专利名称：用于polyq蛋白的生物测定试验的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于与疾病相关的突变POLYQ蛋白的生物测定试验，以及其作为诊断工具用于监测疾病进展或用于监测治疗疾病的效力的用途。
背景技术：
许多疾病与具有多谷氨酰胺重复序列的蛋白质的表达有关，例如亨廷顿病(HD)、脊延髓肌萎缩症、数种脊髓小脑共济失调和齿状核红核苍白球路易体萎缩症 (dentatorubral-pallidoluysian atrophy)。这些病症被共同地称作‘多聚谷氨酰胺病，。 HD是最常见的遗传性神经变性疾病，流行率为5 8/100，OOO0其主要临床表现包括运动功能障碍、精神病学障碍和痴呆。已经尝试了很多HD的对症治疗，但没有任何实质性成功 (Bonelli和Wenning, 2006)，也没有经批准的HD疗法存在(Bates, 2003)。HD是由九种常染色体显性遗传疾病组成的多聚谷氨酰胺(polyQ)疾病家族的创建成员，这些疾病的共同特征是在不同遍在表达的蛋白质中polyQ-重复序列的扩展(Ross，200 。引起HD的遗传突变是在亨廷顿蛋白(himtingtin protein)中的多谷氨酰胺扩展。超过36个谷氨酰胺的扩展变为致病性的，似乎影响蛋白质折叠和毒性胞内片段与聚集体的后续形成。亨廷顿蛋白基因(Htt)中扩展的polyQ重复序列位于外显子1中，引起突变型polyQ-Htt蛋白的表达(Gusella等人，198；3)。polyQ-重复序列扩展可促使从天然无规卷曲构象转化成由多谷氨酰胺链之间的氢键限定的圆柱状平行折叠构象(Perutz等人，1994)。与具有蛋白质错折叠特征的其它神经变性疾病(如阿尔茨海默病或帕金森病)类似，具有螺旋折叠构象的这些蛋白质倾向于形成不可溶蛋白聚集体(Benzinger等人，2000)。当通过RNA干扰(DiFiglia等人，2007)或通过四环素调节的条件表达(Yamamoto 等人，2000)使HD小鼠模型的脑中突变型Htt的表达下调时，HD样症状逆转。有意思的是， 突变型polyQ-Htt和野生型-Htt被细胞有差异地代谢，并显示不同模式的翻译后修饰(磷酸化(Warby 等人，2005)、蛋白水解断裂(Gafni 等人，2004 ；Graham 等人，2006 ；Wellington 等人，2002)、细胞定位(Davies 等人，1997 ;van Roon-Mom 等人，2002)和降解(Ravikumar 等人，2002)。这些发现激励了对如下HD疗法的研发工作，所述HD疗法目的在于例如通过分子伴侣系统的上调或自体吞噬降解途径的诱导而影响突变型Htt的错折叠或清除 (Yamamoto等人，2006)。这些方法可以在由蛋白错折叠引起的其它神经变性疾病中应用。目前，尚没有可用的生物测定试验可以在例如临床试验或治疗中评价此类疗法对突变型多谷氨酰胺蛋白质，例如突变型Htt水平的影响。发明概述本发明涉及用于与疾病相关的可溶性突变POLYQ蛋白的生物测定试验，以及其作为诊断工具用于监测疾病进展或用于监测治疗疾病的效力的用途。在优选的实施方案中，所用的生物测定试验是一种用于Htt检测的新的均相时间分辨Fiirster共振能量转移法，该方法适宜在神经元细胞系中的高通量筛选。我们证实， 可以修改这种“时间分辨Fiirster共振能量转移免疫测定试验”(在下面称作“生物测定试验”)，以定量细胞、动物和人样品中的内源性全长可溶性polyQ-Htt。该生物测定试验的应用使得可以在临床前和临床试验以及在治疗性处理中将可溶性突变型Htt用作疾病进展的标志或用于监测药物处理的效力。由于本方法的设计具有高灵活性，所以其适用于于在其它疾病中使用，尤其是与PolyQ-家族的其它成员相关的疾病。