专利名称：轮状病毒及腺病毒二合一检测盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物物质的测试和分析所用物质，尤其涉及生物物质的免疫检测所用检测盒。
背景技术：
轮状病毒是引起急性肠胃炎的主要原因，特别作用于2岁以下的儿童，大约40%患肠胃 炎的儿童粪便中可检测到轮状病毒。肠道病毒引起的肠胃炎在危险人群中，比如儿童、中 年以上的或抑制免疫的人，是可致命的。在气候暖和的地方，轮状病毒感染通常在冬季发生。 他们的传播是口-粪途径，潜伏期l-3天，典型的症状包括呕吐、3-8天水样腹泻、高烧和胃 痛，第一次感染后，免疫性是不完全的，但之后的感染与首次相比往往不是很严重。轮状病 毒也是引起急性腹泻最普遍的原因，据统计，在发展中国家，每年由于轮状病毒感染引起的 死亡有1，000，000人，其中有20-25 %是由腹泻引起，引起儿童的死亡中6%都在5岁以下。
腺病毒是引起儿童病毒胃肠炎的第二原因，大约10-15%患肠胃炎的儿童粪便中可检测 到腺病毒。目前被识别的腺病毒血清型已超过47种，所有种类的腺病毒都有一个共同的hexon 抗原，腺病毒也能引起呼吸疾病，而有些血清型腺病毒还可引起结膜炎、膀胱炎等。血清型 40和41腺病毒与胃肠炎最具关联性，腺病毒引起的胃肠炎临床的主要症状是腹泻，可持续 9-12天，也有发烧和呕吐，但通常是良性的。
一方面，由于培养轮状病毒和腺病毒比较复杂，所以培养通常不用作诊断的方法。另一 方面，诊断技术的发展现已能够快速直接地检查粪便中的病毒微粒，比如免疫层析技术的应 用，单一地检测粪便中是否存在轮状病毒或腺病毒的检测用物质和检测方法已得到广泛的应 用，如中国专利CN1814790所公开的一种轮状病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法， 试剂盒包括MLV反转录酶、Rnasin、 DNA聚合酶、引物、dNTP、 MgC12、 10x缓冲液，其中上 游引物P1为5' -GTA TGG TAT TGA ATA TAC CAC-3',下游引物P2为5' -GAT CCT GTT GGC CAT CC-3， RT-PCR检测方法包括提取待测样品模板；在PCR薄壁管中加入MLV反转录酶、 Rnasin、 DNA聚合酶、引物、dNTP、 MgC12、 10x缓冲液、待测样品模板和DEPC水，混勾后 置PCR仪上扩增；在电泳设备中电泳扩增产物，记录结果；分析并进行结果判断；又如中 国专利CN1406285所公开的一种腺病毒的检测与定量方法，使用同义或反义变性的引物对通 过实时PCR扩增腺病毒的核苷酸序列，引物由具有至少80%同源的寡核苷酸混合物组成，它 具有一个包括在5型腺病毒序列的21000-22000个核苷酸之间的序列，在足以能够得到可测 量量的扩增产物的若干循环期间，使用非变性探针检测扩增反应的产物，该探针由至少一种
具有至少80%同源的寡核苦酸组成，它具有一个包括在5型腺病毒序列的21000-22000个核 苷酸之间的序列。
可见，现有技术在对儿童腹泻现象的病因进行分析的时候，通常需要进行两道检测一 次是针对轮状病毒， 一次是针对腺病毒，费时、费力并费料。

发明内容
本发明的目的在于克服上述的对儿童腹泻现象的病因进行分析的时候须对轮状病毒和腺
病毒分别单独检测缺陷，而构建一种新的检测盒，可以一次性地、快速高效地检测出粪便样
品中的轮状病毒和腺病毒。
本发明实现上述目的所采用的具体技术方案是，生产制造一种轮状病毒及腺病毒二合一
检测盒，包括测试物和粪便稀释液，该测试物由层析膜和吸水材料组成，该测试物包括 第一区域，包括吸水材料制成的吸收垫，用以初试接触样品； 第二区域，包括轮状病毒单克隆抗体和腺病毒单克隆抗体包被的胶乳微粒； 第三区域，包括肉眼不可见的三条横向平行线层析膜，第一条有特异的抗-腺病毒抗体，
第二条有特异的抗-轮装病毒抗体，第三条是质控线；和，
第四区域，包括吸水材料制成的吸收垫。
该第三区域的三条线，第一条为第一种颜色的聚苯乙烯微粒与抗-腺病毒单克隆抗体包 被，第二条为第二种颜色的聚苯乙烯微粒与抗-轮状病毒单克隆抗体包被，第三条为第三种颜 色的聚苯乙烯微粒。
