专利名称：一种菝葜皂苷元含量的elisa测定方法
技术领域：
本发明涉及一种检测菝葜皂苷元(Sarsasapogenin，简写SAR)含量的方法，具体 说来就是用酶联免疫的分析方法定量检测药材及相关样品中SAR的含量，此方法特别适合 于大批量样本中SAR含量的快速检测。属于酶联免疫领域的一种新的快速检测方法。
背景技术：
知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎。SAR为知 母中的代表性留体皂苷元，具有多种药理活性，能提高记忆，抗抑郁，抗肿瘤。由于SAR无紫外吸收，目前对其的检测方法主要是比色法、薄层扫描法和高效液 相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)。这些方法灵敏度低，步骤繁琐耗时，制约了该微 量成份的快速分析检测，也制约了其在体内作用机理方面的深入研究。比色法检测易受糖 类等物质的干扰，误差大，只能测定能被显色剂显色的总皂苷类成分，无法用于药材鉴定、 中药复方及生物样品中该类化合物的测定；HPLC-ELSD对皂苷类的检测前期处理程序复 杂，灵敏度较低，且需要样品与杂质的分离，难以满足该类成分吸收、代谢等研究；高效液相 色谱-紫外检测器(HPLC-UV)方法采用末端吸收测定，干扰大，不易获得准确结果。因而目 前的检测方法难以满足该类成分在药材、复方及体内过程中快速、微量特异性检测的需求， 严重制约了含此活性成分药物的质量控制、作用机理等方面的研究，至今国内外对这类化 合物吸收、代谢、分布及其作用机制研究鲜有报道。ELISA这种新的分析方法，具有灵敏、快速、样品前处理简单，利于批量测定的优 点。这种新的分析方法，不需要高效液相色谱、液质联用等仪器分析中对样品前处理的要 求，也不需高效液相分析中样品与杂质分离。因而它的优势是比HPLC-ELSD更加灵敏，省时 方便，尤其是在大批量样品的分析中。建立SAR快速、微量特异性检测方法，对于含有该活 性成分中药及复方质量控制和临床用药监测、探索SAR作用机理及研究化学成分清晰、作 用机理明确的现代中药具有重要的理论和现实意义。

发明内容
本发明要解决技术问题是为了克服现有分析技术的不足，提供一种灵敏、快速、 有效的检出SAR的方法。本发明所解决的问题1.知母药材中SAR含量的ELISA检测方法。2.药材中SAR的含量测定及生物样本中微量测定。3.现有分析方法灵敏度低，步骤繁琐的问题。实现本目的的方法载体蛋白与SAR偶联形成的完全抗原用于免疫动物，另一种 载体蛋白与SAR偶联形成的完全抗原用作固相抗原间接竞争酶联免疫法测定药材中SAR的含量。本发明SAR含量的ELISA测定方法，其特征在于主要步骤如下
第一步、琥珀酸酐和SAR反应使SAR羧基化；第二步、采用活泼酯法将SAR琥珀酰衍生物与N，N' _ 二环己基碳酰亚胺，N-羟基 丁二酰亚胺，在N，N-二甲基甲酰胺中搅拌反应2-8小时，最后与10-50mg载体蛋白搅拌反 应4-48小时，生成免疫抗原；第三步、用免疫抗原免疫动物，获得SAR的多克隆抗体；第四步、检测抗体效价；第五步、建立间接竞争ELISA分析方法，用此方法检测中药材及相关样品中SAR的含量。其中，第一步包括以下步骤A. SAR 10-200mg，琥珀酸酐 0. l_4g，吡啶 l_2mL 60_100°C水浴反应 4-10 小时；B.反应后产物经过溶剂萃取，凝胶柱纯化，得到白色粉末。所述第二步中，载体蛋白为牛血清白蛋白，羧基化后的SAR与牛血清白蛋白偶联 产物作为免疫抗原。