这些蛋白质通常被胞内表达，迄今还没有对诊断和/或监测疾病进展/治疗有用的测定法。在本发明的一个优选的实施方案中，该生物测定试验测量POLYQ蛋白，例如polyQ 亨廷顿蛋白的可溶性形式。在本发明的另一个优选的实施方案中，该生物测定试验测量 POLYQ蛋白，例如polyQ亨廷顿蛋白的聚集形式。在本发明的又一个优选的实施方案中，该生物测定试验既测量可溶性形式的POLYQ蛋白(例如polyQ亨廷顿蛋白)，又测量聚集形式的POLYQ蛋白(例如polyQ亨廷顿蛋白)。因此，一方面，本发明提供了用于测量生物样品中突变形式(polyQ形式)的蛋白质的量的免疫测定试验，其中该蛋白质选自亨廷顿蛋白、雄激素受体、萎缩蛋白 (atrophin) 1、共济失调蛋白(ataxin) 1、共济失调蛋白2、共济失调蛋白3、共济失调蛋白7、 TATA盒结合蛋白或α Ia电压依赖性钙通道亚基。在根据本发明的免疫测定试验的一个优选的实施方案中，在该免疫测定试验中还测量样品中相应野生型蛋白的绝对量或相对量。在根据本发明的免疫测定试验的又一个优选的实施方案中，还测量突变蛋白的翻译后修饰的程度，例如表达蛋白的细胞修饰，例如通过例如蛋白水解断裂的片段化、磷酸化、乙酰化、泛素化、SUMO化、脂质修饰或多肽主链的其它共价修饰。在根据本发明的免疫测定试验的再一个优选的实施方案中，该免疫测定试验是单步骤测定试验，即，其中无需分离或洗涤且可以优选地在单个生物化学操作后运行的免疫测定试验。在根据本发明的免疫测定试验的另一个优选的实施方案中，该免疫测定试验的检测技术以时间分辨Fiirster共振能量转移或电化学发光为基础。在根据本发明的免疫测定试验的又一个优选的实施方案中，该免疫测定试验的检测技术是时间分辨Fiirster共振能量转移。在根据本发明的免疫测定试验的再一个优选的实施方案中，该免疫测定试验包括下列步骤a)将生物样品与用镧系元素离子穴状化合物(例如铕或铽穴状化合物)标记的第一抗体和用适于检测镧系元素发射的信号的荧光团标记的第二抗体接触，其中一种抗体对突变型蛋白的polyQ部分具有特异性，而另一抗体对该突变型亨廷顿蛋白的不同部分具有特异性，和b)通过时间分辨FSrster共振能量转移，测量来自荧光团的荧光，而定量样品中突变型POLYQ蛋白的量。在根据本发明的免疫测定试验的另一个优选的实施方案中，还通过将样品与对该蛋白质的野生型形式具有特异性且用适于检测镧系元素发射的信号的不同荧光团标记的第三抗体接触，在生物样品中另外测量样品中相应野生型蛋白的绝对量或相对量。在根据本发明的免疫测定试验的又一个优选的实施方案中，polyQ-蛋白质是 polyQ-亨廷顿蛋白。在根据本发明的免疫测定试验的再一个优选的实施方案中，生物样品源自脑、血、肌肉或心，或源自任何其它的外周组织，例如皮肤或毛发。在本发明的另一方面，免疫测定试验用于测量生物样品中蛋白质的突变POLYQ形式的量，其中该蛋白质选自亨廷顿蛋白、雄激素受体、萎缩蛋白1、共济失调蛋白1、共济失调蛋白2、共济失调蛋白3、共济失调蛋白7、TATA盒结合蛋白或α Ia电压依赖性钙通道亚基；作为诊断工具，用于监测疾病进展或用于监测与蛋白质的突变POLYQ形式有关的疾病的治疗效力。该免疫测定试验优选是如本申请中所述的免疫测定试验。附图简述

