专利名称：确定缺氧的方法
技术领域：
本发明涉及确定缺氧的方法。本发明的一个方面涉及在生产过程中确定胎儿头皮 血中缺氧，以指示胎儿器官功能障碍的方法。本发明另一方面涉及确定缺血的装置。
背景技术：
急性围产期窒息，即生产过程中或接近生产时缺氧(胎儿血氧饱和度不足)，是新 生儿中缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)形式的神经系统损伤的 重要原因。1000个足月新生儿中有2-9例，严重的病例中随后可能发生脑性瘫痪(CP)和 死亡。就全球来说，每年有大约4百万新生儿死亡，其中约23%是由急性围产期窒息造成 的。由于资源匮乏，不发达国家情况更差，但由这样巨大的数量可以知道，在西方国家这也 是严重的问题。瑞典可以看作是西方国家的一个代表，这里的缺氧发生约为7/1000足月新 生儿，导致2/1000儿童先天HIE。为了防止新生儿周产期窒息造成的永久性损伤，很重要的 一点是尽早检测到胎儿发生缺氧。快速检测使得能够在还未发生永久性损伤的阶段决定是 否需要干预。干预基本包括通过器械协助性生产，特别是剖宫产将婴儿尽快取出。目前检测急性围产期窒息是通过监测胎儿心率进行，如果观察到不良的心率模 式，再测量经阴道取样的胎儿头皮血的PH或乳酸。pH和乳酸表明供氧不足情况下转为无氧代谢而造成的代谢性酸中毒。在缺少氧 气的胎儿中，丙酮酸被代谢为乳酸和能量。目前，PH测量值是公认标准。但是快速确定pH 需要大约35 μ 1头皮血，并不容易获得。某些研究表明，第一次测量失败非常常见(20%)。 测量乳酸更容易，因为只需要5 μ 1血液并且分析可以在床边进行。乳酸分析1分钟内即可 完成，因此足够快。乳酸和pH也是急性窒息的指标。因此乳酸和PH可以提供指示，表明完全健康的 胎儿在生产过程中突然发生急性缺氧缺血。发生缺氧缺血性脑病的全部婴儿中很大部分在 进入生产期之前就曾发生过缺氧缺血。他们对生产过程中的缺氧缺血更易感，与健康胎儿 的反应方式不同，因此目前使用的方法对这一患者群体不够。WO 2005/034762Α1中公开了监测分娩的方法，包括测量液体(比如阴道液)中的 乳酸。最近瑞典的一项对产时胎儿血中PH和乳酸随机化研究的初期结果表明，乳酸是和pH 一样好的酸中毒指标。乳酸和PH都不是中度/严重HIE的理想预示者灵敏度对乳酸仅有 67 %，对pH是50 % ；而特异性大体相同，乳酸的是76 %，pH是73%。乳酸和pH预测新生儿 酸中毒的灵敏度和特异性都低于70%。近来的瑞典报道结论是在胎儿监测中即使组合使用 胎心宫缩监护(CTG)和STAN(胎心宫缩监护ST区段的分析)，仍有检测不到某些可能导致 脑损伤的围产期窒息的风险(SBU Alert-rapport nr2006_04)。
已知在缺氧新生儿中升高的酶有又称为肝酶的LDH(乳酸脱氢酶)、ALT (丙氨酸转 氨酶)和AST (天门冬氨酸转氨酶)。LDH在身体的多数细胞中都存在，被认为是非特异性 的酶。因此，不常用于临床工作。以前，LDH被用作心肌损伤的标记物，但现在已被特异性 更高的测试代替。AST以及特别是ALT是肝损伤特异性更高的。在关于分娩对一组低风险 中国妇女的新生儿中血浆肝酶的影响的研究中，确定了 LDH(乳酸脱氢酶)、ALT(丙氨酸转 氨酶)、AST (天冬氨酸转氨酶)、GGT ( γ -谷氨酰转氨酶)，并建立了其与母体和新生儿特点 的相互关系(Mongrelli M et al.，J Obstet Gynaecol Res, 26(1) :61_63，2000)。如果胎儿在出生过程中或者接近出生时发生缺氧，其体内的血流将从“不太重要 的器官”(肾、肝、脂肪和肠)重新分配向脑、心和肾上腺。这往往会损害非特权级器官的细 胞。细胞损伤导致酶泄漏，进入循环系统。如果缺氧严重，细胞会死亡，血液中的酶浓度增 加更多。LDH、AST和ALT(在12-36小时)下降速度使得可能检测到由于分娩前开始的先 前缺氧导致分娩过程中对缺氧缺血更易感的病例。缺氧还影响胎儿体内的电解质平衡。