对醛糖还原酶的抑制率按照以下公式计算I 样品=(1_C样品 / C空白)X 100%式中，I#s为待测物对醛糖还原酶的抑制率；(#@为根据线性方程求得的样品中山梨醇浓度，量纲为微摩尔/升；Cse为根据线性方程求得的空白样品中山梨醇浓度，量纲为微摩尔/升。图I为实施例I中10微摩尔/升的标准品山梨醇和I微摩尔/升的内标木糖醇的总离子流色谱图，信号强度为4. 54X IO4 ；图2为实施例I中I微摩尔/升的内标木糖醇的提取色谱图，信号强度为
2.68 X IO4 ；图3为实施例I中10微摩尔/升的标准品山梨醇的提取色谱图，信号强度为
I.97 X IO5 ；图4为实施例I中不同浓度山梨醇标准品的标准曲线，标准曲线为y=0. 7221x+0. 1992，R2=O. 9998 ；图5为实施例I中空白样品中I微摩尔/升的内标木糖醇的提取色谱图，信号强度为 2. 87 X IO4 ；图6为实施例I中空白样品中山梨醇的提取色谱图，信号强度为5. OOXlO4 ；图7为实施例I中样品中I微摩尔/升的内标木糖醇的提取色谱图，信号强度为
3.48 X IO4 ；图8为实施例I中样品中山梨醇的提取色谱图，信号强度为6. 32X 103。由图1-8经计算得到10微摩尔/升依帕司他对醛糖还原酶的抑制率为90%。实施例2结合图9、图10说明实施例2筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，步骤如下
(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液为醋酸铵溶液,用醋酸调pH值为6. 2，浓度为100毫摩尔/升；(2)标准品的配制用缓冲液和乙腈将标准品分别配成浓度为0. I微摩尔/升、0. 2微摩尔/升、0. 5微摩尔/升、I微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的木糖醇作为内标；(3)空白样品和样品的酶促反应空白样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；
样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10微摩尔/升的槲皮苷标准品、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；37摄氏度反应30分钟，分别加入800微升乙腈终止反应，分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标木糖醇；其余的同实施例I。图9为实施例2中样品中I微摩尔/升的内标木糖醇的提取色谱图，信号强度为3. 46 X IO4 ；图10为实施例2中样品中山梨醇的提取色谱图，信号强度为2. 79 X IO40按照实施例I的检测步骤检测并计算得到10微摩尔/升槲皮苷标准品对醛糖还原酶的抑制率为54%。实施例3结合图11、图12说明实施例3筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，步骤如下(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液为醋酸铵溶液,用醋酸调pH值为6. 2，浓度为100毫摩尔/升；(2)标准品的配制用缓冲液和乙腈将标准品分别配成浓度为0. I微摩尔/升、0. 2微摩尔/升、0. 5微摩尔/升、I微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的木糖醇作为内标；(3)空白样品和样品的酶促反应空白样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；样品反应总体积200微升，含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度40微摩尔/升的芦丁标准品、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；37摄氏度反应25分钟，分别加入800微升乙腈终止反应，分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标木糖醇；
其余的同实施例I。图11为实施 例3中样品中I微摩尔/升的内标木糖醇的提取色谱图，信号强度为3. 04 X IO4 ；图12为实施例3中样品山梨醇的提取色谱图，信号强度为2. 19X104。按照实施例I的检测步骤检测并计算得到40微摩尔/升芦丁标准品对醛糖还原酶的抑制率为59%。实施例4结合图13、图14说明实施例4筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，步骤如下(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液为醋酸铵溶液,用醋酸调pH值为6. 2，浓度为100毫摩尔/升；(2)标准品的配制用缓冲液和甲醇将标准品分别配成浓度为0. I微摩尔/升、0. 2微摩尔/升、0. 5微摩尔/升、I微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的木糖醇作为内标；(3)空白样品和样品的酶促反应空白样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度50微摩尔/升的金丝桃苷标准品、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；37摄氏度反应25分钟，分别加入800微升甲醇终止反应，分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标木糖醇；其余的同实施例I。图13为实施例4中样品中I微摩尔/升的内标木糖醇的提取色谱图，信号强度为
