专利名称：其上面固定了生理活性物质的支持物及其制备方法、固定的生理活性物质、分析样品成分 ...的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种其上固定了生理活性物质的支持物、一种制备该支持物的方法、一种固定于支持物的生理活性物质、一种利用该支持物分析样品成分的方法、以及一种带有该支持物的用于分析样品成分的试剂盒。
本文所称的生理活性物质是指对生物体具有特定作用的物质，或者生物蛋白或肽等。
背景技术：
大多数生理活性物质例如酶和抗体对特定物质具有高度的选择性，并且基于其这种特性，它们被用来精确地检测特定的生物成分。特别地，在免疫检测中常用免疫分析，并且它包含将一种与目的物质反应的抗体固定在合适的固相(支持物)上，然后使其接触标本并与可以特异性结合于目的物质的标记抗体进行反应。
然而，将生理活性物质例如蛋白或糖牢固并有效地固定于支持物上极为困难，因为蛋白和糖具有不同的表面电荷。
目前为止，Biotechniques，27，778-788(1999)；Biosensors &Bioelectronics，Vol.13，Nos.3-4，pp.407-415，1998；Clin.Chem.，449，2036-2043(1998)；Clin.Chem，Acta，(1990)194(1)；Anal.Chem.，1999，71，3845-3852；J.Immunol.Methods，136(1991)，239-246；Anal.Biochem.，278，123-131(2000)；J.Immunol.Methods，99(1987)107-112；Anal.Biochem.，250，203-211(1997)；Science，Vol.289，1760-1763等报道了将生理活性物质例如蛋白固定于支持物例如玻璃载片或聚丙烯酰胺凝胶上的方法、以及利用这种固定的支持物使样品中的抗原与支持物上面的抗体结合，从而高通量地检测抗原的方法。
然而，按照这些报道中的方法，不可能高密度地在支持物上固定抗体，并且该方法的问题在于，虽然需要大量的抗体，但是其固定效率低。
为鉴定过敏反应的诱因(过敏原)，实践当中使用的是检测IgE的方法。其利用了在过敏反应表达过程中与过敏反应的诱因过敏原特异性结合的IgE的产生。具体的，将某病例的血清IgE同过敏原反应，并用标记的抗-IgE抗体检测之。
具体已知的是一种包括将样品中的IgE同固定于一个玻璃载片上的抗人IgE抗体反应，然后使其与酶标抗人IgE抗体反应，以产生抗人IgE抗体-IgE-酶标抗人IgE抗体复合体，并且检测该复合体中的标记的方法(Methods in Enzymology，Vol.184，501-507，1990)；一种包括结合过敏原到滤纸上、与血清样品反应、并由Cypridina来源的萤光素酶标记的抗IgE抗体检测它的方法(JP-A 5-113443)；一种利用亲合柱的方法(JP-T 5-508220-这里所用的术语“JP-T”是指PCT专利申请的公开了的日文译文)；一种用双官能试剂固定抗IgE抗体于固相支持物例如聚苯乙烯板或玻璃纤维过滤器上的方法(JP-T8-509064)等。
然而，即便是这些报道中的方法，也仍然不可能高密度地在支持物上固定各种不同的过敏原或抗IgE抗体，而且该方法的问题仍在于，虽然需要大量的抗体，但是其固定效率低。
本发明是考虑了上述情形后作出的，并且其目的是提供一种固定了生理活性物质的支持物，上面固定的生理活性物质的密度高而且固定效率高，一种制备该固定支持物的方法，一种利用该固定载体有效地分析样品成分的方法，以及一种分析用试剂盒。
发明公开我们(本发明人)进行了不懈的研究以实现上面的目的，并且作为结果，发现当表面形成有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物被用来在其上固定生理活性物质时，则有可能以高密度配位官能团到支持物上，因而生理活性物质的官能团可通过与该支持物上的官能团结合而被固定于该支持物上，并且，作为结果，固定效率得以提高，并且利用该固定了生理活性物质的支持物分析样品中成分的效率也因此得以提升。在这一发现的基础上，我们完成了本发明。
具体地，权利要求1的发明提供了一种固定了生理活性物质的支持物，其表面形成有碳或金属或半金属碳化合物层，并且该层上固定有生理活性物质。
为了将生理活性物质固定于支持物表面，可使用任何本身已知的固定方法，例如物理吸附固定或化学结合固定。优选地，该物质通过碳或金属或半金属碳化合物层的官能团固定于支持物表面，如同权利要求2所述。更优选的，它是通过生理活性物质的官能团与碳或金属或半金属碳化合物层的官能团结合而固定于支持物表面，如同权利要求3所述。
在这种情况下，生理活性物质的官能团和/或碳或金属或半金属碳化合物层的官能团优选是选自由羟基、羧基、磺基(sulfo group)、氰基、硝基、硫醇基、氨基、氨基苯基以及环氧基组成的组中的一个或多个，如同权利要求4所述。
更优选的，生理活性物质是如权利要求5中的对生物体具有特定作用的物质，或者是生物蛋白或肽，更加优选的是如权利要求6中的抗原和/或抗体。尤其，生理活性物质特别优选的是选自由肿瘤标志、激素、激素干扰性化学制品、微生物来源的蛋白或肽或糖链抗原、受体、配体、过敏原、免疫球蛋白、凝集素、糖链、脂类、脂多糖以及这些物质的抗体组成的组中的一个或多个，如同权利要求7所述。
具体地，生理活性物质优选是选自由过敏原、免疫球蛋白以及这些物质的抗体组成的组中的一个或多个，如同权利要求8所述。
并且优选的是，碳或金属或半金属碳化合物层包含结晶碳和/或非结晶碳(非晶性 素)，如同权利要求9和10所述。更具体的，结晶碳优选是如权利要求11中的金刚石或金刚石样的碳，而非结晶碳优选是如权利要求12中的石墨或无定形炭(非晶性カ一ボン)。其中，更优选的是结晶碳，而且更加优选的是金刚石。
权利要求13的发明提供了一种制备固定了生理活性物质的支持物的方法，其包含使生理活性物质同其表面形成有带官能团的碳或金属或半金属碳化合物层的支持物接触。
更具体的，将官能团引入其上形成有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物中，然后同生理活性物质接触，如同权利要求14所述。