该第一种颜色为蓝色，该第二种颜色为红色，该第三种颜色为绿色。
同现有技术相比，本发明的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，使用方便，可省时、省力 并省料地用于检测成人及婴幼儿病毒性胃肠炎引起的急性腹泻、呕吐、高烧和胃痛。
具体实施例方式
以下对本发明予以详尽说明。
本发明的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，主要是应用彩色高分子乳胶标记免疫层析法 同时检测人粪便中的轮状病毒和腺病毒，属临床体外诊断试剂。
非胶体金的高分子微球，以单分散相存在，制备出的标记液分散均勾，易于喷涂、易于 流动及显色均勾易于观察，且灵敏度高；并且，亦具有不同分子量、不同结构形态与表面特 征及在表面上引入不同功能基团的聚合物微球；具有比表面大，吸附性强及较高的力学性能 和优良的耐溶剂性，方便回收重复利用等优点，易于与抗体(抗原)联接；该种彩色微球反
应活性大，与细胞结合迅速且无非特异性吸附，与抗体结合后的微球被用来标记细胞表面抗
原，其性能优于其它类型的微球；其中，以聚苯乙烯微球最为广泛。
通常采用乳液聚合法，以苯乙烯、丙烯酰胺、丙烯酸及有机染料为原料，经过共聚、酰 肼化和叠氮化合成彩色高分子微球，根据所加入油溶性染料的不同而显不同的颜色。其合成
受pH值、有机溶剂、电解质浓度等因素的影响。将彩色单体与苯乙烯共聚，经透析提纯即可
制得彩色胶乳，现可制备出红、兰、绿、黄等彩色品种。
本发明的检测原理是基于单克隆抗体和病毒抗原的相互作用轮状病毒单克隆抗体 (MAb)和A组轮状病毒共有的VP6抗原；腺病毒单克隆抗体(MAb )和所有已知的人类亚 型中出现的抗原hexon;红色聚苯乙烯微粒与抗轮状病毒单克隆抗体包被，蓝色聚苯乙烯微 粒与抗腺病毒单克隆抗体包被；绿色聚苯乙烯微粒用作检测质控。
本发明的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，包括测试卡或测试条、粪便稀释液和使用说 明书。依照巿场需要设计，它可能还包括釆集标本的测试管或标本提取设备。
测试卡或测试条与干燥物质包装，操作方便。
稀释缓冲液用TRIS盐溶液，含有清洁剂和抗菌剂。
轮状病毒/腺病毒测试条为一种半刚性的塑胶条，作为测试系统的媒介物使用，由层析膜 和吸水材料组成，在轮状病毒/腺病毒检测卡中，检测条包被在塑胶盒子内，包括依次排列的 四个区域
第一区域低端，或"样品端"，由浸入标本(检测条)或吸收标本(检测卡)的吸收垫 组成；
第二区域包含轮状病毒和腺病毒单克隆抗体包被的胶乳微粒，覆膜保护(检测条)或 装在卡里(检测卡)；
第三区域测试窗，由肉眼不可见的三条横向平行线层析膜组成，第一条线有特异的抗-腺病毒抗体，第二条有特异的抗-轮装病毒抗体，第三条是质控线，该区域包含的线条用透明 的胶粘材料保护；
第四区域顶端，由标记有测试名称的保护膜和吸收垫组成，该区为手持区，当检测时 为手持区域(检测条)。
粪便标本应在症状开始后尽快收集采取，第一次症状出现后一周，病毒开始减少，会使 诊断更加困难；标本应尽可能有代表性，采取标本后，于4'C环境保存，如果当天不能进行 测试，可于-2(TC环境冷冻保存。
本发明的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒的使用方法是
在不使用萃取瓶的情况，每个标本取一个测试管，加约l-1.5ml缓冲液，接下来，取少 量粪便(30-50mg固体粪便或100ijl液体粪便)，于缓冲液中悬浮。如果使用棉签，把它沉浸
在缓冲液中，在试管壁上旋转挤压；震荡几秒钟之后，插入测试条，检测时保证液面不超过 设定的标度，等待5分钟以上，但不超过10分钟，观察结果；或者，
在使用萃取瓶的情况，如果试剂盒里没有缓冲液，旋开萃取瓶的顶端，注入l-1.5ml缓 冲液，用采集器顶端采取足量粪便(30-50mg固体粪便或100|jl液体粪便)，把它放入瓶中， 旋紧瓶盖，并充分摇动。然后折断瓶颈，向第一区域中滴加4滴标本，加液体时不能加入固 体微粒，等待5分钟以上，但不超过10分钟，观察结果。