一 个实例是缺氧时钙由血液涌入细胞。已知新生儿动物模型在缺氧时，血清离子钙的浓度升 高。钙也能预示人类婴儿中的后果(是否发生脑损伤)。新生哺乳动物在缺氧时发生改变 的其他酶和电解质有钾(K+)、镁(Mg2+)、钠(Na+)、葡萄糖、肌酸激酶(CK)和GGT。全球范围内每年有4百万新生儿死亡，其中的大约23%是由急性围产期窒息造成 的。导致脑神经元损伤的缺氧缺血其病理机制分为两个阶段，其中初级阶段在分娩后立刻 发生。如果婴儿被成功复苏，该初级阶段之后是持续几小时的无症状期。七分之二的窒息婴 儿在该无症状期后会发生次级能量损耗导致婴儿脑中迟发性细胞死亡和包含痉挛的临床 图像(又称为HIE)。无症状期提供了一个机会来通过低温处理(将婴儿脑降温至34. 5°C ) 使迟发性细胞死亡降至最低。但是目前没有可靠的手段预测婴儿是否会发生HIE，因此无法 利用低温处理的好处。除了分娩过程中或接近分娩，缺氧在许多其他医学情况中也是严重的问题。例如， 结肠直肠癌在两性中都是最常见的肿瘤之一，其发生率逐年增加。目前的治疗方法包括将 肿瘤与肠相当一部分一起切除的手术过程。这些病例中很大一部分，之后要将肠的远端和 近端接在一起。这被称为吻合术。该过程中，当动脉血管被切开时，对肿瘤所位于的肠部分 的动脉血供应被打断。全部手术中7-10%预期会发生由吻合口漏造成的术后并发症。这种 情况中，肠内容物会泄漏到腹部，引起炎症、腹膜炎、脓毒症甚至可能死亡。这类并发症的主 要原因是摘除血管而造成的进行吻合术的区域供血不足(例如缺氧缺血)。目前的解决方 案仅是重新手术。目前还不可能在手术期间就预测到吻合口是否会发生泄漏。缺氧是重要问题的其他领域包括血管手术和肝移植手术。例如，决定患者肝脏移 植后致残率和死亡率的重要因素是肝移植物的保存损伤(Leemaster 1997)。LDH、AST和 ALT泄漏到灌注液标志着肝细胞膜完整性丧失(Kebis 2007)。先前用于确定缺氧的装置和方法的一个主要缺点是LDH仅能在血浆或血清中进 行分析。另外，这一测量需要最少150微升全血。很难由小动物、特定组织或分娩时未出生 的婴儿中获取如此体积的血液。另一个问题是LDH也存在于红细胞，溶血(红细胞破裂) 会造成假的(超过检测极限的)高值。因此，需要快速，仅需要少量血分析单独LDH，或者LDH和电解质以及肝酶来检测 缺氧缺血的方法。此外，生产时胎儿供血状态的确定需要提高。
发明概述通过提供装置和方法，几分钟内(或者替代的几秒内)能在10微升全血中分析 LDH、以及任选的AST、ALT、Mg和乳酸，本发明满足以上需要中的至少某些。这些分析可以与 游离血红蛋白一起测量来保证没有发生溶血使得LDH值假性提高。本发明的实施方案包括确定缺氧，特别是生产过程中取样的胎儿头皮血中缺氧的 方法。这些实施方案中，方法可以包括确定血浆中的LDH(乳酸脱氢酶)。优选除了 LDH，还 确定所述胎儿头皮血中选自K、Mg、Ca、AST、ALT和乳酸的一种或几种标记物。特别优选的 是LDH与K、Mg、Ca、AST、ALT、乳酸之一的组合。同样优选的是LDH、乳酸、Mg和AST和/或 ALT的组合。应当理解文中使用的“LDH”和“乳酸脱氢酶”是指总的乳酸脱氢酶，而非其同工酶。在发明方法中，有限量(优选大约5-25yL)的头皮血是分娩时在邻近患者的环境 中经由阴道从胎儿采样的。样品进行血浆(血清)与血细胞(特别是红细胞)的分离，分 析血浆的LDH，以及任选的K、Mg、Ca、AST、ALT、乳酸中的一种或多种，在几分钟内得出结果。 这样医疗队伍可以直接得出结论儿童是否遭受急性窒息，即表明是否需要剖宫产。本发明 可能免除与缺氧有关的大量痛苦，并且可能挽救大量生命。在发明人进行的研究中，第一个M小时内分析了儿童血样中的LDH、AST和ALT。 发现193个接受测试的儿童中，19个儿童表现出窒息迹象，在5分钟大时Apgar得分< 7。 借助ROC曲线(参见