图1 优化检测尾(detection tag)、cDNA构建体和分析原理A.示出了用抗体对β 1和25Η10进行分析的肽的氨基酸序列，各表位以粗字体表示。Β.Α.中所示的肽的时间分辨FRET分析(3ng/孔，一式两份)。选择Hl序列用于加尾突变型Htt，选择16序列用于加尾野生型Htt。C.在可诱导的HNlO细胞系中表达的cDNA 构建体的示意图，还示出25H10、32A7和β 1在C端尾上的抗体结合位点。2Β7对Htt的内源性氨基端表位具有特异性。D.用于基于细胞的时间分辨FRET测定法的方案的示意图。图2 通过时间分辨FSrster共振能量转移检测突变型和野生型HttA.蛋白质印迹分析，相比于内源性全长Htt，野生型(573-Q25)和突变型(573-Q72)Htt在HNlO细胞中的诱导表达。B.诱导3天后，被突变型和野生型Htt转染的HNlO细胞系显示跨时间和多个细胞代的稳定Htt表达。C. 3天诱导后，用所示抗体组合，通过时间分辨FRET对野生型或突变型Htt进行的灵敏且特异的检测(平均值，η = 3，标准差)。D.利用2Β7和β 1抗体对在诱导3天的细胞中检测突变型Htt573-Q72的细胞裂解条件的优化(时间分辨FRET在加入抗体后50min测量，11 = 6，标准差)。E.细胞裂解和加入检测抗体后Z，-因子在35_1 IOmin 之间保持稳定，但绝对时间分辨FRET信号随时间而增加(未显示)，573-Q72HN10细胞诱导 3天(n = 6，标准差)。F.在用不同诱导剂浓度处理的细胞中突变型Htt573-Q72表达的剂量依赖性增加(n = 6，标准差，EC50 250nM)。A_C.这些数据在96孔板格式中产生。D-F. 这些数据在1536孔板格式中产生。图3 =Htt生物测定试验所用方案的示意图通过单个移液步骤将被标记用于时间分辨FRET的单克隆抗体加至细胞裂解物或组织勻浆物中。与Htt的同时结合使两种抗体靠近，由此使得能量可以从铕穴状化合物转移至D2-荧光团。由镧系元素穴状化合物发射的独特长寿命荧光允许时间分辨测量，并由此允许在时间上区别于干扰性的短寿命背景荧光。因而，在具有强色彩和自体荧光的生物样品(如血液)中可以实现准确的Htt测量。B.人Htt(加尾的Htt573片段)上的抗体结合位点的图示。2B7和MWl分别对位于Htt的氨基端和polyQ重复序列上的Htt表位具有特异性。三种单克隆抗体β1、32Α7和25H10对加在该加尾的Htt573片段的羧基端上的表位具有特异性。MWl与PolyQ-重复序列的结合随着polyQ-长度的变化而导致与Htt的更强的和增加的结合(由在图中显示的两个抗体表示)。图4 亨廷顿病的细胞模型中突变型亨廷顿蛋白的检测A 使用Htt抗体对2B7和丽1，在诱导的HNlO细胞的裂解物中，对加尾的野生型 (25Q)和突变型(72Q)Htt 573片段进行时间分辨FRET检测。由未诱导的细胞制备的裂解物用作阴性对照。B 用2B7和丽1通过时间分辨FRET对HNlO细胞中诱导的未加尾的Htt 外显子1片段进行特异性检测。C 用2B7和丽1通过时间分辨FRET对标准量的经纯化的重组野生型05Q)或突变型G6Q)Htt 573蛋白质进行定量。D.用2B7和丽1通过时间分辨FRET分析ESC衍生神经元中慢病毒介导的未加尾野生型(25Q)和突变型(72Q)Htt 548 片段的表达，表明Htt信号作为polyQ-长度的函数而增加，但是用2B7进行的蛋白质印迹显示相似的Htt表达水平。模拟感染的细胞中未检测出Htt片段。微管蛋白为上样参照。 E 特异性检测140Q-敲入(knock-in)ESC中的内源性Htt。Htt敲除ESC(KO)用作阴性对照。2B7和丽1未检测出具有7Q的鼠野生型Htt。F:从表达具有增加的polyQ长度的内源性Htt的敲入ESC衍生神经元获得细胞裂解物，分析该裂解物证实了 Htt的该时间分辨 FRET测定对polyQ的依赖性。图中所示的细胞裂解物中的Htt表达均独立地通过蛋白质印迹分析进行了确认(未示出)。所有图均显示η = 3的平均值，其中误差柱指示标准差值。图5 通过双重时间分辨FSrster共振能量转移，同时测定野生型和突变型Htt对同一样品中加尾的野牛型和突变型Htt573的表达水平进行测定。