专利名称：一种定量丹参组份差异的高速逆流指纹谱的方法
技术领域：
本发明涉及丹参指纹谱分析方法，特别是一种定量丹参组份差异的高速逆流指纹谱的方法。
背景技术：
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。全国大部分地区均产。由于丹参因品种、产地、采收期不同而造成质量参差不齐，因而其制成品质量的稳定性也难以保证。目前，对丹参及其复方制剂的鉴定，往往是选取丹参的一、二个活性成分或指标成分进行含量测定，并以其含量多少来判定质量。例如，以丹参酮IIA含量(中国药典2000年版一部58页)或丹参素含量(张友芹等，中医药学报，2000，28(3)68)等来鉴别丹参药材的质量；以丹参酮来判定丹参品种和产地情况(裘飞君，中国现代应用药学，1998，15(5)16；胡世林等，中国中药杂志，1999，24(12)721)；用丹参素含量(严常开等，中国医院药学杂志，2000，20(10)600、原儿茶醛含量(郑末晶等，中国药事，2000，14(4)254)或丹参酮IIA含量(林伟忠等，中成药，2000，22(11)766)等判别复方丹参制剂的含量，用丹参酮IIA含量鉴别不同厂家生产的复方丹参片的质量(邵水娟，中国药业，2000，9(7)27)等。已知的丹参的化学成分有几十种，其脂溶性成分大多为醌型红黄色物质，如丹参酮I、IIA、IIB，丹参醌A、B、C，丹参酸钾脂，异丹参酮I、II，隐丹参酮等。其水溶性成分大多为酚性醛、酚性酸、二萜酸，如丁二酸、丹酚酸A、B、C，3，4二羟基苯甲酸等。此外，还分离出β-谷甾醇、维生素E等(王伯祥主编，中医肝胆病学，第一版，中国医药科技出版社，1993年，96页)。如果用一、二种丹参的活性成分来说明丹参及其成方制剂的内在含量，具有一定的片面性，更不用说无药效的指标成分了。要控制丹参及其成方制剂的功效，就不能只针对其一、二个化学成分，必须对它的物质群整体予以控制。所以，除了“微观分析”外，还应用某种“宏观分析”方法，从整体上有效地表征药材质量。中药指纹图谱是指某种药材或中成药中共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，对于有效控制中药材或中成药的质量，具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就已经在企业内部采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物联合开发的过程中，发现银杏叶提取物的医疗作用是提取物所得物质群的整体作用结果，而对这样一个整体的质量控制，亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA最近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA.Guidance of IndustryBotanicalDrug(Draft).2000 August).指纹图谱作为天然药物及其提取物质量控制方法，目前已经成为国际共识。现在，对丹参中活性成分如丹参酮、丹参素等的测定方法较多，也有丹参色谱指纹图谱的建立方法，丹参数字化色谱指纹谱不仅可提供复杂组分样品的定性描述，还可建立其相应的量化指标，使鉴定结果更科学、更客观，也易于建立和使用指纹谱库。
但是现有的丹参数字化指纹谱只是将不同批次(产地)样品各对应组分的相对保留时间和相对峰面积列于两个表中。例如丹参样品1和丹参样品N的相对保留时间的差异程度(表1)，没有采用相对偏差、相对标准偏差等进行明确的计算；任意2个样品之间的相对峰面积的差异(表2)也没有通过差异率体现在数字指纹谱的表中(洪筱坤，王智华.中药数字化色谱指纹谱.上海上海科学技术出版社.2003.)。
表1不同批次(产地)丹参样品各对应组分的相对保留时间