结果判断如下
如果仅有一条绿色线出现在测试窗，结果为阴性的； 如果出现绿色线，同时在测试窗处有一红色线，结果为轮状病毒阳性； 如果出现绿色线，同时在测试窗处有一蓝色线，结果为腺病毒阳性； 如果所有三条线均出现 一条绿色线、 一条红色线、 一条蓝色线，结果为混合感染； 如果没有线条出现，测试无效；
测试超过10分钟以上的，不能用于解释结果，偶尔， 一些样品会有不明颜色的淡色的线 条出现，在大多数情况下，这一显示结果判为阴性。
本发明的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒的工作原理是
测试条， 一旦于第一区域加入标本，层析过程就开始，使得第二区域中的有色微粒移动 到第三区域，如果标本中含有腺病毒，它的抗原在第二区域会与蓝色微粒包被的抗体反应， 如果标本中含有轮状病毒，它的抗原在第二区域会与加入红色微粒的抗体反应，形成的红色 微粒-抗体-病毒复合物延伸到第三区域的第一条线，与包被在那的抗-腺病毒抗体或下一条 线的抗-轮状病毒抗体反应， 一条线出现，无论蓝色或红色，其强度随层析测试的进行而增加， 线的强度也依赖于病毒的浓度；如果标本是阴性的，它不含有与第二区域中蓝色和红色胶乳 微粒包被的抗体反应的病毒。微粒-抗体-病毒复合物不能形成，也就不会与第三区域的第一 条和第二条线的a-病毒抗体相互反应，这些线条在层析测试进行中保持不显色。
敏感性测试轮状病毒准备实际标本中的纯化病毒蛋白数量；腺病毒准备重组hexon 抗原。基于多个测试人员在不同条件下对不同批号产品的大量测试，得出了典型的敏感性结 果轮状病毒31ng/ml和腺病毒31ng/ml。同时，检测到测试10分钟后更小的数量轮状病 毒8ng/ml，腺病毒4ng/ml。这些测试可确证两种目标物的敏感性在31ng/ml以上。
稳定性测试
有效期和批号在每个试剂盒上注明。测试卡(或条)和缓冲液可在室温或冰箱中保存。 如果贮存于冰箱，在使用前必须达到室温；
经过不同时间段用检测条所获得的结果，产品生产后正常条件下(室温并包装良好)保 存，显示数据和其他类似产品的有效期在生产后均可达24个月；
不同批生产的检测条贮存于含有无水硅胶试管中，室温(18-28°C )保存，并在不同时间 间隔进行分析。阳性粪便提取用内控轮状病毒-腺病毒连续的1:2的粪便缓冲液稀释。10分 钟判读结果；
本发明的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，轮状病毒/腺病毒检测卡(条)对湿度是非常 敏感的，可导致检测卡(条)无效。 一次必须防潮，包装时需放干燥剂。如果在管里，取出 测试条后，盖始终要盖好。如果管是冷藏于冰箱中，为了避免检测条收缩，等达到室温后再 打开。
标本和原料相容性用于测试的标本(人粪便)与反应装置和其他不同组分是完全相容 的。接合层、膜、标本吸收垫、端吸收垫、上接合层、塑胶设备；
标本与检测盒中其它物质也是相容的加样器移液管和(或)滴管；干燥物无水硅 胶；产品容器铝箔袋。
本发明的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，操作非常简单，不需要任何实验设备。
检测快捷，萃取后，可在5-10分钟判读结果。
结果易观察，肉眼观察可见红色或蓝色线。
灵敏度高大多数为31ng/ml。
当然，本发明的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒也还是存在局限性大量的粪便标本测 试结果显示，在所用样品中，具有良好的测试性能和可靠性。然而，不排除一些标本有干涉 或不相容物质的可能性；过量的标本会导致不明确的没有诊断价值的褐色线出现。在这种情 况下，可用更多的缓冲液稀释标本并重做测试；阴性结果不能完全排除肠道腺病毒和轮状病 毒感染的可能。诊断的意义必须结合病人的临床症状来评价；某些标本的测试会导致不明颜 色的或较微弱的线条出现，大多数情况下判为阴性。因此，当测试到不明显颜色或较淡的线 条时，报告结果时应特别注意。