所述第二步中，载体蛋白为卵清白蛋白，羧基化后的SAR与卵清白蛋白偶联产物 作为检测抗原。本发明采用琥珀酸酐法将SAR衍生化成SAR琥珀酰酯，再采用活泼酯法与牛血清 白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)分别偶联成完全抗原后免疫新西兰大耳兔，产生多克隆 抗体。以SAR偶联OVA的作为包被抗原，SAR偶联BSA的作为免疫抗原，间接ELISA法检 测抗体的效价，间接竞争ELISA方法作为检测样品中SAR含量的方法。此ELISA分析方法 检测的线性范围为20 1311ng/mL。与其它结构类似的甾体皂苷元有一定程度的交叉反 应。SAR加样回收实验表明重复性好、准确度高、达到生物分析的要求。且此测定含量方法 与HPLC-ELSD具有良好的相关性。在本发明的第一方面，提供一种SAR完全抗原的合成方法。在本发明的第二方面，提供一种免疫球蛋白，其特征在于，是一种能特异性结合 SAR的多克隆抗体，此免疫球蛋白来源于兔。在本发明的第三方面，提供了一种基于此多克隆抗体的ELISA检测方法。在本发明的第四方面，提供了基于此SAR多克隆抗体的ELISA检测方法的用途，它 被应用于含有SAR的样品如中药知母、大鼠血浆等样品中SAR含量的测定。在本发明的基础上，可制备成皂苷元ELISA检测试剂盒，用于大批量样本的快速、 简便的检测。本发明具有以下优点1.检测的灵敏度高，所需样品量少。2.检测过程简化，检测时间短，尤其适合大批量样品的同时检测。3.仪器设备成本低，只需酶标仪，因此投入少、成本低。本发明可为质检部门，加工生产企业提供大批量检测药材中SAR含量的方法。


图1是大鼠灌胃SAR后血药浓度随时间变化曲线
具体实施例方式材料试剂琥珀酸酐(国药集团化学试剂有限公司)，N，N' - 二环己基碳酰亚胺(简 称DCC)、N-羟基丁二酰亚胺(简称NHS)、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂均为Sigma产品， SAR(纯度> 98%，购自芜湖甙尔塔医药科技公司)，HRP标记羊抗兔IgG购自北京中杉金 桥，TMB为Amresco产品。甲醇为色谱纯，N, N- 二甲基甲酰胺(简称DMF)购自江苏永华精 细化学品有限公司。动物新西兰大耳兔购自南通大学实验动物中心，SD大鼠购自扬州大学比较医学 中心。菝葜皂苷元酶联免疫分析方法的建立过程和检测过程如下实施例1抗SAR多克隆抗体的制备1.完全抗原的合成(1) SAR与BSA偶联产物的制备(用于免疫动物)SAR 50mg, 丁二酸酐lg，lml吡啶沸水浴回流8小时，产物用氯仿溶解，水萃取3次 (每次25mL)，收集合并氯仿层。再用活泼酯法将SAR琥珀酰衍生物(SAR-HS)分别和BSA 和OVA偶联。具体方法为:SAR-HS 12mg, DCC 19mg, NHS 13mg, lml的DMF中室温磁力搅拌 反应4小时。此反应产物加到含有30mgBSA的lOmlPBS中，室温磁力搅拌反应过夜。反应 后的产物经双蒸水4度透析72小时，冻干即得SAR-HS-BSA的复合物。(2) SAR与OVA偶联产物的制备(用作ELISA检测抗原)SAR 50mg, 丁二酸酐lg，lml吡啶沸水浴回流8小时，产物用氯仿溶解，水萃取3次 (每次25mL)，收集合并氯仿层。再用活泼酯法将SAR-HS分别和BSA和OVA偶联。具体方 法为SAR-HS 12mg, DCC 19mg, NHS 13mg, lml的DMF中室温磁力搅拌反应4小时。