HNlO细胞表达在氨基酸573截短的且分别用β 1和32Α7抗原或用β 1和25Η10抗原加尾的野生型 Htt (25Q)和突变型Htt (72Q)两者。β 1携带铽穴状化合物部分，将荧光能量转移至D2标记的25Η10和Alexa488标记的32A7。在两个不同波长通道中测量了 D2和Alexa488信号。图6 纯的重组Htt蛋白的生产SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳在细菌中产生的纯化的野生型(Htt573Q20和突变型 (Htt573Q46)蛋白。规定量的牛血清白蛋白(BSA)被上样用作对照以评估在所用的纯化方法中获得的纯化Htt的量。图7 用抗体对2B7和丽ι以及2B7和4C9通过双重时间分辨Fiirster共振能量
转移对重组野生型和突变型Htt进行测定使用所示抗体对，通过双重时间分辨Fiirster共振能量转移，对确定量的重组野生型Htt (25Q)和突变型Htt (46)进行分析。尽管2B7和MWl (Alexa488通道)以polyQ-依赖性方式更好地识别突变型Htt，但是2B7和4C9 (D2通道)导致对野生型Htt比对具有延长PolyQ的突变型Htt蛋白更强的信号。图8 用抗体对2B7和MWl以及2B7和2166通过双重时间分辨FSrster共振能量
转移对重组野生型和突变型Htt进行测定使用所示抗体对，通过双重时间分辨Fiirster共振能量转移，对确定量的重组野生型Htt (25Q)和突变型Htt (46)进行分析。尽管2B7和MWl (Alexa488通道)以polyQ-依赖性方式更好地识别突变型Htt，但是2B7和2166 (D2通道)导致对野生型Htt比对具有延长polyQ的突变型Htt蛋白更强的信号。图9 用抗体对4C9和2166通过时间分辨Fiirster共振能量转移对重组野生型和突变型Htt进行测定使用抗体对4C9和2166，通过时间分辨Fiirster共振能量转移，对确定量的重组野生型Htt(25Q)和突变型Htt (46)进行分析，两个抗体对同等良好地识别突变型Htt和野生型Htt。图10 对小鼠HD模型中可溶性突变型亨廷顿蛋白的检测A 对在R6/2小鼠的脑中具有200Q的Htt外显子1进行时间分辨FRET检测。野生型小鼠用作阴性对照。相比于症状发生前的4周龄小鼠，具有症状的12周龄小鼠中用2B7 和丽1抗体对测量到的Htt的相对浓度显著下降。B 通过AGERA测定R6/2小鼠中的脑Htt聚集物(在A中所分析的相同样品)。正如预期的那样，在年长的小鼠组中发现了聚集物载荷显著增加。C:用2B7和MWl抗体对，特异性检测可溶性Htt。通过超速离心将R6/2脑勻浆物分离成可溶性物质和不可溶性物质。沉淀物中回收了通过AGERA测量的不可溶性Htt 聚集物的主要部分。相反，时间分辨FRET主要显示上清液中的可溶性Htt。D 对R6/2组织中Htt的检测。相比于野生型同胞，来自6周龄R6/2小鼠的皮层和肌肉样品含有显著量 Htt (n = 3)。相比于野生型小鼠(n = 4)，还在9-12周龄R6/2小鼠(n = 9)的血浆和CSF 中检测出突变型Htt。E 以内源性水平表达具有140Q的Htt的敲入Hdhl40小鼠(n = 3) 的不同脑区中全长Htt的检测。野生型同胞(n = 3)用作阴性对照。所有数据为平均值加标准差。图11 对小鼠脑中Htt聚集物的分析A 4周龄和12周龄的R6/2或野生型(WT)小鼠的脑样品的AGERA印迹的代表性实例。Htt聚集物载荷的年龄依赖性增加在R6A小鼠脑中是明显的。B:在通过超速离心分离为可溶性物质(上清液)和不可溶性物质(沉淀)之前(开始)和之后，4周龄和12 周龄动物的R6/2脑勻浆物用AGERA分析。聚集物有效地回收在不可溶性级份中。