在这种情况下，待引入支持物表面的官能团是选自由羟基、羧基、磺基、氰基、硝基、硫醇基、氨基、氨基苯基以及环氧基组成的组中的一个或多个，如同权利要求15所述。
权利要求16的发明提供了一种固定于其上形成有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物上的生理活性物质。
权利要求17的发明提供了一种分析样品成分的方法，其中利用的是权利要求1至12任何一项的固定了生理活性物质的支持物。
更具体的，固定了生理活性物质的支持物同含有待分析成分的样品进行接触，并对所生成的生理活性物质与该成分的复合体予以分析，如同权利要求17所述。
优选的，固定于支持物表面的生理活性物质是任何的抗原或抗体，而所述成分是该生理活性物质的抗原或抗体，如同权利要求19所述；更优选的，抗原或抗体是选自由肿瘤标志、激素、激素干扰化学制品、微生物来源的蛋白或肽或糖链抗原、受体、配体、过敏原、免疫球蛋白、凝集素、糖链、脂类、脂多糖以及这些物质的抗体组成的组中的一个或多个，如同权利要求20所述。尤其，抗原或抗体更优选是选自由过敏原、免疫球蛋白、凝集素以及这些物质的抗体组成的组中的一个或多个，如同权利要求21所述。
权利要求22的发明提供了一种分析成分的试剂盒，其包含权利要求1至11任何一项中的固定了生理活性物质的支持物。
附图的简单描述

图1显示了根据本发明分析方法的IgE分析图解图。图2显示了根据本发明的分析方法分析特定过敏原的IgE的图解图。图3显示了实施例1中的IgE分析结果图。图4显示了实施例2中过敏原分析结果图，其中利用的是阴性血清样本。图5显示了实施例2中过敏原分析结果图，其中利用的是日本柳杉花粉阳性血清样本。图6显示了实施例2中过敏原分析结果视图，其中利用的是螨阳性血清样本。
实施本发明的最佳方式首先描述的是权利要求1的发明，固定了生理活性物质的支持物。
本发明权利要求1中固定了生理活性物质的支持物的特征在于，它在其表面具有碳或金属或半金属碳化合物层，该层上固定有生理活性物质。
如同权利要求5，生理活性物质是对生物体具有特定作用的物质，或者是生物蛋白或多肽。具体的，它包括蛋白、蛋白衍生物、肽、肽衍生物、糖、糖衍生物、脂类、脂类衍生物等。更具体的，优选抗原和/或抗体，同权利要求6中一样，因为它通过如下文将要提到的抗原-抗体反应能够精确地分析生物成分。尤其的，特别优选的是选自由肿瘤标志(例如，蛋白抗原如AFP、PSA、CEA、PGI、PGH；糖链抗原如CA19-9、PIVKA-11、CA125)；激素(例如，PTH、T3、T4、TSH、胰岛素、C-肽、LH、FSH、催乳素)；激素干扰性化学制品(例如，三丁基锡、壬基酚、4-辛基酚、邻苯二甲酸二正丁酯、邻苯二甲酸二环己酯、二苯甲酮、八氯苯乙烯、邻苯二甲酸二-2-乙基己基酯)；微生物来源的蛋白或肽或糖链抗原(例如，来源于微生物的蛋白或肽或糖链抗原，所述微生物例如细菌如结核杆菌、肺炎链球菌、白喉球菌(diphtherococci)、脑膜炎球菌、淋球菌、葡萄球菌、链球菌、肠杆菌、大肠肝菌、幽门螺杆菌；病毒如流感病毒、腺病毒、肠道病毒、脊髓灰质炎病毒、EB病毒、HAV、HBV、HCV、HIV、HTLV；真菌如念珠菌、隐球菌(Cryptococcus)；钩端螺旋体；螺旋体如苍白密螺旋体(Treponema pallidum)；衣原体；支原体)；受体(例如，雌激素、TSH的受体)；配体(例如，雌激素、TSH)；过敏原(例如，导致诸如支气管哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎的呼吸过敏原，例如，食物过敏原-更具体的，来源于室尘的过敏原如螨，例如D.farinae、D.pteronyssinus；日本柳杉(Japanese cedar)、柏木、稗属草、豚草属草、梯牧草、黄花茅(vernal grass)、黑麦草属草的花粉；动物例如猫、狗、螃蟹；食品例如米、蛋清(albumen)；以及来源于真菌、昆虫、树木、药品和化学物质等的其他过敏原)；免疫球蛋白(例如，IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、以及他们的降解产物)；凝集素(例如，伴刀豆凝集素A、扁豆凝集素、菜豆凝集素、蔓陀罗凝集素、麦胚凝集素)；糖链(例如，ABO抗原)；脂类(例如，脂类如胆固醇；磷脂如心磷脂、磷脂酰胆碱；鞘磷脂类(sphingophospholipids)如鞘磷脂；脂蛋白)；脂多糖(例如，内毒素)；以及这些物质的抗体所组成的组中的一个或多个，如同权利要求7所述。
在任何一种受体、配体、凝集素、肿瘤标志(糖链)、蛋白或肽被用作为生理活性物质的情况下，目的成分不仅可通过抗原-抗体反应而且可通过受体-接纳体(acceptor)反应、凝集素-糖链反应或蛋白-肽链反应予以分析。
在本发明的固定了生理活性物质的支持物被用来分析样品成分的情况下，应当选择合适的与待分析成分特异性结合的生理活性物质。举例来说，当样品中的待分析成分为抗原时，则选择抗体作为生理活性物质固定于支持物；而当该成分为抗体时，则选择该抗体的抗原或者该抗体的抗体。
如果采用两种或多种不同的生理活性物质，则在一个操作中可同时分析一个样品中的两种或多种不同的成分，或者可以分析、或者检测或确定或鉴别未知的成分。
在待分析成分是任何一种受体、配体、凝集素、肿瘤标志(糖链)、蛋白或肽的情况下，则可以分别选择该受体的配体、该配体的受体、该凝集素的糖链、该肿瘤标志(糖链)的凝集素、针对该蛋白的肽链、或针对该肽的蛋白来作为生理活性物质。
在本发明中，当使用的固定了生理活性物质的支持物如同权利要求8一样是通过将选自由过敏原、免疫球蛋白(尤其是IgE)以及这些物质的抗体所组成的组中的一个或多个生理活性物质固定于支持物上而制备的时，则它能够使过敏反应相关的分析得以进行，而且这是本发明的一个优选的具体实施方式
。
具体的，举例来说，当选择过敏原的抗体作为生理活性物质时，则它能够使过敏原分析(样品中过敏原存在与否，以及过敏原的定量分析)得以进行；而当选择过敏原作为生理活性物质时，则它能够使过敏原、过敏反应原因的特定分析(关于存在或不存在针对何种过敏原的任何过敏反应，以及，如果有的话，关于该过敏反应的程度)得以进行。当选择抗IgE抗体作为生理活性物质时，则它能够使样品中的总IgE量的定量分析(关于该样品是否可导致何种程度的过敏反应的过敏性体质)得以进行。