表2 不同批次(产地)丹参样品各对应组分的相对峰面积

发明内容本发明要解决的技术问题是克服已有方法在丹参指纹谱建立时，不同批次样品的量化比较直观性差的缺陷，提供一种高速逆流(HSCCC)指纹谱的方法。
本发明的技术方案包括如下步骤步骤1，供试品的制备用常规技术制备3个批次的丹参粗提物，确定所包含的是丹参蒽醌类化合物；步骤2，用高速逆流色谱仪分离纯化丹参粗提物在10～30℃，主机转速为750～950rpm，1.0～2.5mL/min的流速将流动相泵入分离柱内，选取HSCCC的溶剂体系，溶剂体系由三个组分构成，A组分可选自正庚烷、正己烷、正戊烷等正构烷烃，B组分可选自甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮等脂肪醇及脂肪酮，C组分为水；优选为溶剂体系甲正己烷-乙醇-水 体积比10∶5.5∶4.5；溶剂体系乙正己烷-乙醇-水 体积比10∶7∶3；步骤3，紫外检测器检测洗脱液，得到3批次丹参药材的色谱图。同时分别收集各组份，通过其在HPLC上的保留时间和在UV-Vis光谱图上的峰值及形状确定3张洗脱图谱中的12个洗脱峰所包含的12个组分分别对应，没有非共有指纹峰；步骤4，取洗脱峰7为参照峰计算相对保留时间和相对峰面积，相对保留时间是用将色谱峰的保留时间与内参照峰保留时间之比来量化的。相对峰面积采用参照峰比值法以内参照峰的峰面积作为基准，其他各色谱峰的峰面积与它作比较，由此得到一系列的面积比值。
步骤5，计算丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱的方法误差，方法误差包括作为定性依据的相对保留时间的相对偏差和相对标准偏差，以及作为定量依据的相对峰面积的相对偏差和相对标准偏差。若在方法误差范围内，可判定该组峰为同一峰(组分)；若超出方法误差则可视为不同组分(表3)。
表3 丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱的方法误差

步骤6，构建丹参饮片HSCCC数字化指纹谱；选定参照峰i，表4中相对保留时间的计算是以峰i的保留时间为1，将其它峰的保留时间与之相比，因此其他峰的保留时间均大于或小于1。表4中平均值是指对应性峰的相对保留时间tR的平均值。相对保留时间tR的相对标准偏差和相对标准偏差根据如下公式计算。
表4中相对峰面积A采用归一化面积值，即以参照峰i的面积为1，将其他色谱峰面积与之相比，得到一系列面积比值，对于不同批次样品同一峰的差异率计算，若确定某一批次为标准，可与其进行比较计算，若所有批次均未确定标准可以与平均值比较确定。


特征指纹峰差异率＝|AI标-AI鉴|/AI标将相对保留时间在方法误差范围内的组分放在一个窗口，即认为在方法误差范围内的是同一组分，超出的认为是不同组分。
差异率是指每个指纹峰与其相应标准指纹峰两者间的差异程度。总差异率则是将一个样品中每个指纹峰的差异率求和。总差异率越大，表示比较双方相差越大，同时归纳了定性鉴定和量化描述两方面信息的综合性参数。
特征指纹峰差异率＝|AI标-AI鉴|/AI标

表4 丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱

步骤7，绘制丹参特征指纹曲线丹参脂溶性化合物的HSCCC指纹谱中不存在非共有峰，峰1#～12#均是这三个样品共有，可将这12个峰作为特征指纹峰，构成HSCCC的特征指纹，绘制特征指纹曲线(图2)。
本发明提供了从各种途径制备的不同含量丹参，采用高速逆流色谱仪(HSCCC)直接进大量丹参粗提样品，分离结果能达到相当高的纯度。高速逆流色谱法可避免柱吸附和柱污染，特别适用于高粘度及易造成固定相吸附的样品的分析，其性价比高，有利于在原药材产地及经济欠发达地区推广应用，是对现有指纹图谱方法的重要补充。
本发明的优点是提供一种定量丹参组份差异的高速逆流指纹谱的方法，数字化指纹谱不但用相对值的概念，解决了图象形式的指纹图谱受操作因素影响、难以进行多批次的量化比较的问题。而且明确在方法误差的基础上，建立一系列参数和相应的一整套比较规则和计算公式，在数字图谱中直接引入了相对保留时间的相对偏差和相对标准偏差，以及相对峰面积的差异率，以直观地、定量地表现出不同样品中各对应组分的差异程度，实现了任意2个丹参样品之间的直观地量化比较。可提高对丹参真伪优劣鉴别的标准，作为控制及衡量丹参质量标准的重要内容。