图1)，可以观察到临界值1000U/L的LDH灵敏度和特异性达到96%。 对于HIE，相同临界值的灵敏度为100%，特异性为96%。换句话说，这意味着发明所述方 法的主要标记物准确地确定所有缺氧儿童中的95% (或更多)，同时将所有健康儿童中的 95 %确定为健康。AST和ALT分别在临界值55U/L和18U/L给出灵敏度86 %和特异性90 %。 尽管这只是初步研究，它表明与现有方法相比有令人惊讶的提高。从成本角度考虑该结果是惊人的。已知使用目前的方法，大约要10例不必要的剖 宫产才会发现一个HIE儿童，即为了发现一个HIE儿童，共需进行11例剖宫产，其中10例 是不必要的。本发明的灵敏度和特异性表明结果会是相反的，即10例剖宫产中仅有1例是 不必要的。相应的，社会将节省上百万，不仅是使更多儿童能够以自然方式出生。以下表格 显示本发明的方法与已知方法相比带来的显著提高。
权利要求
1.评价哺乳动物组织部位缺氧的方法，所述方法包括a.由组织部位采集血样，所述血样包含血浆和血细胞；b.将血浆与血细胞分开；c.确定血浆中的LDH的量；和d.由血浆中的LDH的量评价该组织部位是否存在缺氧。
2.权利要求1的方法，另外包括确定血浆中选自基本由K、Mg、Ca、AST、ALT和乳酸构成 的其他预后标记物中至少一种的量。
3.权利要求1的方法，其中血样的体积包含从5μ L到150 μ L0
4.权利要求1的方法，其中血样的体积包含从5μ L到25 μ L0
5.权利要求1的方法，其中血样的体积包含从大约5到15μ L。
6.权利要求1的方法，其中通过利用半透膜，使血浆通过膜，血细胞保留在膜上，而将 血浆与血细胞分开。
7.权利要求1的方法，其中血样采集自哺乳动物的肠。
8.权利要求7的方法，其中血样在医疗程序前采集，且另外包括a.在医疗程序后采集第二血样，所述血样包含血浆和血细胞；b.将第二血样的血浆与血细胞分开；和c.确定第二血样的血浆中的LDH总量。
9.权利要求8的方法，另外包括确定两种血样的血浆中选自基本由K、Mg、Ca、AST、ALT 和乳酸构成的其他预后标记物中至少一种的量。
10.权利要求9的方法，另外包括比较血样中预后标记物的量。
11.权利要求8的方法，其中所述医疗程序包括胃肠道的吻合术。
12.权利要求1的方法，其中所述血样在手术过程中采集自一或多种特异器官、脑脊 液、尿或腹腔液。
13.权利要求12的方法，其中所述器官包含哺乳动物的主动脉。
14.权利要求12的方法，还包括确定血浆中选自基本由K、Mg、Ca、AST、ALT和乳酸构成 的其他预后标记物中的至少一种的量。
15.权利要求14的方法，其中所述至少一种预后标记物包括乳酸。
16.权利要求1的方法，其中血样从器官采集，该器官将要移植给需要所述器官的哺乳 动物。
17.权利要求17的方法，其中血样是在移植手术前采集的。
18.权利要求17的方法，其中所述器官包括肝。
19.权利要求17的方法，还包括确定血浆中选自基本由K、Mg、Ca、AST、ALT和乳酸构成 的其他预后标记物中的至少一种的量。
20.权利要求2的方法，还包括确定血浆中选自基本由K、Mg、Ca、AST、ALT和乳酸构成 的其他预后标记物中的至少一种的量。
21.权利要求20的方法，其中确定预后标记物使个体能够对哺乳动物的肝脏健康状况 进行评价。
22.权利要求1的方法，其中确定缺氧使得能够预测产前窒息后的脑损伤。
23.权利要求22的方法，还包括确定血浆中选自基本由AST、ALT和乳酸构成的其他预后标记物中的至少一种的量。
24.权利要求22的方法，还包括确定血浆中ALT的量。
25.权利要求22的方法，还包括给有需要的哺乳动物提供低温治疗，其中确定血浆中 的LDH表明哺乳动物脑中延迟的细胞死亡。
26.权利要求1的方法，其中确定血浆中的LDH总量使得能够对医药或手术治疗之前、 过程中和之后，哺乳动物肢体的血液循环进行评价。
27.确定胎儿头皮血急性缺氧的方法，所述方法包括在生产过程中采集血样、处理血样 以寻找至少一种确定缺氧的指标，该方法特征在于包括确定由样品获得的血浆中的总乳酸 脱氢酶(LDH)。
28.权利要求27的方法，其中所述样品是5μ L到60 μ L。