此反应 产物加到含有23mg0VA的lOmlPBS中，室温磁力搅拌反应过夜。反应后的产物经双蒸水4°C 透析72小时，冻干即得SAR-HS-BSA的复合物。2.多克隆抗体的制备新西兰大耳兔，皮下多点注射lmg SAR-HS-BSA和弗氏完全佐剂混合后的乳剂。此 后的加强免疫剂量同上，注射SAR-HS-BSA和弗氏不完全佐剂混合后的乳剂。加强免疫后的 第10天取血测效价。6次免疫后，收集兔血清。3.抗体效价的检测采用间接ELISA方法1)包被抗原包被酶联板，4°C过夜。2)弃去板中液体，PBST洗3遍后，封闭液封闭1小时。3)弃去板中液体，PBST洗3遍后，加入从1 1000开始倍比稀释的抗血清，37度 反应2小时。4)弃去板中液体，PBST洗3遍后，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG，37度反应1小 时。5)弃去板中液体，PBST洗3遍后，加底物溶液，37度避光显色20分钟。6) 2M H2S04终止反应。酶标仪450nm读数。根据抗体效价判定原则阳性(P)，阴性(N)，P/N > 2. 1，P-N > 0. 2，6免后抗体效价达到32000。实施例2间接竞争ELISA分析方法的建立1. ELISA检测线性范围的确定1)包被抗原包被酶联板，4°C过夜。2)弃去板中液体，PBST洗3遍后，封闭液封闭1小时。3)弃去板中液体，PBST洗3遍后，同时加入SAR标准品配成的5000ng/mL, lOOOng/ mL，500ng/mL, lOOng/mL, 50ng/mL, lOng/mL, 5ng/mL 的各浓度梯度溶液和 SAR 多克隆抗体， 37度反应2小时。4)弃去板中液体，PBST洗3遍后，加入HRP标记的羊抗兔IgG，37度反应1小时。5)弃去板中液体，PBST洗3遍后，加底物溶液，37度避光显色20分钟。6) 2M H2S04终止反应。酶标仪450nm读数。加入竞争药物SAR时的吸光值为B，不加SAR的吸光值为By B/B0为纵坐标，竞争 药物浓度的对数值为横坐标，得到竞争抑制曲线。以lnGB/B^/d-B/Bj)为纵坐标，竞争 药物浓度的对数值为横坐标作图，得到直线方程y = -1. 5337x+3. 3954，在20 1311ng/ mL范围内线性良好，R2 = 0. 9868。2.多克隆抗体特异性分析按上述3中的方法，将第3步反应的各浓度的SAR标准品替换成其它结构类似的 标准品，其它步骤同上。抗体的交叉反应测定结果如下表1菝葜皂苷元多克隆抗体交叉反应实验 3. ELISA检测方法与HPLC-ELSD检测方法的相关性色谱条件采用Diamonsil 柱(250X4. 6mm，5ii) ；Shimadzu LC-10A型高效液相色 谱仪；Alltech 2000ES型蒸发光检测器。甲醇-水(95 5)为流动相；流速为l.OmL/min;漂移管温度63 °C ；载气流 速1. 7L/min。对照品溶液稀释成浓度为 100 u g/mL, 150 u g/mL, 200 u g/mL, 250 u g/mL 300 u g/mL, 350 u g/mL的溶液，用HPLC-ELSD测定，此各浓度溶液稀释500倍后，用ELISA测 定，考察ELSD测定值和ELISA测定值之间的相关性。各浓度梯度样品ELISA测定结果与ELSD的测定结果基本一致，具有相关性，相关性方程为 y = 1. 0108x-ll. 711，R2 = 0. 9853。