以上所述之最佳实施例意在具体说明本发明的思路在一测试条/卡上同时检测轮状病毒 及腺病毒，以不同的颜色作为检测信号。本发明之实施，并不限于以上最佳实施例所公开的 方式，凡基于本发明之设计思路，进行简单推演与替换，得到的具体的轮状病毒及腺病毒二 合一检测盒，都属于本发明的实施。
权利要求
1、一种轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，包括测试物和样品稀释液，该测试物由层析膜和吸水材料组成，其特征在于，该测试物包括第一区域，包括吸水材料制成的吸收垫，用以初试接触样品；第二区域，包括轮状病毒单克隆抗体和腺病毒单克隆抗体包被的胶乳微粒；第三区域，包括肉眼不可见的三条横向平行线层析膜，第一条有特异的抗-腺病毒抗体，第二条有特异的抗-轮装病毒抗体，第三条是质控线；第四区域，包括吸水材料制成的吸收垫。
2、 如权利要求l所述的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，其特征在于该样品稀释液为 含清洁剂和抗菌剂的TRIS盐溶液。
3、 如权利要求l所述的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，其特征在于，还包括采集样 品的测试管或样品提取设备。
4、 如权利要求l所述的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，其特征在于该第三区域的三 条线均用透明的胶粘材料保护。
5、 如权利要求l所述的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，其特征在于，该第四区域还包 括标记有测试名称的保护膜。
6、 如权利要求1所述的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，其特征在于该测试物为条式， 该第一区域的吸收垫以浸入的方式初试接触样品；该第二区域的胶乳用微粒覆膜保护；该第 四区域为手持区。
7、 如权利要求1所述的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，其特征在于该测试物为卡式， 该第一区域的吸收垫以吸收的方式初试接触样品；该第二区域的胶乳微粒装在塑胶卡内。
8、 如权利要求l所述的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，其特征在于该测试物包被在 塑胶盒子内。
9、 如权利要求1至8任一所述的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，其特征在于该第三 区域的三条线，第一条为包被抗-腺病毒单克隆抗体的第一种颜色的聚苯乙烯微粒，第二条为 包被抗-轮状病毒单克隆抗体的第二种颜色的聚苯乙烯微粒，第三条为第三种颜色的聚苯乙烯 微粒。
10、 如权利要求9所述的轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，其特征在于该第三区域的 三条线，该第一种颜色为蓝色，该第二种颜色为红色，该第三种颜色为绿色。
全文摘要
一种轮状病毒及腺病毒二合一检测盒，包括测试物和粪便稀释液，该测试物由层析膜和吸水材料组成，该测试物包括第一区域，包括吸水材料制成的吸收垫，用以初试接触样品；第二区域，包括轮状病毒单克隆抗体和腺病毒单克隆抗体包被的胶乳微粒；第三区域，包括肉眼不可见的三条横向平行线层析膜，第一条有特异的抗-腺病毒抗体，第二条有特异的抗-轮装病毒抗体，第三条是质控线；第四区域，包括吸水材料制成的吸收垫。使用方便，可省时、省力并省料地用于检测成人及婴幼儿病毒性胃肠炎引起的急性腹泻、呕吐、高烧和胃痛。
文档编号G01N33/558GK101339194SQ200710076288
公开日2009年1月7日 申请日期2007年7月2日 优先权日2007年7月2日
发明者翔 高 申请人:深圳市惠安生物科技有限公司