专利名称：一种亚洲ⅰ型口蹄疫146s抗原定量elisa检测方法及其试剂盒和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法及其试剂盒和应用。
背景技术：
口蹄疫(foot and mouth disease, FMD)是猪、牛、羊等主要家畜和其它偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的传染病，我国也将其列为一类动物传染病之首。口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，有七个血清型:0型、A型、亚洲I型、C型以及南非1、2、3型。各血清型之间没有交叉保护。现阶段我国主要流行O型、A型和亚洲I型。疫苗接种是预防、控制口蹄疫的有效手段之一。在我国，口蹄疫灭活疫苗使用最为广泛；为确保它安全有效，对其质量进行严格的控制极为必要。目前，国际上通用的疫苗效力检测方法是本动物攻毒保护试验，或采用TO5tl测定法(欧洲):即用疫苗50%动物保护剂量(PD50)来评价疫苗免疫效果，常规疫苗需至少达到3个TO5tl，紧急接种疫苗需至少达到6个PD50 ;或采用(PGP)测定法(南美):即用疫苗保护百分率(PGP)来评价疫苗免疫效果，PGP达到75%以上，该疫苗合格，PGP为62.5% 68.8%，需要进行重复检验，PGP小于62%，该疫苗不合格。本动物攻毒保护试验的动物必须是来自无口蹄疫地区、无口蹄疫病毒中和抗体的非疫苗免疫本动物。由于我国采取强制免疫手段控制口蹄疫的流行和暴发，所以筛选试验动物相当困难；另外，这种方法的成本高、周期长、重复性较差，且需要高安全动物舍，不易操作。为此，研究者开展了多种检验方法的研究，尝试替代本动物攻毒保护试验。这些研究主要分为三类:血清学替代法、试验动物替代法和疫苗抗原定量法。口蹄疫血清学效力检测替代方法是通过检测疫苗免疫后的抗体滴度水平来评价疫苗免疫效力，主要包括病毒中和试验和液相阻断ELISA试验。1968年，Stellman等提出了用中和抗体滴度分析疫苗效力的统计学方法；到1976年，Pay等根据中和抗体滴度和疫苗效力的关系建立了疫苗的抗原剂量、中和抗体滴度和保护率的相关公式。马军武等通过液相阻断ELISA检测疫苗免疫抗体与攻毒保护分析确定了牛、羊、猪等口蹄疫免疫抗体与攻毒保护的关系。疫苗免疫血清抗体效价检测须用非口蹄疫疫苗免疫动物，无法从根本上取代本动物的使用，动物的选择仍存在困难。试验动物替代法是用试验动物(如小鼠、豚鼠等)代替本动物，进行疫苗效力检验。研究发现，用豚鼠进行牛口蹄疫灭活疫苗的效力试验，与本动物效力检验的TO5tl之间有较好的相关性(Eissner等1976; Terpstra等1976),也可用小鼠或BALB/c小鼠替代牛间接评价了 口蹄疫灭活疫苗的效力(Sutmoller等1980 ；DusSantos等2000)。替代性试验动物适合规模养殖，均一'I"生容易控制，试验动物与本动物攻毒后的F1D5tl呈一定的正相关关系，但替代性试验动物的与本动物的免疫反应有一定差别，而且替代性试验动物人工感染病毒时使用的是试验株，与天然感染在株系和感染途经上存在区别。口蹄疫病毒在蔗糖密度梯度离心时，根据沉降系数不同，可以分为完整病毒粒子(146S或140S)、空衣壳(76S)、病毒感染相关肽(45S)、12 S蛋白亚单位(12S)。研究发现，完整病毒粒子(146S或140S)是口蹄疫灭活疫苗中诱导动物机体产生保护性免疫应答的主要成分，因此疫苗中完整病毒粒子含量与疫苗的免疫保护效力具有明显相关性。FMD疫苗抗原定量的各种方法也是据此研发的，主要包括蔗糖密度梯度离心法、单抗夹心ELISA法和尺寸排阻层析法。1971年，Fayet等建立了用紫外光定量检测蔗糖梯度中口蹄疫完整病毒粒子(146S或140S)的方法；随后，Barteling and Meloen (1974)和Doel等对其进一步完善，并于1982年向OIE正式推荐。在此后的三十多年中，该方法一直作为口蹄疫疫苗抗原定量的经典方法被世界各国的口蹄疫疫苗研究者和供应商广泛使用。但这种方法也有其缺点:操作复杂、仪器昂贵、重复性较差、不适合大量样品检测，还不能区分血清型。与之相比，Van Maanen等(1990年)和Crowther等(1995)建立的单抗夹心ELISA方法更具优势:操作简单、省时省力、稳定性好、适合于批量检测，且能区分血清型(在检测双价苗和多价苗尤为重要)。他们以针对VPl线性表位的中和性单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体，建立了能检测146S抗原的双抗夹心ELISA，且不受12 S蛋白亚单位存在的影响。但这样的单克隆抗体不容易分离到，限制了其广泛应用。尺寸排阻色谱法，又称为凝胶过滤色谱，或分子筛色谱法，是一种液相色谱分离技术。主要用于大分子物质如蛋白质的分离。这一技术也被用于FMD病毒粒子的分离、定量(Spitteler等，2011 )，先将口蹄疫抗原用分子筛分离，再用紫外光测定(254nm)，计算口蹄疫完整病毒粒子(140S)的含量。据报道，这种方法的检测结果与蔗糖密度梯度离心法的符合性很好，操作也较后者简单；但它同后者一样，不能区分血清型。口蹄疫灭活疫苗本动物效力检验替代方法的探索是国内外面临和亟待解决的一个问题，有效的替代方法应该具有很好的特异性、敏感性和重复性，而且要易于标准化。