实施例3中药知母中SAR含量的ELISA测定1.知母药材处理方法取知母药材，粉碎，过60目筛，精密称取药材粉末0. Sg，置具塞锥形瓶中，加入甲 醇25mL，静置过夜，超声处理40min，过滤，精密量取续滤液10mL，加入10%盐酸加热回流2 小时，提取液加入40% NaOH中和。氯仿萃取两次，每次30mL。合并氯仿层，回收溶剂，残渣 用甲醇溶解定容至2mL。2.重复性试验精密称取知母药材粉末0. 5g，平行6份，按知母药材处理方法制备供试品溶液，间 接竞争ELISA法测定含量，计算6份药材含量之间的RSD值。同一来源知母样品6份，测得 SAR 含量为 0. 6%, RSD 值为 3. 7%03.加样回收试验精密称取知母药材粉末0. 25g，平行9份，置具塞锥形瓶中，精密加入SAR标准品 0. 9mg、l. 5mg、2. lmg,制备供试品溶液，间接竞争ELISA方法测定含量，计算回收率和日内 精密度。同时精密称取知母药材粉末0.25g，连续3天精密加入0.9mg SAR，测定含量，计算 日间变异系数。表2ELISA测定SAR加样回收率(n = 3) a SAR测量值为3份样品的平均值士 SD ；b相对标准偏差；c加样回收率计算公式回收率(％ )=(测定值-1.5)/添加量X 1004.知母药材中SAR含量测定不同产地知母药材样品处理方法如上所述，各样品溶液用ELISA方法和ELSD方法 同时测定。间接竞争ELISA测定含量步骤如下1)包被抗原包被酶联板，4°C过夜。2)弃去板中液体，PBST洗3遍后，封闭液封闭1小时。3)弃去板中液体，PBST洗3遍后，同时加入SAR标准品配成的标曲各浓度梯度溶 液，适当稀释的待测样品和SAR多克隆抗体，37度反应2小时。4)弃去板中液体，PBST洗3遍后，加入HRP标记的羊抗兔IgG，37度反应1小时。5)弃去板中液体，PBST洗3遍后，加底物溶液，37度避光显色20分钟。6) 2M H2S04终止反应。酶标仪450nm读数。每份样品检测3次取平均值，根据样品稀释倍数和0D值，由标准曲线计算出样品 的含量。每块96孔板，可同时检测20份以上的样品。测定结果如下表
表3ELISA和HPLC-ELSD方法测定不同产地知母药材中SAR含量(又士SD) 实施例4大鼠血浆中SAR含量测定1.血浆标曲的建立10 PL不同浓度的SAR标准品溶液加入到大鼠空白血清中，涡旋仪上涡旋混合 20s,配成 5000ng/mL，1000ng/mL, 500ng/mL, 100ng/mL, 50ng/mL, lOng/mL 的血浆标曲溶液。 血浆标曲的ELISA建立步骤1)包被抗原包被酶联板，4°C过夜。2)弃去板中液体，PBST洗3遍后，封闭液封闭1小时。3)弃去板中液体，PBST洗3遍后，同时加入SAR标准品配成的血浆标曲各浓度梯 度溶液和SAR多克隆抗体，37度反应2小时。4)弃去板中液体，PBST洗3遍后，加入HRP标记的羊抗兔IgG，37度反应1小时。5)弃去板中液体，PBST洗3遍后，加底物溶液，37度避光显色20分钟。6) 2M H2S04终止反应。酶标仪450nm读数。以血浆中加入竞争药物SAR时的吸光值为B，不加SAR的吸光值为By B/B0为纵 坐标，竞争药物浓度的对数值为横坐标，得到竞争抑制曲线。以lnGB/B^/d-B/Bj)为 纵坐标，竞争药物浓度的对数值为横坐标作图，得到直线方程y = -1. 1097x+1.8125，在 2. 4-763ng/mL 范围内线性良好，R2 = 0. 9879。2.