在上清液级份中未检测出聚集物。图12 对人组织中Htt的检测A 用2Β7和丽1通过时间分辨FRET对三个死后的人HD皮质勻浆物(HD)进行了分析，显示出与三个对照(HV)相比更高的polyQ-依赖性Htt信号；技术性一式三份加标准差(HV与HD之间ρ < 0. 001)。B 在分离自HD(n = 5)以及对照(HV，η = 4)个体的速冻人全血样品、用EDTA处理的红细胞和血沉棕黄层中，用时间分辨FRET测量(技术性一式三份)的ζ-转换的Htt相对量的箱式图。箱显示50%值的分布范围，直条显示所有值的分布，水平条显示中位值。图13 =A 时间分辨Fiirster共振能量转移的原理。铕-穴状化合物在320nm的激发导致D2-荧光团在665nm处的接近度依赖性的、时间延迟的FRET发射。B =Tb2+-穴状化合物的发射不同于Eu3+-穴状化合物，因此除红色D2受体之外，还可以使用绿色受体 (Alexa488,荧光素)。C 我们将两种捕获抗体A β 42 (抗相应加尾的野生型25Q-亨廷顿蛋白)和Αβ40(针对突变型72Q-亨廷顿蛋白)点在4点/孔板上。当分析抗_Αβ42点时， 仅有这样的样品产生信号该样品含有诱导表达了野生型25Q-亨廷顿蛋白的细胞的裂解物。相反，含有诱导表达了突变型72Q-亨廷顿蛋白的细胞的裂解物的样品在抗-A β 40点中呈阳性。用生物素化Novl抗体检测与板结合的Htt。图14 使用测定试验分析了一大组来自健康志愿者和HD患者的血沉棕黄层PBMC 样品(由Sarah Tabrizi友情提供)100位个体，每位个体两个时间点。在此项双盲研究中，当应用通过早期实验(使用Meven Hersch提供的样品)建立的信号阈值时，我们正确地将44个样品中的43个分配至属于健康对照。因此，该测定试验可以异常良好地使用血液级份作为起始材料将健康者与HD分开。发明详述本发明涉及与疾病相关的POLYQ蛋白的生物测定试验，以及其作为诊断工具用于监测疾病进展或用于监测疾病的治疗效力的用途。为了可以更容易地理解本发明，首先定义了某些术语。其它定义在整个详述中给出。
术语“突变POLYQ蛋白”或“P0LYQ蛋白，，是指含有多谷氨酰胺扩展的与疾病发展有关的POLYQ蛋白的形式。例如“突变POLYQ亨廷顿蛋白”是指具有超过36个谷氨酰胺的多谷氨酰胺扩展且与亨廷顿病有关的亨廷顿蛋白。术语“单步骤测定试验”是指其中无需分离或洗涤且通常可以在单个生物化学操作后运行的免疫测定。术语“翻译后修饰”是指表达蛋白的细胞修饰，例如蛋白水解断裂、磷酸化、乙酰化、泛素化、SUMO化或多肽主链的其它共价修饰。本发明的生物测定试验可以用于的多聚谷氨酰胺疾病在下表中列出。
权利要求
1.用于测量生物样品中可溶性形式的突变POLYQ蛋白的量的免疫测定试验的用途，其中该蛋白质选自亨廷顿蛋白、雄激素受体、萎缩蛋白1、共济失调蛋白1、共济失调蛋白2、共济失调蛋白3、共济失调蛋白7、TATA盒结合蛋白或α Ia电压依赖性钙通道亚基；作为诊断工具，用于监测治疗与该蛋白质的突变POLYQ形式有关的疾病的效力或用于监测疾病进展。
2.根据权利要求1的用途，其中在所述免疫测定试验中还测量样品中相应野生型蛋白的绝对量或相对量。
3.根据权利要求1或2的用途，其中还测量所述突变蛋白的翻译后修饰的程度，例如表达蛋白的细胞修饰，例如通过例如蛋白水解断裂的片段化、磷酸化、乙酰化、泛素化、SUMO 化、脂质修饰或多肽主链的其它共价修饰。
4.根据权利要求1至3中任一项的用途，其中所述免疫测定试验是单步骤测定试验，即其中不需要分离或洗涤且可优选地在单个生物化学操作后运行的免疫测定试验。
5.根据权利要求1至4中任一项的用途，其中所述免疫测定试验检测技术以时间分辨 Fiirster共振能量转移或电化学发光为基础。