在两种或多种不同的生理活性物质被固定于其上形成有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物表面的情况下，如上文所提到的，理想的做法是生理活性物质所被固定的位置通过在支持物表面给出合适的表示来阐明(例如，将位置予以编号)。
固定于其上形成有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物上的生理活性物质的量变化不等，取决于支持物的表面面积以及生理活性物质的特性和类型，因而不能不加区别地予以限定。举例来说，一般是从0.1ng到1mg，优选的是从1ng到100μg，以每单位面积(cm2)支持物上固定的生理活性物质的量来计。
在其上形成有碳或金属或半金属碳化合物层的本发明中所用的本发明支持物(这在下文中可被称为“具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物”)，是指该支持物表面涂敷有碳或涂敷有金属或半金属碳化合物。具体的，该碳或金属或半金属碳化合物包括碳例如结晶碳和非结晶碳，以及金属碳化合物和半金属碳化合物，如同权利要求9和10所述。
更具体的，结晶碳优选是如权利要求11中的金刚石或金刚石样碳；而非结晶碳优选是如权利要求12中的石墨或无定形炭。金属碳化合物优选是碳化钨或碳化钛；而半金属碳化合物优选是碳化硅。金刚石包括通过碳化作用制备的合成金刚石、在高压下制备的合成金刚石、以及天然金刚石。关于它的结构，结晶碳化合物可以具有单晶或多晶结构。
在这里这些碳、以及金属或半金属化合物的一个或多个可以单独或结合使用。优选的是结晶碳例如金刚石或金刚石样碳，及非结晶碳例如石墨或无定形炭，而更优选的是结晶碳例如金刚石或金刚石样碳，因为大量的生理活性物质可以与他们结合。
待涂敷这样的碳或金属或半金属碳化合物以得到具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的支持物可以是任何无机支持物，举例来说，各种陶瓷例如玻璃、硅胶、硅、或基本上是铁氧体(ferrite)、铁、镍或钴的合金；或者有机支持物例如纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯衍生物、以马来酐为基础的聚合物、尼龙、聚丙烯腈以及其他有机合成聚合物。支持物的形状不特别限定。举例来说，它可以是颗粒、板、棒、膜、盘或圆盘的任何形式。其中，玻璃因为不贵而且容易获得而是优选的。
支持物的大小变化不等，取决于其目的用途，因而不具体限定。举例来说，它可以至多100cm2，优选至多50cm2，更优选至多25cm2。
一般而言，具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的碳或金属或半金属碳化合物层的厚度优选至少是1nm。更优选的，它是从1.5nm到1000nm。如果该层的厚度小于1nm，则该涂敷层基本上不起作用；但如果大于1000nm，仅仅此实质涂敷层最表面可被利用，而且就制备该层的劳动力和费用而言它是无用的。
碳或金属或半金属碳化合物层可用任何已知的方法将碳或金属或半金属碳化合物涂敷在支持物上而形成。关于它的已知方法包括微波等离子体CVD、ECRCVD、IPC、DC喷镀(sputtering)、ECR喷镀、离子电镀、电弧离子电镀(arc ion-plating)、EB汽相淀积、电阻加热汽相淀积(resistance heating vapor deposition)、淤桨涂敷(slurry coating)(参见JP-A 10-95695、8-296044、8-165576、8-74056)。
具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的表面可以是光滑的或者有意的使其变粗糙。使其表面粗糙化增加支持物的表面积，从而有利于在其上固定大量的生理活性物质。
为了将生理活性物质固定于支持物表面，可使用任何本身已知的固定方法，举例来说，物理吸附固定或化学结合固定。优选的，物质通过碳或金属或半金属碳化合物层的官能团固定于支持物表面，如同权利要求2所述。更优选的，它是通过生理活性物质的官能团与碳或金属或半金属碳化合物层的官能团结合而固定于支持物表面，如同权利要求3所述。
碳或金属或半金属碳化合物层的官能团是任何一种或者直接地或者间接地通过间隔臂及类似的物质能够与生理活性物质结合的基团。具体地，它可以是选自由羟基、羧基、磺基、氰基、硝基、硫醇基、氨基、氨基苯基以及环氧基组成的组中的一个或多个，如同权利要求4所述。
类似的，生理活性物质的官能团也可以是任何一种或者直接地或者间接地通过间隔臂及类似的物质能够与碳或金属或半金属碳化合物层的官能团结合的基团。关于它的具体例子，参见上述有关碳或金属或半金属碳化合物层的官能团的例子。
将这样的官能团引入到具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物表面可通过对支持物表面进行化学修饰以活化它来完成。
关于具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物表面的化学修饰，官能团例如羟基、羧基、磺基、氰基、硝基、硫醇基、氨基、氨基苯基或环氧基可直接地结合于该支持物表面。不过，优选地，这样的官能团可以通过间隔臂例如至少具有1个碳原子，更优选1到12个碳原子，甚至更优选1到6个碳原子的烃基结合到上面去。举例来说，在官能团是羧基的情况下，则一元羧酸例如甲酸、乙酸或丙酸，或者二元羧酸例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸，或者多元羧酸例如偏苯三酸，优选草酸或琥珀酸，可以连接到碳或金属或半金属碳化合物层的表面。