血浆加样回收实验200iiL空白大鼠血浆中，添加lOiiL的SAR标准品，使配成终浓度为500ng/mL， 100ng/mL，10ng/mL的血浆样品溶液。采用间接竞争ELISA方法测定。此各浓度样品连续3 天测定。计算日内日间精密度以及回收率。结果如表4所示表4ELISA测定大鼠血浆中SAR含量的精密度和准确度 a测定值=平均值士 SD(n = 6)b回收率=SAR测定值/SAR添加量X100%c变异系数3.大鼠灌胃SAR后血浆中SAR含量测定SD大鼠6只，提前12小时禁食，口服灌胃SAR100mg/kg,分别于给药后0.5,1,2,4, 6，8，10，12，24，48，72h取血。血浆样本8000rpm离心10分钟，上层血清_20°C保存。采用 上述间接竞争ELISA方法测定血药浓度，计算的药代动力学参数如表5所示，血药浓度随时 间变化见附图。表5大鼠灌胃SAR100mg/kg后药代动力学参数
权利要求
一种菝葜皂苷元含量的酶联免疫(ELISA)测定方法，其特征在于主要步骤如下第一步、琥珀酸酐和菝葜皂苷元反应使菝葜皂苷元羧基化；第二步、采用活泼酯法将菝葜皂苷元琥珀酰衍生物与N，N′-二环己基碳酰亚胺，N-羟基丁二酰亚胺，在N，N-二甲基甲酰胺中搅拌反应2-8小时，最后与10-50mg载体蛋白搅拌反应4-48小时，生成免疫抗原；第三步、用免疫抗原免疫动物，获得抗菝葜皂苷元的多克隆抗体；第四步、检测抗体效价；第五步、建立间接竞争ELISA分析方法，用此方法检测中药材及相关样品中菝葜皂苷元的含量。
2.根据权利要求1所述的菝葜皂苷元含量的ELISA测定方法，其特征是所述第一步 包括以下步骤A.菝葜皂苷元10-200mg，琥珀酸酐0.l_4g，吡啶l_2mL，60_100°C水浴反应4_10小时；B.反应后产物经过溶剂萃取，凝胶柱纯化，得到白色粉末。
3.根据权利要求2所述的菝葜皂苷元含量的ELISA测定方法，其特征是所述第二步 中，载体蛋白为牛血清白蛋白，羧基化后的菝葜皂苷元与牛血清白蛋白偶联产物作为免疫 抗原。
4.根据权利要求2所述的菝葜皂苷元含量的ELISA测定方法，其特征是所述第二步 中，载体蛋白为卵清白蛋白，羧基化后的菝葜皂苷元与卵清白蛋白偶联产物作为检测抗原。
5.根据权利要求1所述的菝葜皂苷元含量的ELISA测定方法，其特征是其检测过程 是包被酶标板，封闭酶标板，酶标板中加入待测药物和抗体，加入酶标二抗，底物显色，终止 反应测定吸光值包含有能特异性识别菝葜皂苷元的免疫球蛋白。
6.根据权利要求5所述的菝葜皂苷元含量的ELISA测定方法，其特征是所述免疫球 蛋白来自兔。
7.根据权利要求1所述的菝葜皂苷元含量的ELISA测定方法，其特征是第五步所述 的分析方法为间接竞争ELISA。
全文摘要
本发明公开了检测菝葜皂苷元含量的酶联免疫分析方法，涉及菝葜皂苷元抗体的制备，酶联免疫分析方法的建立及其在含有菝葜皂苷元中药材或相关样品含量测定中的应用。本发明用与载体蛋白偶联的菝葜皂苷元作为完全抗原，获得针对抗菝葜皂苷元的抗体，并且用于药材及相关样品中菝葜皂苷元含量的测定。目的是提供一种新的菝葜皂苷元检测分析方法。本分析方法灵敏度高，样品前处理简单，测定过程简便，快速，适合于研究单位，检验部门，贸易大批量样品分析检测的需要。
文档编号G01N33/566GK101852801SQ20101017182
公开日2010年10月6日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者余伯阳, 刘吉华, 王晶 申请人:中国药科大学