发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种既保持了蔗糖密度梯度离心法的优势，又具有ELISA方法的特长的亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为:一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，包括以下步骤:
1)储备亚洲I型口蹄疫标准对照抗原；
2)纯化定量亚洲I型口蹄疫标准对照抗原146S；
3)建立亚洲I型口蹄疫间接夹心ELISA方法；
4)绘制标准对照抗原标准曲线；
5)计算被检样品146S抗原含量； 6)检测敏感性和特异性。进一步的，上述的一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，所述步骤
1)中，是对亚洲I型口蹄疫标准对照抗原，一部分按5mL /瓶，置-70°c储备(仅解冻一次，用于ELISA试验)；另一部分按3X100 mL，置_70°C储备(仅解冻一次，用于146S抗原纯化定量(分三次))。进一步的，上述的一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，所述步骤
2)中，是利用蔗糖密度梯度法(45%、35%、25%、15%)，对亚洲I型口蹄疫标准对照抗原进行纯化，测定146S抗原含量为1.74μ g/ml。进一步的，上述的一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，所述步骤
3)中，建立亚洲I型口蹄疫间接夹心ELISA方法的过程具体如下:
a)包被ELISA板:用碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)稀释口蹄疫亚洲I型兔抗血清(兰州兽医研究所提供)至工作浓度(I: 1000)即将I μ I 口蹄疫亚洲I型兔抗血清加入1000 μ I碳酸盐包被缓冲液中)，混匀，每孔加50 μ I于底部，震荡2-3分钟后用封板膜封板或置湿盒中室温过夜；
b)洗涤ELISA板:揭掉封板膜，弃去ELISA板中液体，每孔加满洗涤液(0.0lM pH 7.4磷酸盐吐温缓冲液，I XPBST)，静置30秒后弃去液体，重复4次，拍干；
c)加样:用IXI3BST将对照抗原和被检抗原从1:2，即50μI抗原加50 μ I PBST，开始做2倍连续稀释至1:256，每孔加50μ 1，37°C，温育I小时，用PBST洗涤ELISA板4次，拍干;
d)加二抗:用豚鼠抗血清稀释液稀释口蹄疫亚洲I型豚鼠抗血清至工作浓度(1:1000，即将1μ I 口蹄疫亚洲I型豚鼠抗血清加入ΙΟΟΟμ I豚鼠抗血清稀释液中)，豚鼠抗血清稀释液为含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST，每孔加50 μ 1，封板，37°C，温育I小时后用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；
e)加酶:用IXPBST稀释兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物至工作浓度(1:500，即将I μ I兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物加入1000 μ I PBST中)，每孔加50 μ 1，37°C温育I小时后用PBST洗涤ELISA板4次，拍干；
f)显色:每孔加50μ I底物溶液，37°C温育15分钟，所述底物溶液为20mmol/L邻苯二胺0PD，0.05M柠檬酸磷酸盐缓冲液，0.015%H202 ；
g)终止:每孔再加50μ I终止液终止反应，所述终止溶液为浓度为1.25%的H2SO4 ；
h)测定:在490nm波长下读取光吸收值。进一步的，上述的一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，所述步骤
4)中，是以标准对照抗原的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。进一步的，上述的一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，所述步骤
5)中，是以样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度；