为了将这样的官能团直接地或介由间隔臂引入到形成了碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的经化学修饰的表面，举例来说，可以使用用氧等离子体(oxygen plasma)氧化支持物表面紧接着用蒸汽(steam)处理的方法；或者用蒸汽处理支持物的表面，然后将其在氯气中暴露于UV射线下从而氯化支持物的表面，之后在碱性溶液(alkali solution)中将其水解以羟化它的方法；或者用氧等离子体氧化支持物表面，然后氯化它，并在碱性溶液中将其水解以水解它的方法；或者氢化支持物表面，然后将其在氯气中暴露于UV射线下从而氯化它，之后将其与羧酸钠在非水溶剂中反应的方法。
更具体的，举例来说，当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的表面要用羧基进行化学修饰时，希望的是具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的表面被氢化、氯化、氨化，然后再被羧化。确切的讲，希望的是支持物表面被氢化，然后通过在氯气中暴露于UV射线下使支持物上的碳材料表面得以氯化，之后通过在氨气中暴露于UV射线下使其氨化，然后与二羧酸缩合。
将生理活性物质固定于具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物上可用下文提及的方式基于支持物表面存在的官能团的类型完成(举例来说，参见Methods in Enzymology，Vol.44，pp.11-148(1976))。
(1)当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的官能团为氨基时当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的表面是用氨基进行化学修饰时，则生理活性物质的羧基可通过应用缩合试剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺或羧基二酰亚胺(carboxydiimide)，而结合到支持物表面的氨基上，藉此生理活性物质可被固定于支持物表面。
除此之外，支持物表面的氨基可通过与光气反应而被异氰酸化(isocyanated)，之后它可结合于生理活性物质来源的氨基，从而将生理活性物质固定于支持物的表面。进一步的，支持物表面的氨基可通过与硫光气反应而被异硫氰酸化，之后它可结合于生理活性物质来源的氨基，藉此生理活性物质同样可被固定于支持物表面。
更进一步的，支持物表面的氨基可与戊二醛反应，并且其可与生理活性物质来源的氨基或酚基反应，从而将生理活性物质固定于支持物的表面。
当生理活性物质为糖或糖衍生物例如糖蛋白时，则它可首先与高碘酸、然后再与支持物表面的氨基反应，之后它可用氢硼化钠或类似的物质还原，藉此该物质可被固定在支持物表面。
在另一方面，支持物表面的氨基可用具有马来酰亚胺基团的双官能间隔臂，例如m-马来酰亚胺苯甲酰N-羟基琥珀酰亚胺酯，或者用具有吡啶二硫基硫化基团(pyridyldithiosulfido group)的双官能间隔臂，例如4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-(2-吡啶二硫基)-甲苯，被马来酰亚胺化(maleimidated)或吡啶二硫基硫化(pyridyldithiosulfidated)，并且使所得到的马来酰亚胺化的或吡啶二硫基硫化的支持物同生理活性物质的硫醇基进行反应，从而将该物质固定于支持物的表面。
(2)当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的官能团为羧基时当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的表面是用羧基进行化学修饰时，则支持物表面的羧基可通过利用缩合试剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺或碳二亚胺，而与生理活性物质的氨基进行反应，藉此生理活性物质可被固定于支持物表面。除此之外，支持物表面的羧基可与亚硫酰氯反应形成羰基氯。所得到的羰基氯可与生理活性物质来源的氨基反应，从而将生理活性物质固定在支持物的表面。
进一步的，支持物表面的羧基可与加入其中的氢氯酸和甲醇反应，然后与也加入其中的肼反应以形成酰肼，并且所得到的酰肼用加入其中的一氮化三钠和氢氯酸酰基叠氮化(acylazidated)，以活化支持物表面，之后这样活化的支持物表面与生理活性物质来源的氨基、硫醇基或羟基反应，以将该物质固定在支持物的表面。
更进一步的，支持物表面的羧基被转化为它的酸酐，并且其(通过脱水缩合反应)与生理活性物质来源的氨基反应，从而将该物质固定在支持物的表面。
(3)当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的官能团为羟基时当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的表面是用羟基进行化学修饰时，则所涂敷的支持物表面的羟基与氰尿酰氯反应以形成三嗪基衍生物，生理活性物质来源的氨基与之结合，从而将该物质固定在支持物的表面。
除此之外，当支持物表面用羟基进行化学修饰时，则该支持物表面的羟基可被乙酰化并被溴化，并且接着其与NaI反应以用碘取代其中的溴，从而活化该支持物表面，之后其与生理活性物质来源的氨基、硫醇基或羟基反应，以便将该物质固定在支持物的表面。
进一步的，支持物表面的羟基可通过与溴化氰反应得以活化，而这可以共价键合到生理活性物质来源的氨基，以固定该物质于支持物的表面。
(4)当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的官能团为环氧基时当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的表面是用环氧基进行化学修饰时，则它可以与生理活性物质来源的羟基(例如来源于酪氨酸或丝氨酸的)、或氨基或硫醇基反应，从而将该物质固定在支持物的表面。