图1-1是河北产丹参的HSCCC图谱图1-2是山东产丹参的HSCCC图谱图1-3是江苏产丹参的HSCCC图谱图2是丹参醌类化合物的特征指曲线具体实施方式
实施例11.仪器与试剂(1)仪器1)TBE-300半制备型高速逆流色谱仪(深圳同田生化技术有限公司，中国)。聚四氟乙烯管缠绕在3个水平轴上形成螺旋管(管直径2.6mm，分离体积300mL)，进样圈20mL。高速逆流色谱配备了柱塞式泵(S系列，北京圣益通技术开发有限责任公司，中国)，紫外检测仪(8823A，北京新技术应用研究所，中国)，记录仪(3057型，四川记录仪器厂，中国)。
2)高效液相色谱(10Avp系列，岛津，日本)双泵系统(LC-10ATvp)，紫外检测仪(SPD-10Avp)，柱温箱(CTO-10ASvp)，系统控制器(SCL-10Avp)，控制软件(Class-vp)，20μL进样圈；色谱柱反向C18柱(150mm×4.6mm I.D.，5μm)。
(2)试剂1)高速逆流色谱试剂采用分析纯(天津化学试剂一厂)。水是通过反渗透Mili-Q(18MΩ，Milipore，USA)制备。2)高效液相色谱试剂采用一级色谱纯(Fisher Scientific Co.Ltd.，UK)。将反渗透处理过的水(18MΩ，Milipore，USA)通过0.45μm滤膜减压过滤后使用。标准对照品用高速逆流色谱的流动相配制成1mg/mL，经0.45μm滤膜过滤使用。
(3)丹参饮片来自3个产地河北、山东、江苏。
(4)标准对照品国家药品监督管理局，中国药品与生物制品检定所提供。
2.丹参特征指纹谱的建立将3个批次丹参根或根茎粉碎成粉；20g丹参粉溶于50mL溶剂(正己烷∶乙醇＝1∶1，V/V)，搅拌45min，沉降后取上清；沉淀再溶于25mL溶剂(正己烷∶乙醇＝1∶1，V/V)，搅拌45min，沉降后取上清；合并两次的上清液，离心10000g×10min，弃沉淀，留上清，定容；加入2倍体积的水，在分液漏摇匀，静置过夜；分出上相(有机相)，定容，用2倍于有机相体斗中积的30wt％乙醇洗涤下相(水相)，直至下相(水相)近乎无色，浓缩上相，在真空干燥器内充分干燥，得到丹参的粗提物干粉，粗提收率为2wt％；通过薄层色谱法检测得到的丹参粗提物，确定药材粗提物所包含的主要化合物类型为丹参蒽醌类化合物，并配制高速逆流色谱流动相溶剂体系甲为正己烷-乙醇-水＝10-5.5-4.5(V/V)，溶剂体系乙为正己烷-乙醇-水＝10-7-3(V/V)；将配制的溶剂体系甲在分液漏斗中充分振荡，静置分层，分出上相作为固定相的那一层溶剂，将其加入高速逆流色谱仪的分离柱；下相作为流动相；在10～30℃，开启高速逆流色谱仪，采用主机正转，主机转速为900rpm，并以2mL/min的流速将流动相泵入管柱内，整个体系建立动态平衡，从进样阀注入步骤1)制得的某一批次药材粗提物，0-470min以体系甲的下相为流动相，470min后更换为体系乙的下相为流动相，各组分按其在两相中的分配系数分离开来；使用紫外检测器在线检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；每个批次丹参样品经高速逆流色谱分离纯化的洗脱曲线，均得到洗脱峰12个。在洗脱过程中，同时分别收集各组份，再通过其在HPLC上的保留时间和在UV-Vis光谱图上的峰值及形状确定各批次中药材粗提物的各组份的对应性；图1所示为3个产地的丹参的HSCCC图谱。由图可见，经HSCCC纯化，3个产地的丹参各得到12个洗脱峰，峰的数目一致。对各洗脱峰进行分析测定各洗脱峰在反相高效液相色谱(HPLC)上的保留时间；在紫外-可见分光光度计900-200nm范围对各洗脱峰进行全波长扫描，得到吸收光谱。从HPLC保留时间和紫外吸收光谱可以判定，3个产地丹参洗脱曲线中的第n(n为3-12)个洗脱峰为同一组分。说明3个产地丹参的HSCCC洗脱图谱，不但洗脱峰个数一致，而且对应洗脱峰为同一组分。
3张洗脱图谱中的12个洗脱峰所包含的12个组分分别对应，没有非共有指纹峰，取洗脱峰7为参照峰计算相对保留时间和相对峰面积，相对保留时间是用将色谱峰的保留时间与内参照峰保留时间之比来量化的。相对峰面积采用参照峰比值法以内参照峰的峰面积作为基准，其他各色谱峰的峰面积与它作比较，由此得到一系列的面积比值。
计算丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱的方法误差，方法误差包括作为定性依据的相对保留时间的相对偏差和相对标准偏差，以及作为定量依据的相对峰面积的相对偏差和相对标准偏差。若在方法误差范围内，可判定该组峰为同一峰(组分)；若超出方法误差则可视为不同组分(表3)。
表3 丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱的方法误差

