专利名称：病原微生物核酸无扩增检测与分型方法
病原微生物核酸无扩增检测与分型方法技术领域
本发明属于医药生物领域，尤其涉及一种病原微生物核酸无扩增直接检测与分型方法及试剂盒。
背景技术：
感染性疾病是严重危害人类健康的最重要疾病之一。据国家疾控中心(⑶C)统计2011年我国法定传染病发病632万例，死亡I. 5万人。其中病毒性肝炎、肺结核和梅毒的发病率位居前三位，占乙类传染病发病总数的85. 41%。且乙型肝炎、丙型肝炎等血源性传染病的发病率呈逐年上升趋势。上述数据表明，乙型病毒性肝炎仍占据我国感染性疾病发病率首位，其发病人数亦占我国肝炎发病总人数的70%以上。大量临床资料和研究表明，乙型病毒性肝炎患者的血清学转归和预后与所感染乙型肝炎病毒(HBV)的基因型及拷贝数密切相关。因此，建立快速、准确的HBV检测与分型方法对于乙型病毒性肝炎的早期诊断、疗效监测、预后判断和个体化治疗具有重要临床意义。
对于HBV感染的检测，目前的实验室方法主要分为直接检测和间接检测两大类。 其中间接检测以生物化学方法和免疫学为主。生物化学方法通过检测多项转氨酶(ALT， AST, γ-GGT等)的升高来间接判断病毒感染，其灵敏度较高，但易受其它原因导致的肝损伤影响，故特异性差。免疫法包括早期的ELISA和逐渐发展形成的免疫散射比浊、化学发光和时间分辨荧光检测等技术。其原理是通过同时检测多项HBV特征性抗原(HBsAg、HBcAg、 HBeAg)和患者机体产生的相应抗体(HBsAb、HBcAb)来进行综合判定。该方法简便易行，在临床上广为应用。但是免疫学方法无法检出处于“窗口期”的HBV感染，易导致假阴性。最重要的是，所有间接检测方法都无法对HBV进行基因型分型，因而无法指导个体化临床用药。
直接检测法则检测患者样本中的HBV的数量和基因亚型，具有早期、实时、动态监测HBV拷贝数变化的特点，在早期诊断、疗效判断、个体治疗等方面具有无可比拟的优势。 因病毒在体外极难培养，因此目前病毒直接检测技术均通过检测HBV核酸实现。然而，由于早期HBV感染患者体内的HBV拷贝数较低(通常104-106/ml)，不足以被核酸杂交等常规分子生物学方法直接检出。因此进行靶分子信号放大是实现HBV DNA高分辨检测与分型的前提。目前的信号放大策略主要包括两类DNA模板扩增技术(前放大)和检测信号放大技术 (后放大)。其中DNA模板扩增技术以PCR为基础，通过体外扩增核酸分子模板至IO9倍， 以实现信号放大。PCR技术相继衍生出一系列变温核酸扩增、检测技术，如巣式PCR，荧光定量PCR和多重PCR等。这些基于PCR的扩增技术用于HBV检测与分型尚存在以下不足(I) 对扩增条件要求极为严格，极易产生假阳性或者假阴性。(2)多基因型同步扩增时常导致高浓度模板对低浓度模板的竞争抑制，导致低浓度样本的假阴性结果。(3) PCR相关技术核心知识产权的壁垒导致了其相关试剂和设备价格昂贵，增加了医疗成本和患者负担。近年来， 相继发展出一系列等温扩增技术，如链置换扩增(SDA)，环介导等温扩增(LAMP)，滚环扩增 (RCA)等技术，部分降低了医疗成本和解决了上述低浓度模板扩增受抑制等不足。然而这些技术仍然无法解决同步进行HBV高分辨检测和基因分型的难题。
相对于DNA模板扩增技术而言，检测信号放大(后放大)技术仅对已检测到的低信号进行放大，可消除因不同浓度模板扩增导致的扩增性抑制。由于检测信号放大技术是与检测原理紧密联系的，因此每个检测技术平台都有自己最适合的信号放大技术。如基于石英晶体微天平(QCM)传感器的质量放大，基于表面等离子体(SPR)传感器的折射光角度放大，基于电化学传感器的酶学放大，基于荧光检测的纳米传感器的荧光增强等。在这些检测平台中，均需使用生物传感技术将低于检测限的微弱信号转化为可以识别的物理或者化学信号。以前使用最多的是酶化学传感器，其原理是通过酶的催化或者与底物的结合进行信号放大。近年来，纳米材料合成、表面修饰技术的飞速发展为信号放大技术的研发提供了广阔空间。发明人前期在纳米材料信号放大方面进行了大量研究，成功将纳米金颗粒用于 QCM传感器的信号放大，实现了血液中低浓度金黄色葡萄球菌的检测；同时也实现了 HCR反应的无酶荧光信号放大。然而，试验中我们发现，传统荧光染料极易被漂白，用于临床样本检测难度较大。