(5)当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的官能团为磺基时当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的表面是用磺基进行化学修饰时，则该支持物的磺基可与氯磺酸反应以形成磺酰氯(sulfone chloride)，然后其与生理活性物质来源的氨基、咪唑基、硫醇基或酚基反应，以便将该物质固定在支持物的表面。
(6)当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的官能团为氨基苯基时当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的表面是用氨基苯基进行化学修饰时，则该支持物的氨基苯基可用亚硫酸钠和氢氯酸活化，然后其与生理活性物质来源的氨基、硫醇基、酚基、咪唑基、或胍基以重氮偶联的方式进行反应，从而将该物质固定在支持物的表面。
(7)当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的官能团为氰基时当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的表面是用氰基进行化学修饰时，则该氰基可在酸催化剂存在的条件下水解，之后转化成为羧基。于是，支持物可按照与上文(2)中同样的方式予以处理，以在其上面固定生理活性物质。
(8)当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的官能团为硝基时当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的表面是用硝基进行化学修饰时，则该硝基可用还原剂例如氢化铝锂还原，之后转化为氨基。于是，支持物可按照与上文(1)中同样的方式予以处理，以在其上面固定生理活性物质。
(9)当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的官能团为硫醇基时当具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的表面是用硫醇基进行化学修饰时，则生理活性物质的氨基可用具有马来酰亚胺基团的双官能间隔臂，例如m-马来酰亚胺苯甲酰N-羟基琥珀酰亚胺酯，或者用具有吡啶二硫基硫化基团的双官能间隔臂，例如4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-(2-吡啶二硫基)-甲苯，被马来酰亚胺化或吡啶二硫基硫化，并且使所得到的马来酰亚胺化的或吡啶二硫基硫化的生理活性物质与支持物表面的硫醇基进行反应，从而将该物质固定于支持物的表面。
不同的双官能间隔臂例如双马来酰亚胺基己烷(bismaleimidohexane)或1，4-二-[3’-2’-吡啶二硫(丙酰胺基)]丁烷可用来替代上文提及的间隔臂，支持物表面的硫醇基可与生理活性物质的硫醇基反应，以便将该物质固定于支持物的表面。
上述的方法适用于待彼此结合的官能团的组合与那些方法中相同的任何其它情况，即使支持物的官能团和生理活性物质的官能团与那些方法中的相反。
优选地，本发明固定了生理活性物质的支持物，在其上形成的碳或金属或半金属碳化合物层表面固定有生理活性物质，用封闭剂封闭，更具体地，用白蛋白、球蛋白、酪蛋白、聚乙烯醇、表面活性剂、硅烷偶联剂、钛偶联剂、铝偶联剂及类似的物质进行封闭，以防止任何非特异性吸附对利用它进行分析的结果产生影响。本发明的支持物可以贮藏在各种不同的条件下，例如在干燥、冷冻或冻干之后或处于适当缓冲液中。
缓冲液可以是任何一种本领域通常使用的缓冲液，包括，举例来说，tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、佛罗那缓冲液、硼酸盐缓冲液、Good缓冲液等。这种类型的缓冲液可以含有任何白蛋白、球蛋白、水溶性明胶、聚乙二醇以及其他稳定剂、表面活性剂和糖类。
为制备本发明固定了生理活性物质的支持物，在其表面形成的碳或金属或半金属碳化合物层上固定有两种或多种不同的生理活性物质，可使用与上文同样的方法，除了在制备它的时候应用两种或多种合适的生理活性物质。
接下来描述本发明固定了生理活性物质的支持物的制备方法，在该支持物表面形成的碳或金属或半金属碳化合物层上固定有生理活性物质。
如权利要求13所述，生理活性物质同在其表面具有带官能团的碳或金属或半金属碳化合物层的支持物进行接触，并且该物质用如上的任何本身已知的固定方法固定于支持物表面，举例来说，用一种使支持物物理吸附该物质以将该物质固定在它上面的方法(物理结合方法)。用那种方式，固定了生理活性物质的目的支持物得以制备，其中它表面形成的碳或金属或半金属碳化合物层上具有固定的生理活性物质。
优选地，在表面形成有带官能团的碳或金属或半金属碳化合物层的支持物与生理活性物质接触，从而通过该物质与碳或金属或半金属碳化合物层的官能团的化学键合而将该物质固定于支持物的表面(化学键合法)，因为它能够使得支持物和生理活性物质之间更稳固地结合。特别地，更理想的是生理活性物质的官能团与碳或金属或半金属碳化合物层的官能团以化学方式键合，从而将该物质固定于支持物的表面。
对于本发明的制备方法，生理活性物质、碳或金属或半金属碳化合物及支持物以及碳或金属或半金属碳化合物层的形成方法的具体的实例和优选的实施方式可以与前文提到的那些相同。
进一步的，待引入碳或金属或半金属碳化合物层的官能团、以及待与前者结合的生理活性物质的官能团的类型和组合同样可以与前文提到的那些相同。生理活性物质的官能团以及碳或金属或半金属碳化合物层的官能团可以是任何能够或者直接地或者间接地介由间隔臂或类似的物质彼此间相互结合的官能团。具体的，他们可以是选自由羟基、羧基、磺基、氰基、硝基、硫醇基、氨基、氨基苯基以及环氧基所组成的组中的一个或多个，如同权利要求15。
具体地，本发明的制备方法可以例如按如下方式进行在物理结合方法中，举例来说，含生理活性物质的溶液被施加到具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物上，比如，以涂敷、滴加施用或者喷雾的方式，或者支持物浸泡在溶液中，或者利用商业上可得到的冲压(stamping)装置(例如，来自日本激光电子公司(NipponLaser Electronics)的产品)，从而使支持物与生理活性物质进行接触。这样处理后，支持物被予以干燥，从而使得生理活性物质通过物理吸附作用得以固定在它的表面。用此方式，固定了生理活性物质的目的支持物得以制备，其中它表面形成的碳或金属或半金属碳化合物层上固定有生理活性物质。