方法误差包括两方面(1)相对保留时间的误差范围相对保留时间的相对标准偏差小于3％；(2)相对峰面积的误差范围相对峰面积的相对标准偏差小于8％。即相对保留时间的RSD＜3％认为是同一组分；相对峰面积的RSD＜8％认为含量相同。在此基础上，将相对保留时间在方法误差范围内的放在一个窗口下，比较不同样品中各对应组分的差异程度。
构建丹参饮片HSCCC数字化指纹谱；选定参照峰i，表4中相对保留时间的计算是以峰i的保留时间为1，将其它峰的保留时间与之相比，因此其他峰的保留时间均大于或小于1。表4中平均值是指对应性峰的相对保留时间tR的平均值。相对保留时间tR的相对标准偏差和相对标准偏差根据如下公式计算。
表4中相对峰面积A采用归一化面积值，即以参照峰i的面积为1，将其他色谱峰面积与之相比，得到一系列面积比值，对于不同批次样品同一峰的差异率计算，若确定某一批次为标准，可与其进行比较计算，若所有批次均未确定标准可以与平均值比较确定。


特征指纹峰差异率＝|AI标-AI鉴|/AI标将相对保留时间在方法误差范围内的组分放在一个窗口，即认为在方法误差范围内的是同一组分，超出的认为是不同组分。
差异率指每个指纹峰与其相应标准指纹峰两者间的差异程度。总差异率则是将一个样品中每个指纹峰的差异率求和。总差异率越大，表示比较双方相差越大，同时归纳了定性鉴定和量化描述两方面信息的综合性参数。
特征指纹峰差异率＝|AI标-AI鉴|/AI标

表4 丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱

丹参脂溶性化合物的HSCCC指纹谱中不存在非共有峰，峰1#～12#均是这三个样品共有，可将这12个峰作为特征指纹峰，构成HSCCC的特征指纹，绘制特征指纹曲线(图2)。
权利要求
1.一种定量丹参组份差异的高速逆流指纹谱的方法，其特征在于包括下列步骤(1)，供试品的制备常规制备3个批次的丹参粗提物，确定是丹参蒽醌类化合物；(2)，用高速逆流色谱分离纯化相提物，HSCCC的溶剂体系由三个组分构成，A组分可选自正庚烷、正己烷、正戊烷等正构烷烃，B组分可选自甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮脂肪醇及脂肪酮，C组分为水；(3)紫外检测器检测洗脱液，绘制各组份的紫外吸收与洗脱时间的关系图；得到各批次药材的色谱图，选取共有指纹峰；计算高速逆流色谱指纹谱的方法误差(表3)；制定3批药材的指纹谱(表4)，以标准药材为准，计算差异率。表3丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱的方法误差
表4丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱
2.根据权利要求1所述的一种定量丹参组份差异的高速逆流指纹谱的方法，其特征在于计算丹参饮片的HSCCC数字化指纹谱的方法误差，制定3批次丹参的数字化指纹谱有如下步骤(1)选定参照峰，相对保留时间的计算是以峰i的保留时间为1，将其它峰的保留时间与之相比，平均值是指对应性峰的相对保留时间tR的平均值，相对保留时间tR的相对标准偏差和相对标准偏差根据如下公式计算；(2)相对峰面积A采用归一化面积值，即以参照峰i的面积为1，将其他色谱峰面积与之相比，得到一系列面积比值，对于不同批次样品同一峰的差异率计算，若确定某一批次为标准，可与其进行比较计算，若所有批次均未确定标准可以与平均值比较确定；
特征指纹峰差异率＝|AI标-AI鉴|/AI标差异率是指每个指纹峰与其相应标准指纹峰两者间的差异程度，总差异率则是将一个样品中每个指纹峰的差异率求和；特征指纹峰差异率＝|AI标-AI鉴|/AI标
(3)丹参脂溶性化合物的HSCCC指纹谱中不存在非共有峰，峰1#～12#均是这三个样品共有，可将这12个峰作为特征指纹峰，构成HSCCC的特征指纹曲线。
全文摘要
本发明涉及一种定量丹参组份差异的高速逆流指纹谱的方法。它包括采用高速逆流(HSCCC)分离纯化，建立HSCCC指纹谱的方法误差，确定HSCCC指纹谱的方法，以相对保留时间和相对峰面积为主要参数，以相对偏差、相对标准偏差和差异率，直观量化不同丹参样品中各对应组分的的差异程度。可提高对丹参药材真伪优劣鉴别的标准，适用于高粘度及易造成固定相吸附的样品的分析。
文档编号G01N30/06GK1621833SQ20041008950
公开日2005年6月1日 申请日期2004年12月14日 优先权日2004年12月14日
发明者顾铭, 邓秋云, 欧阳藩 申请人:上海同田生化技术有限公司, 中国科学院过程工程研究所