或以标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度。进一步的，上述的一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，所述步骤
6)中，是将亚洲I型口蹄疫146S抗原作系列稀释，用标准对照抗原的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式的最小抗原含量，将待测口蹄疫抗原作为被检抗原时，检测反应OD值小于标准对照抗原的敏感性检测值。本发明的第二个目的是提供了一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒，所述亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒是以上述的亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法进行检测的。本发明的第三个目的是提供了一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒在亚洲I型口蹄疫抗原定量和分型代中的应用。本发明的第四个目的是提供了一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒在口蹄疫疫苗质量评估和分型中的应用。亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA试剂盒，基本原理是先用蔗糖密度梯度离心法对亚洲I型口蹄疫抗原进行定量(平行3次)，以它为标准对照抗原，对其它样品进行ELISA检测，先用口蹄疫亚洲I型兔血清包被微孔板，制成固相抗体，依次加入抗原样品、口蹄疫亚洲I型豚鼠血清、辣根过氧物酶标记的抗豚鼠IgG，形成包被抗体-抗原-第二抗体-酶标抗体复合物，再加底物溶液显色、加酸终止，颜色的深浅和样品中的亚洲I型口蹄疫146S抗原浓度呈正相关。用酶标仪在490nm波长下测定吸光度(0D值)，通过标准曲线计算样品中亚洲I型口蹄疫抗原的浓度。本发明的有益效果为:本发明提供的一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法既保持了蔗糖密度梯度离心法的优势(国际公认)，又具有ELISA方法的特长，本发明建立的抗原定量的间接夹心ELISA方法，重点解决了亚洲I型口蹄疫抗原定量和疫苗质量评估问题；本发明在测定口蹄疫抗原的含量时，既能计算出抗原含量，又能对抗原进行分型，以其原理制备的试剂盒，敏感、特异、操作简单、省时省力、稳定性好、适合于批量检测，且能区分血清型，既可用于亚洲I型口蹄疫疫苗生产中半成品的在线监测，又可优化疫苗生产工艺,还可作为口蹄疫成品疫苗体外检验技术,评估疫苗的质量,替代本动物的效力试验。本发明将在抗原生产在线监测、疫苗工艺优化、疫苗质量评估、疫苗效力检验等方面发挥重要作用。实验效果说明:
1、亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒在亚洲I型口蹄疫抗原定量和分型中的应用:
用亚洲I型口蹄疫间接夹心ELISA方法对5份亚洲I型口蹄疫病毒146s抗原含量进行测定四次，结果稳定、重复性好，同时测其它型的2份抗原(O型和A型)，结果均低于其敏感性范围，表明该发明的特异性好。如表I所示为间接ELISA对5份亚洲I型口蹄疫病毒抗原和2份其它型抗原146s抗原含量测定结果。
权利要求
1.种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)储备亚洲I型口蹄疫标准对照抗原； 2)纯化定量亚洲I型口蹄疫标准对照抗原146S； 3)建立亚洲I型口蹄疫间接夹心ELISA方法； 4)绘制标准对照抗原标准曲线； 5)计算被检样品146S抗原含量； 6)检测敏感性和特异性。
2.据权利要求1所述的一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤I)中，对亚洲I型口蹄疫标准对照抗原，一部分按5mL/瓶，置于-70°C储备，此部分仅解冻一次，用于ELISA试验；另一部分按3X100 mL，置于_70°C储备，此部分仅解冻一次，分三次用于146S抗原纯化定量。
3.据权利要求2所述的一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤2)中，是利用蔗糖密度梯度法，梯度浓度为45%、35%、25%、15%，纯化亚洲I型口蹄疫标准对照抗原，三次测得146S抗原含量的平均值为1.74μ g/ml。