3.21 X IO4 ；图14为实施例4中样品中山梨醇的提取色谱图，信号强度为2. 73X 104。按照实施例I的检测步骤检测并计算得到50微摩尔/升的金丝桃苷标准品对醛糖还原酶的抑制率为51%。实施例5筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，步骤如下(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液为醋酸铵溶液,用醋酸调pH值为6. 0,浓度为100毫摩尔/升；(2)标准品的配制用缓冲液和和甲醇将标准品分别配成浓度为0. I微摩尔/升、0. 2微摩尔/升、0. 5微摩尔/升、I微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的木糖醇作为内标；(3)空白样品和样品的酶促反应
空白样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；样品如下反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10微摩尔/升的大豆苷元标准品、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；25摄氏度反应40分钟，分别加入1000微升乙腈终止反应，分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标木糖醇；其余的同实施例I。按照实施例I的检测步骤检测并计算得到10微摩尔/升的大豆苷元标准品对醛糖还原酶的抑制率为27%。 实施例6筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，步骤如下(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液为醋酸铵溶液，用醋酸调pH值为6. I,浓度为100毫摩尔/升；(2)标准品的配制用缓冲液和乙腈将标准品分别配成浓度为0. I微摩尔/升、0. 2微摩尔/升、0. 5微摩尔/升、I微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的木糖醇作为内标；(3)空白样品和样品的酶促反应空白样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度20微摩尔/升的黄芩素标准品、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；40摄氏度反应30分钟，分别加入850微升甲醇终止反应，分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标木糖醇；其余的同实施例I。按照实施例I的检测步骤检测并计算得到20微摩尔/升的黄芩素标准品对醛糖还原酶的抑制率为20%。实施例7筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，步骤如下(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液为醋酸铵溶液,用醋酸调pH值为6. 4,浓度为100毫摩尔/升；(2)标准品的配制用缓冲液和甲醇将标准品分别配成浓度为0. I微摩尔/升、0. 2微摩尔/升、0. 5微摩尔/升、I微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的木糖醇作为内标；
(3)空白样品和样品的酶促反应空白样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足； 样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度0. I微摩尔/升的葛根素、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；29摄氏度反应25分钟，分别加入1000微升甲醇终止反应，分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标木糖醇；(4)标准品、空白样品和样品的检测对(2)中的标准品进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取山梨醇和木糖醇的色谱图，分别积分求峰面积，以所述的标准品浓度为横坐标，以山梨醇与木糖醇峰面积比值为纵坐标，在所述的标准品浓度为0. I微摩尔/升至50微摩尔/升范围内，使用仪器的软件MassLynX4. I得到山梨醇浓度的线性方程y=0. 7221x+0. 1992式中，y为所述的标准品山梨醇与内标木糖醇峰面积比值；x为标准品山梨醇的浓度，量纲为微摩尔/升；计算得到相关系数R2=O. 9998 ；对空白样品、样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测；其余的同实施例I。按照实施例I的检测步骤检测并计算得到0. I微摩尔/升的葛根素对醛糖还原酶的抑制率为17%。实施例8筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，步骤如下(I)酶促反应缓冲液的配制缓冲液为醋酸铵溶液,用醋酸调pH值为6. 4,浓度为100毫摩尔/升；(2)标准品的配制用缓冲液和甲醇将标准品分别配成浓度为0. I微摩尔/升、0. 2微摩尔/升、0. 