在化学键合(bonding)方法中，举例来说，含生理活性物质的溶液被施加到在它的表面带有官能团的、具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物上，比如，以涂敷、滴加施用或者喷雾的方式，或者支持物浸泡在溶液中，或者利用商业上可得到的冲压装置(例如，来自日本激光电子公司的产品)，从而使支持物与生理活性物质进行接触。于是，支持物的官能团与生理活性物质反应，具体的是与生理活性物质的官能团反应，以通过本身已知的两者之间的化学键合使两者化学结合，并从而将该生理活性物质固定于支持物的表面。用此方式，固定了生理活性物质的目的支持物得以制备，其中它表面形成的碳或金属或半金属碳化合物层上固定有生理活性物质。
在具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物不具备合适的官能团供生理活性物质结合的情况下，则首先将合适的官能团引入到具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物的表面，然后该支持物可以用上述的方法与生理活性物质接触，如同权利要求14所述。
在上文提及的方法中，可参照本文前面关于将官能团引入到具有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物表面的方式的相关描述。
在上文提及的方法中，任何一种本领域通常所用的方法均可用于制备含生理活性物质的溶液。举例来说，它包括tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、佛罗那缓冲液、硼酸盐缓冲液、Good缓冲液。用于固定的其缓冲液中的生理活性物质的量不能不加区分的予以限定，因为根据利用的生理活性物质的特性和类型而变化多样。一般而言，它可以从1ng/ml到1000mg/ml，优选从1μg/ml到10mg/ml，更优选从10μg/ml到2mg/ml。利用这类含生理活性物质的溶液，该物质被固定于支持物的表面，从而它的浓度可以落在上述的范围内。
权利要求16的发明涉及固定于其上形成有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物上的生理活性物质。
这种类型的固定的生理活性物质迄今为止是未知的，而且它能够精确和高灵敏度地检测样品中具有结合该生理活性物质之特性的成分。
对于这种类型的固定的生理活性物质，生理活性物质、碳或金属或半金属碳化合物及支持物以及碳或金属或半金属碳化合物层的形成方法和固定方法的具体的实例和优选的实施方式可以与前文提到的那些相同。
在根据上述方法得到了其表面形成的碳或金属或半金属碳化合物层上固定了生理活性物质的支持物之后，期望的是该支持物用本领域所通常使用的一般方法封闭，举例来说，通过将其浸泡在含封闭剂，例如白蛋白、球蛋白、酪蛋白、聚乙烯醇、表面活性剂、硅烷偶联剂、钛偶联剂、铝偶联剂及类似的物质的溶液中。
下面描述的是本发明权利要求17中用于分析样品成分的方法。
在本发明权利要求17的方法中，利用的是权利要求1至12任何一项中的固定了生理活性物质的支持物。利用这种固定了生理活性物质的支持物能够有效地、高灵敏度地、并且是精确地分析样品中的成份。
更具体的，权利要求1至12任何一项中的固定了生理活性物质的支持物首先同含有待分析成分的样品进行接触，从而固定在支持物上的生理活性物质与样品中该成分的复合体得以形成，如同权利要求18。下一步，对所生成的复合体进行分析以分析样品中的成分。
当用于本发明分析方法的固定了生理活性物质的支持物有两种或多种不同的生理活性物质固定在它上面形成的碳或金属或半金属碳化合物层表面上时，则样品中的目的成分可以被更为有效地、更为灵敏地并且是更为精确地予以分析，而且，另外，在一个操作中可以同时分析一个样品中的两种或多种不同的成分，且未知成分也能予以分析(确定、鉴别)。
更具体的，样品是以这样一种方式被施加到支持物的表面的，即样品中的所有成分都可以基本上同时与固定在支持物上的两种或多种不同的生理活性物质相接触，并且分析所得到的每个固定的生理活性物质与样品中每个成分的复合体，从而分析样品中的目的成分。
这里待分析的成分是能够特异性地与生理活性物质结合的成分，举例来说，通过抗原-抗体反应、受体-配体反应、凝集素-糖链反应或蛋白-肽链反应耐特异结合。更具体的，它包括上述的生理活性物质。有关生理活性物质和待分析成分的组合，参见本文上面所提到的那些。
样品包括，举例来说，体液例如血清、血浆、脊髓液、滑液、淋巴液；排泄物例如尿、大便；其他生物样品例如痰、脓、皮肤来源的物质；食品、饮料、自来水、海水、湖水、沼泽水、河水、工业废物、半导体洗涤物和其他环境样品例如医疗器械的洗涤物；以及那些通过将他们适当地溶解于水或本领域通常所使用的缓冲液中，例如tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、佛罗那缓冲液、硼酸盐缓冲液或Good缓冲液中而从它们重配的样品。
为使固定了生理活性物质的支持物(其中它表面形成的碳或金属或半金属碳化合物层上面固定有生理活性物质)同含有待分析成分的样品接触，以及为使样品中所有待分析的成分同固定了生理活性物质的支持物(其上面固定有两种或多种不同类型的生理活性物质)在本发明的分析方法中基本上同时都接触，举例来说，可使用的是以涂敷或滴加施加的方式将样品施加到支持物上的方法，或者将支持物浸泡在样品中的方法。
为分析上述方法中的固定于支持物的生理活性物质与样品中成分的复合体，一般而言，用具有与该成分或复合体特异性结合特性的标记结合物质与该复合体接触，从而形成固定的生理活性物质、样品中的成分及该标记的结合物质的复合体(标记复合体)，并对这种标记复合体中的标记物质予以检测。在这样检测到的数据的基础上，对生理活性物质和样品成分的复合体进行分析。