然而，HBV的A-H亚型间的序列同源性非常高，利用核酸杂交技术对其进行分型需要制备特异性极高的探针。因此目前存在的HBV分型技术则采用PCR首先将各亚型归类， 然后用多组DNA探针分别检测不同组别的基因型以提高检测特异性。相比DNA分子而言， 肽核酸(PNA)分子因其独特的碳链骨架结构，其与DNA单链结合的亲和常数较普通DNA-DNA 的结合常数高IO3倍，因此短链PNA探针(14-20bp)对于单碱基突变具有极强的识别能力， PNA探针的这种高特异识别能力为HBV病毒的基因分型提供了新的突破口。发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种病原微生物核酸无扩增检测和分型方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案
本发明涉及一种病原微生物核酸无扩增检测和分型方法，其特征在于包括如下步骤
(I)根据待测样品的核酸序列合成DNA和/或PNA探针1，2，3，所述的探针1，2，3 能够分别与待测样品杂交并且互不重叠；
(2)分别将探针1，2，3与磁性纳米颗粒和两种荧光量子点耦联，所述的荧光量子点的荧光可以相同，也可以不相同。
(3)合成生物素连接的桥连DNA合/或PNA序列1，2以及互补的序列1’，2’，将序列I’和2’与步骤(2)中的两种荧光量子点分别耦联；
(4)合成两种生物素修饰的荧光颜色不同的两种荧光量子点，这两种荧光量子点可以与步骤(2)中的荧光量子点相同，也可以不同；
(5)选择步骤(2)中的探针修饰的磁性纳米颗粒和其中一种探针修饰的荧光量子点，将其与待测样品以及相应的桥连序列进行杂交并进行磁性分离；然后通过重复加入 Sa (中文全称)_洗涤-加入步骤(4)中的其中一种生物素修饰的荧光量子点-洗涤的步骤进行层层组装，然后通过磁性分离得到待测样品的富集物，任选地，对富集物的样品进行荧光强度测定；
(6)选择另外一种探针修饰的荧光量子点，将其与步骤(5)获得的富集物以及相应的桥连序列进行杂交并进行磁性分离；然后通过重复加入Sa (中文全称)-洗涤-加入步骤(4)中的另外一种生物素修饰的荧光量子点-洗涤的步骤进行层层组装，然后通过磁性分离得到待测样品的第二富集物，任选地，对第二富集物的样品运用荧光光谱成像技术或者流式细胞仪技术进行检测。
本发明另一方面还涉及种病原微生物核酸无扩增检测和分型的试剂盒，其特征在于包括三种DNA和/或PNA探针耦联的磁性纳米颗粒和两种荧光量子点，所述的三种探针能够分别与待测样品杂交并且互不重叠，荧光量子点的荧光可以相同，也可以不相同；生物素修饰的桥连DNA和/或PNA，桥连DNA和/或PNA的互补序列耦联的两种荧光量子点；生物素修饰的荧光颜色不同的两种荧光量子点，这两种荧光量子点可以与上述荧光量子点的荧光相同，也可以不同；SA以及缓冲溶液。
在本发明的一个优选实施方式中,其特征在于待测样品为HBV核酸。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的探针为PNA，所述的荧光量子点中的一个或多个或全部为CdSe/ZnS量子点。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的磁性纳米颗粒是SiO2SlFe3O4纳米颗粒。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的三种探针为PNA，其中两个种属特异性探针序列为下表探针I或者探针2的序列，所述的生物素修饰的桥连DNA序列如下表所示。