5微摩尔/升、I微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升的标准溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的木糖醇作为内标；(3)空白样品和样品的酶促反应空白样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；样品反应总体积200微升,含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基乙醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度50微摩尔/升的金丝桃苷标准品、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足；37摄氏度反应15分钟，分别加入900微升乙腈终止反应，分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标木糖醇；其余的同实施例I。
按照实施例I的检测步骤检测并计算得到50微摩尔/升的金丝桃苷标准品对醛糖还原酶 的抑制率为55%。
权利要求
1.筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)酶促反应缓冲液的配制 缓冲液是PH值为6. 0-6. 4的醋酸铵水溶液； (2)标准品的配制 将山梨醇分别配成浓度为0. I微摩尔/升、0. 2微摩尔/升、0. 5微摩尔/升、I微摩尔/升、2微摩尔/升、5微摩尔/升、10微摩尔/升、20微摩尔/升、50微摩尔/升的标准品溶液，且每个浓度的标准品溶液均含I微摩尔/升的木糖醇作为内标； (3)空白样品和样品的酶促反应 空白样品反应总体积200微升，含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基こ醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足； 样品反应总体积200微升，含有体积为30微升的醛糖还原酶、终浓度5毫摩尔/升的2-巯基こ醇、终浓度150微摩尔/升的NADPH、终浓度0. 1-50微摩尔/升的待测物、终浓度10毫摩尔/升的底物葡萄糖，其余以缓冲液补足； 空白样品和样品在25-40摄氏度反应15-40分钟，分别加入甲醇或こ腈终止反应，分别加入终浓度为I微摩尔/升的内标木糖醇； (4)标准品、空白样品和样品的检测 对(2)中的标准品进行超高效液相色谱和质谱检测，从总离子流图中提取山梨醇和木糖醇的色谱图，分别积分求峰面积，以标准品浓度为横坐标，以山梨醇与木糖醇峰面积比值为纵坐标，或以标准品浓度为纵坐标，以山梨醇与木糖醇的峰面积比值为横坐标，得到山梨醇浓度的线性方程； 对空白样品、样品溶液进行超高效液相色谱和质谱检测； 所述的超高效液相色谱的检测条件 色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18 2. 1X50 毫米，I. 7 微米； 流动相甲醇和水； 等度洗脱程序0_2分钟，20%甲醇，所指的百分比均为体积百分比； 流速0. 2晕升/分钟； 进样量3微升； 所述的质谱检测条件 毛细管电压3000伏特； 去溶剂气氮气温度350摄氏度； 锥孔电压14伏持； 去溶剂气氮气流速800升/小时； 锥孔气氮气流速60升/小吋； 碰撞气IS气流速0. 15毫升/分钟； (5)待测物对醛糖还原酶的抑制率 分别计算空白样品、样品中山梨醇峰面积和内标木糖醇峰面积的比值，根据(4)得到的线性方程，求得空白样品和样品中山梨醇的浓度，计算出待测物对醛糖还原酶的抑制率。
2.根据权利要求I所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，所述的缓冲液的pH值为6.2。
3.根据权利要求I所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，所述的缓冲液由醋酸铵和醋酸配制而成，缓冲液浓度为100毫摩尔/升。
4.根据权利要求I所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的标准品溶液是由缓冲液和甲醇配制而成的，或由缓冲液和こ腈配制而成的。
5.根据权利要求I所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的样品中待测物的终浓度为10-50微摩尔/升。
6.根据权利要求I所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的空白样品和样品在37摄氏度反应25分钟。
7.根据权利要求I所述的筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的甲醇或こ腈的体积为800-1000微升。
全文摘要
筛选醛糖还原酶抑制剂的方法，解决了现有技术中光谱法易受背景干扰，引起假阳性和假阴性结果的问题。本发明以葡萄糖为底物，醛糖还原酶在25-37摄氏度催化葡萄糖生成山梨醇，用超高效液相色谱和质谱联用对山梨醇进行定量，进一步计算出天然产物提取物、单体及合成类的醛糖还原酶抑制剂对醛糖还原酶的抑制率。本发明的筛选方法快速、准确，线性方程相关系数达到0.999，可用于醛糖还原酶抑制剂的筛选及醛糖还原酶的动力学研究。
文档编号G01N30/02GK102796802SQ20121028480
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月10日 优先权日2012年8月10日
发明者宋凤瑞, 侯广月, 刘舒, 皮子凤, 刘志强, 刘淑莹 申请人:中国科学院长春应用化学研究所