6.根据权利要求5的用途，其中所述免疫测定试验检测技术是时间分辨Fiirster共振能量转移。
7.根据权利要求5的用途，其中所述免疫测定试验包括下列步骤a)将所述生物样品与用镧系元素离子穴状化合物(例如铕或铽穴状化合物)标记的第一抗体和用适于检测镧系元素发射的信号的荧光团标记的第二抗体接触，其中抗体之一对突变型蛋白的PolyQ部分具有特异性，而另一个抗体对该突变型亨廷顿蛋白蛋白的不同部分具有特异性，和b)通过用时间分辨FSrster共振能量转移测量来自荧光团的荧光而定量样品中突变型POLYQ蛋白的量。
8.根据权利要求5的用途，其中通过另外将所述样品与对所述蛋白质的野生型形式具有特异性且用适于检测镧系元素发射的信号的不同荧光团标记的第三抗体接触，还在所述生物样品中测量该样品中的相应野生型蛋白的(相对)量。
9.根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述polyQ-蛋白是polyQ-亨廷顿蛋白。
10.根据前述权利要求中任一项的用途，其中所述生物样品源自脑、血、肌肉或心，或源自外周组织例如皮肤或毛发。
11.用于测量生物样品中可溶性形式的突变(扩展POlyQ)蛋白质的量的免疫测定试验，其中所述蛋白质选自亨廷顿蛋白、雄激素受体、萎缩蛋白1、共济失调蛋白1、共济失调蛋白2、共济失调蛋白3、共济失调蛋白7、TATA盒结合蛋白或α Ia电压依赖性钙通道亚基。
12.根据权利要求11的免疫测定试验，其中在所述免疫测定试验中还测量所述样品中相应野生型蛋白的绝对量或相对量。
13.根据权利要求11或12的免疫测定试验，其中还测量所述突变蛋白的翻译后修饰的程度，例如表达蛋白的细胞修饰，例如通过例如蛋白水解断裂的片段化、磷酸化、乙酰化、泛素化、SUMO化、脂质修饰或多肽主链的其它共价修饰。
14.根据权利要求11至13中任一项的免疫测定试验，其中所述免疫测定试验是单步骤测定试验，即其中不需要分离或洗涤且可优选地在单个生物化学操作后运行的免疫测定试
15.根据权利要求11至14中任一项的免疫测定试验，其中所述免疫测定试验检测技术以时间分辨Fiirster共振能量转移或电化学发光为基础。
16.根据权利要求15的免疫测定试验，其中所述免疫测定试验检测技术是时间分辨 Fiirster共振能量转移。
17.根据权利要求15的免疫测定试验，其中所述免疫测定试验包括下列步骤a)将所述生物样品与用镧系元素离子穴状化合物(例如铕或铽穴状化合物)标记的第一抗体和用适于检测镧系元素发射的信号的荧光团标记的第二抗体接触，其中抗体之一对突变型蛋白的POlyQ部分具有特异性，而另一个抗体对该突变型亨廷顿蛋白蛋白的不同部分具有特异性，和b)通过用时间分辨FSrster共振能量转移测量来自荧光团的荧光而定量样品中突变型POLYQ蛋白的量。
18.根据权利要求17的免疫测定试验，其中通过另外将所述样品与对所述蛋白质的野生型形式具有特异性且用适于检测镧系元素发射的信号的不同荧光团标记的第三抗体接触，在所述生物样品中还测量该样品中相应野生型蛋白的(相对)量。
19.根据前述权利要求中任一项的免疫测定试验，其中所述polyQ-蛋白是polyQ-亨廷顿蛋白。
20.根据前述权利要求中任一项的免疫测定试验，其中所述生物样品源自脑、血、肌肉或心，或源自外周组织例如皮肤或毛发。
全文摘要
本发明涉及与疾病相关的突变POLYQ蛋白的生物测定试验，以及其作为诊断工具用于监测疾病进展或用于监测治疗疾病的效力的用途。在优选的实施方案中，该polyQ-蛋白是polyQ-亨廷顿蛋白。
文档编号G01N33/68GK102171573SQ200980139060
公开日2011年8月31日 申请日期2009年8月3日 优先权日2008年8月4日
发明者P·帕加内蒂 申请人:诺瓦提斯公司