29.权利要求27的方法，其中所述样品是5μ L到25 μ L。
30.权利要求27的方法，其中所述样品是大约5到15μ L。
31.权利要求27的方法，其包括利用半透膜和/或滤器将血浆与血细胞分开。
32.权利要求31的方法，其中所述膜的面积为5mm2到1000mm2，优选低于100mm2。
33.权利要求31的方法，其包括将样品加到膜的一面，给膜的另一面施加负压，并将血 浆收集到朝向所述另一面的小室内。
34.权利要求33的方法，其包括将血浆从小室转移到确定LDH的设备和/或装置的步骤。
35.权利要求33的方法，其包括确定放置在小室内的血浆中的LDH的步骤。
36.权利要求31的方法，其中所述的膜被放置在有孔基质上或者与有孔基质结合，血 浆被毛细管力吸引进入所述基质。
37.权利要求36的方法，其中在一定时间后从基质上取下所述膜来确定基质中的LDH。
38.权利要求27的方法，其包括将样品中的血浆与血细胞分离以及将上清血浆转移到 设备中确定LDH的步骤。
39.权利要求27的方法，还包括比较如上确定的LDH和从胎儿头皮血获得的血浆中确 定的LDH，后者血浆是从分娩过程中非缺氧状态的胎儿采集的。
40.权利要求39的方法，其中LDH水平有统计意义上的显著升高表明缺氧。
41.权利要求39的方法，其中LDH水平在统计意义上升高3倍或更多倍表明有缺氧缺 血性脑病的风险。
42.权利要求27的方法，还包括确定所述头皮血和/或所述血浆中K、Mg、Ca、AST、ALT 和乳酸中的一或多种。
43.权利要求42的方法，其中K、Mg、Ca、AST、ALT和乳酸水平有统计意义上的显著升 高，结合LDH水平有统计意义上的显著升高，表明缺氧。
44.权利要求27的方法，其特征在于样品被采集到一次性装置上，所述装置包括用于 分离血浆的部件和用于进行LDH检测的小室。
45.仪器在权利要求27的方法中分离血浆和血细胞的用途，所述仪器包含壳体、壳体 中的小室、壳体中被半透膜覆盖的第一开口、壳体中经由管道将小室与负压部件或毛细管 力部件相通的第二开口，以及在负压的情况下，用于控制所述相通的阀门部件。
46.权利要求45的用途，其中阀门部件安排在管道上，其中优选小室还包含与其底部相通的第二管道，并带有用于控制清空积累在小室底部的血浆的第二阀门部件。
47.权利要求45的用途，其中小室中有确定积聚在该壳体内的血浆中的LDH的部件或 者与这种部件相通。
48.执行权利要求27所述方法的测试系统，所述测试系统包含一次性装置有血样收集 部分、血浆分离装置和能够间接或直接确定血浆中总的乳酸脱氢酶(LDH)的室。
49.权利要求48的测试系统，其特征在于所述一次性装置有平滑的壳体，其中所述接 收部分形成小室、并形成毛细采样器的界面。
50.权利要求49的测试系统，其特征在于卡上排列有许多检测室，其中优选这些小室 中的每一个与含有试剂的上游小室相通。
51.权利要求48的测试系统，其特征在于所述界面和所述血浆分离装置之间带有样品 分配器。
52.权利要求49的测试系统，其特征在于所述小室是光学检测池的形式，形成的壳体 适合放入配有至少一个用于分光光度法的装置的仪器中。
53.权利要求48的测试系统，其特征在于所述壳体被编排了独特的代码，优选所述仪 器带有阅读器。
54.权利要求48的测试系统，其特征在于所述一次性装置包括放置了目测用的干化学 部件的小室。
全文摘要
确定生产过程中取样的胎儿头皮血缺氧的方法，所述方法包括确定由所述样品获得的血浆中的总的乳酸脱氢酶(LDH)。方法可以包括另外确定血浆和/或血液中的K、Mg、Ca、AST、ALT、乳酸。LDH、Mg、Ca、AST、ALT、乳酸的数值有一或多个发生增加指示了胎儿缺氧。发明还公开了血浆分离装置在所述方法中的用途。
文档编号G01N33/573GK102131938SQ200980112713
公开日2011年7月20日 申请日期2009年4月23日 优先权日2008年4月11日
发明者索菲亚·西奥特阿夫奥纳斯, 马赛厄斯·卡尔森 申请人:卡尔马克瑞典股份公司