在待分析成分可以用某种方法直接检测的情况下，举例来说，酶、染料、荧光物质、发光物质、或UV-吸收物质，并非总是需要上述的标记结合物质。固定的生理活性物质和样品成分的复合体，同具有与该复合体特异性结合特性的标记的结合物质之间的接触，可以用与将固定了生理活性物质的支持物(其中形成的碳或金属或半金属碳化合物层上固定有生理活性物质)同含有所述成分的样品进行接触的方法同样的方法来实现。
具有与该成分或复合体特异性结合特性的标记的结合物质是一种具有特异性结合于该成分或复合体的特性并且能够以某种方法加以检测的物质。一般而言，它是一种用标记物质标记的物质，并且具有特异性结合于该成分或复合体的能力。具有特异性结合于该成分或复合体能力的物质与前文提到的生理活性物质相同，而且它通常是该该成分或复合体的抗体或抗原。
用于本发明的标记物质可以是任何本领域通常可用于酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、荧光免疫测定(FIA)、杂交或类似分析的物质。举例来说，它包括酶例如碱性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、过氧化物酶(POD)、微过氧化物酶、葡萄糖氧化酶(GOD)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、苹果酸脱氢酶、萤光素酶；染料例如考马斯亮蓝R250、甲基橙；放射性同位素例如99mTc，131I，125I，14C，3H，32P，35S；Cy3、荧光素、罗丹明、丹磺酰、荧光胺、香豆素、萘胺(naphtylamine)以及他们的衍生物；荧光物质例如铕(Eu)；发光物质例如萤光素、异鲁米诺(isoluminol)、鲁米诺、二(2，4，6-三氯苯基)草酸酯；UV-吸收物质例如苯酚、萘酚、蒽以及他们的衍生物；具有作为自旋标记物(spin-labeling agent)特性的物质，例如典型的具有烃氧基的物质，比如，4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧化物(4-amino-2，2，6，6-tetramethylpiperidin-1-oxyl)、3-氨基-2，2，5，5-四甲基吡咯烷-1-氧化物(3-amino-2，2，5，5-tetramethylpyrrol idin-1-oxyl)、2，6-二-叔丁基-α-(3，5-二-叔丁基-4-氧代-2，5-环己二烯-1-亚基)-对甲苯基氧基(2，6-di-t-butyl-α-(3，5-di-t-butyl-4-oxo-2，5-cyclohexadien-1-ylidene)-p-tolyloxyl)。
用能够与之特异性结合的标记物质对该成分或复合体进行标记可以通过任何本领域通常使用的一般方法来完成，举例来说，依照本身已知的EIA、RIA、FIA或杂交方法[举例来说，参见MedicochemicalExperiment Lecture，Vol.8，顾问编辑Yuichi Yamamura，第1版，Nakayama出版，1971；Illustrated Fluoresent Antibody，AkiraKawao著，第1版，Softscience，1983；Enzyme Immunoassay，EijiIshikawa、Tadashi Kavai、Kiyoshi Miyai编辑，第3版，Igaku Shoin，1987；Molecular Cloning A laboratory Manual，第2版，J.Sambrook，E.F.Frish，T.Maniatis，冷泉港实验室出版社]、或任何其他利用抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)与生物素的反应的一般方法中通常所使用的本身已知的标记方法来进行。
在本发明的分析方法中，样品中目的成分存在与否通过基于由固定了生理活性物质的支持物(其中它表面形成的碳或金属或半金属碳化合物层上固定有一种或多种不同的生理活性物质)和样品中的成分形成的复合体中该成分的特性，或者基于由固定了生理活性物质的支持物(其中它表面形成的碳或金属或半金属碳化合物层上固定有一种或多种不同的生理活性物质)、样品中的成分、以及具有特异性结合于该成分或结合于生理活性物质与该成分的复合体的特性的标记结合物质形成的复合体(标记复合体)中标记物质的特性，对该成分的检测而予以确定。
此外，在本发明的分析方法中，有可能根据该成分或标记物质的特性来测定存在于复合体中的成分的量或者存在于标记复合体中的标记物质的量，并且基于这样测得的的数据，有可能定量或半定量地测定样品中该成分的量。
为了在测得的成分或标记物质的量的基础上计算出样品中成分的量，举例来说，分别含有已知浓度该成分的样品(标准样品)用与上文相同的方法进行分析，以形成标准曲线指示该成分浓度与测量数据(复合体中成分的测量数据或者标记复合体中标记物质的测量数据)之间的关系，而样品中目的成分的量基于这样制备的标准曲线来确定。
更加具体地描述本发明的分析方法。
首先，固定了生理活性物质的支持物，其中它表面形成的碳或金属或半金属碳化合物层上固定有一种或多种不同的生理活性物质，用与上文相同的方法与含有目的成分的样品接触，从而形成生理活性物质与该成分的复合体。其次，支持物用免疫测试杂交领域所用的缓冲液，例如tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、佛罗那缓冲液、硼酸盐缓冲液或Good缓冲液或SSC缓冲液洗涤，从而除去样品中未参与复合体形成的成分。下一步，简而言之，这样形成的复合体与具有特异性结合于该成分或复合体特性的标记结合物质接触，从而形成固定的生理活性物质、该成分及该标记结合物质的标记复合体，之后，支持物用缓冲液(例如上述的缓冲液)洗涤，从而除去游离的、未参与标记复合体形成的标记结合物质。接着，复合体中的成分以及标记复合体中的标记物质根据其特性用预定的方法进行测定，并且根据这样测得的数据，可分析样品中成分。
除了前文提到的方法之外，样品中的目的成分还可以用任何其他方法予以分析，举例来说，通过竞争性试验予以分析，其中样品中的成分与同类型但是由标记物质标记过了的成分竞争性地进行反应。