4.据权利要求3所述的一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤3)中，建立亚洲I型口蹄疫间接夹心ELISA方法的过程具体如下: a)包被ELISA板:用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释口蹄疫亚洲I型兔抗血清至工作浓度，工作浓度为1:1000,即将I μ I 口蹄疫亚洲I型兔抗血清加入1000 μ I碳酸盐包被缓冲液中，混匀，每孔加50μ I于底部，震荡2-3分钟后用封板膜封板或置湿盒中室温过夜； b)洗涤ELISA板:揭掉封板膜，弃去ELISA板中液体，每孔加满洗涤液，洗涤液为0.01M,pH 7.4的磷酸盐吐温缓冲液，I XPBST，静置30秒后弃去液体，重复4次，拍干； c)加样:用IXPBST将对照抗原和被检抗原从1:2，即50μI抗原加50 μ I PBST，开始做2倍连续稀释至1:256，每孔加50μ 1，37°C，温育I小时，用PBST洗涤ELISA板4次，拍干; d)加二抗:用豚鼠抗血清稀释液稀释口蹄疫亚洲I型豚鼠抗血清至工作浓度，工作浓度为1:1000，即将1μ I 口蹄疫亚洲I型豚鼠抗血清加入ΙΟΟΟμ I豚鼠抗血清稀释液中，豚鼠抗血清稀释液为含10%正常牛血清，5%健康兔血清的PBST，每孔加50μ 1，封板，37°C，温育I小时后用PBST洗涤ELISA板4次，拍干； e)加酶:用IXPBST稀释兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物至工作浓度，工作浓度为1:500，即将I μ I兔抗豚鼠-辣根过氧化物酶结合物加入1000 μ I PBST中，每孔加50μ I,37°C温育I小时后用PBST洗涤ELISA板4次，拍干； f)显色:每孔加50μ I底物溶液，37°C温育15分钟，所述底物溶液为20mmol/L邻苯二胺0PD，0.05M柠檬酸磷酸盐缓冲液，0.015%H202 ； g)终止:每孔再加50μ I终止液终止反应，所述终止溶液为浓度为1.25%的H2SO4 ； h)测定:在490nm波长下读取光吸收值。
5.据权利要求4所 述的一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤4)中，是以标准对照抗原的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
6.据权利要求5所述的一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤5)中，是以样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度； 或以标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，得到样品的实际浓度。
7.据权利要求6所述的一种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤6)中，是将亚洲I型口蹄疫146S抗原作系列稀释，用标准对照抗原的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式的最小抗原含量，将待测口蹄疫抗原作为被检抗原时，检测反应OD值小于标准对照抗原的敏感性检测值。
8.种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒是以权利要求1_7任一所述的亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法进行检测的。
9.种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒在亚洲I型口蹄疫抗原定量和分型中的应用。
10.种亚洲I型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测试剂盒在口蹄疫疫苗质量评估和分型中的应用 。
全文摘要
本发明公开了一种亚洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法，包括以下步骤1)储备亚洲Ⅰ型口蹄疫标准对照抗原；2)纯化定量亚洲Ⅰ型口蹄疫标准对照抗原146S；3)建立亚洲Ⅰ型口蹄疫间接夹心ELISA方法；4)绘制标准对照抗原标准曲线；5)计算被检样品146S抗原含量；6)检测敏感性和特异性。并提供了应用此检测方法的试剂盒。本发明的有益效果为本发明提供的一种亚洲Ⅰ型口蹄疫146S抗原定量ELISA检测方法在测定口蹄疫抗原的含量时，既能计算出抗原含量，又能对抗原进行分型，以其原理制备的试剂盒，敏感、特异、操作简单、省时省力、稳定性好、适合于批量检测，且能区分血清型。
文档编号G01N21/31GK103091270SQ201310055748
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月17日 优先权日2013年1月17日
发明者冯霞, 马军武, 周广青, 杨亚民 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所