权利要求
1.ー种病原微生物核酸无扩增检测和分型方法，其特征在于包括如下步骤 (1)根据待测样品的核酸序列合成DNA和/或PNA探针1，2，3，所述的探针1，2，3能够分别与待测样品杂交并且互不重叠； (2)分别将探针1，2，3与磁性纳米颗粒和两种荧光量子点耦联，所述的荧光量子点的荧光可以相同，也可以不相同。
(3)合成生物素连接的桥连DNA合/或PNA序列1，2以及互补的序列I’，2’，将序列I’和2’与步骤(2)中的两种荧光量子点分别耦联； (4)合成两种生物素修饰的荧光颜色不同的两种荧光量子点，这两种荧光量子点可以与步骤(2)中的荧光量子点相同，也可以不同； (5)选择步骤(2)中的探针修饰的磁性纳米颗粒和其中ー种探针修饰的荧光量子点，将其与待测样品以及相应的桥连序列进行杂交并进行磁性分离；然后通过重复加入Sa(链霉亲和素)-洗涤-加入步骤(4)中的其中ー种生物素修饰的荧光量子点-洗涤的步骤进行层层组装，然后通过磁性分离得到待测样品的富集物，任选地，对富集物的样品进行荧光強度測定； (6)选择另外ー种探针修饰的荧光量子点，将其与步骤(5)获得的富集物以及相应的桥连序列进行杂交并进行磁性分离；然后通过重复加入Sa-洗涤-加入步骤(4)中的另外ー种生物素修饰的荧光量子点-洗涤的步骤进行层层组装，然后通过磁性分离得到待测样品的第二富集物，任选地，对第二富集物的样品运用荧光光谱成像技术或者流式细胞仪技术进行检测。
2.ー种病原微生物核酸无扩增检测和分型的试剂盒，其特征在于包括三种DNA和/或PNA探针耦联的磁性纳米颗粒和两种荧光量子点，所述的三种探针能够分别与待测样品杂交并且互不重叠，荧光量子点的荧光可以相同，也可以不相同；生物素修饰的桥连DNA和/或PNA，桥连DNA和/或PNA的互补序列耦联的两种荧光量子点；生物素修饰的荧光颜色不同的两种荧光量子点，这两种荧光量子点可以与上述荧光量子点的荧光相同，也可以不同；SA以及缓冲溶液。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于待测样品为HBV核酸。
4.根据权利要求I所述的方法或权利要求2所述的试剂盒，所述的探针为PM，所述的荧光量子点中的ー个或多个或全部为CdSe/ZnS量子点，优选的，两种不同的荧光量子点的发射波长相差至少30nm,优选至少50nm,进ー步优选至少80nm。
5.根据权利要求I所述的方法或权利要求2所述的试剂盒，所述的磁性纳米颗粒是S i O2SF e 3Ο4纳米颗粒。
6.根据权利要求I所述的方法或权利要求2所述的试剂盒，所述的三种探针为PNA，其中两个种属特异性探针序列为PNA种属特异性探针I和/或PNA种属特异性探针2的序列
7.根据权利要求6所述的方法或试剂盒，期特征在于另ー个用于分型的序列选自以下ニ条探针之一
8.根据权利要求7所述的方法或试剂盒，所述的桥连DNA的序列为5'-biotin (生物素)-GGGCAGCTGGGGCGGGCGGG-NH2-3'。
9.根据权利要求1，3-8任意一项所述的方法，所述的方法是非诊断目的的。
全文摘要
本发明公开了一种病原微生物核酸无扩增检测和分型方法以及相关的试剂盒，本发明以多探针并结合荧光量子点层层组装技术，实现病原微生物核酸无扩增检测和分型。本发明的方法对于低浓度核酸无需扩增，可以直接检测；多探针保证了信号放大过程中容易出现的假阳性问题，提高了检测准确性，该技术可以实现病原微生物拷贝数的实时检测与同步基因分型，速度快，成本低廉。
文档编号G01N21/64GK102978295SQ20121032660
公开日2013年3月20日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者罗阳, 张波, 蒋天伦, 府伟灵, 刘炜 申请人:重庆西南医院