具体地，固定了生理活性物质的支持物，其中它表面形成的碳或金属或半金属碳化合物层上固定有一种或多种不同的生理活性物质，与含有目的成分的样品以及和目的成分同类型但是由标记物质标记过了的成分接触，从而形成生理活性物质和标记成分的标记复合体以及生理活性物质和该成分的复合体。下一步，支持物用缓冲液(例如上述的缓冲液)洗涤，从而除去未参与复合体形成的样品中的成分以及游离的标记成分。接着，标记复合体中的标记物质或者结合于除去的游离标记成分的标记物质根据其特性用预定的方法进行测定，并且根据这样测得的数据，可分析样品中的目的成分。
在这种实施方式中，用标记物质标记成分的方法以及使固定了生理活性物质的支持物与样品以及与标记成分接触的方法可分别与用标记物质(例如上述那些标记物质)标记该成分或能够特异性结合于该复合体的物质的方法、以及使固定了生理活性物质的支持物与含有成分的样品接触的方法相同，并且其他也是与前文提到的一样。
在上述的方法中，复合体中的成分以及标记复合体中的标记物质的测定可根据该成分或标记物质的类型用预定的方法完成。举例来说，当待测物质的特性是酶活性时，则任何已知的EIA或杂交方法都可使用。举例来说，这种测定可根据Enzyme Immunoassay，Protein，Nucleic Acid，Enzyme，Seperate Edition，No.31，TsunehiroKitagawa、Toshio Minamihara、Akio Tsuji、Eiji Ishikawa编辑，第51-63页(Kyoritsu Publishing出版，1987年9月10日)中描述的方法来完成。当待测物质是放射性物质时，则它可用任何一般的RIA或杂交方法检测。具体地，根据该放射性物质所发射的射线的类型和强度，选择和使用合适的仪器例如dip GM计数器、液相闪烁计数器或方孔闪烁计数器，从而该放射性物质得以检测和确定(举例来说，参见如Medicochemical Experiment Lecture，Vol.8，顾问编辑Yuichi Yamamura，第1版，Nakayama Publishing，1971；BiochemicalExperiment Lecture 2，Tracer Experiment Method，最新版，ShosukeTakemura、You Honsho，第501-525页，Tokyo Kagaku Dojin版，1977年2月25日)。当待测物质的性质是荧光时，则该物质可用任何已知的使用荧光光度计或共聚焦激光显微镜测量仪器的FIA或杂交方法予以确定。具体的，举例来说，可使用的有Illustrated FluoresentAntibody，Akira Kawao著，第1版，Softscience，1983；BiochemicalExperiment Lecture 2，Chemistry of Nucleic Acid III，MineroJitsuyoshi，第299-318页，Tokyo Kagaku Dojin出版，1977年12月15日中描述的方法。当待测物质的特性是冷光时，则该物质可用任何已知的使用测量仪器例如光子计数器的方法予以检测。具体的，举例来说，可使用的是Enzyme Immunoassay，Protein，Nucleic Acid，Enzyme，Seperate Edition，No.31，Tsunehiro Kitagawa、ToshioMinamihara、Akio Tsuji、Eiji Ishikawa编辑，第252-263页中描述的方法，Kyoritsu Publishing出版，1987年9月10日。当待测物质的特性是UV吸收时，则该物质可用任何已知的使用测量仪器例如分光光度计的方法予以检测。当待测物质的特性是显色时，则该物质可用任何已知的使用测量仪器例如分光光度计或显微镜的方法予以检测。当待测物质的特性是自旋时，则该物质可用任何使用电子自旋共振仪的一般方法予以检测。具体的，举例来说，可使用的是EnzymeImmunoassay，Protein，Nucleic Acid，Enzyme，Seperate Edition，No.31，Tsunehiro Kitagawa、Toshio Minamihara、Akio Tsuji、Eiji Ishikawa编辑，第264-271页中描述的方法(KyoritsuPublishing出版，1987年9月10日)。
在上述的方法中，具有与待分析成分或该成分的复合体特异性结合特性的标记结合物质的量变化不等，取决于所用的标记结合物质的类型，因而不能不予区分地加以限定。不过，一般而言，该量不低于该物质能够与固定在支持物上的全部生理活性物质结合的浓度。类似地，用标记物质标记的成分的量也不能不予区分的加以限定，因为其依待分析成分的类型而变化。不过，一般而言，该量不低于该成分能够与固定在支持物上的全部生理活性物质结合的浓度。
在上述的方法中，反应期间的pH和温度同样不能不予区分的加以限定，因为其依所用的生理活性物质和待分析成分的类型而变化。它们可以在不干扰形成生理活性物质和该成分的复合体、或者生理活性物质、该成分及标记物质的标记复合体、或者生理活性物质与标记成分的复合体的范围之内。具体地，pH通常落在2和10之间，优选在5和9之间；而温度通常落在0和90℃之间，优选在20和80℃之间。反应时间可根据形成复合体的成分的特性适当地予以确定，因为形成上述的复合体所必须的时间依各构成成分的特性而变化。一般而言，该成分可适当地反应数秒到数小时。
在本发明的分析方法中，当如同权利要求19中所述一样选择抗原或抗体作为生理活性物质固定于支持物上时，则样品中该生理活性物质的抗原或抗体可以用简化的方法予以精确分析。当选择的是如权利要求20中所述由肿瘤标志、激素、激素干扰性化学制品、微生物来源的蛋白或肽或糖链抗原、受体、配体、过敏原、免疫球蛋白(特别是IgE)、凝集素、糖链以及这些物质的抗体所组成的组中的一个或多个时，则样品中这些物质本身或者这些生理活性物质的抗体可以用简化的方法予以分析，并且这是本发明的一个有利的实施方式。
当选择受体、配体、凝集素、肿瘤标态(糖链)、蛋白或肽作为生理活性物质时，则他们不仅可通过抗原-抗体反应而且可通过受体-配体反应、凝集素-糖链反应或蛋白-肽链反应予以分析。
进一步的，当本发明的分析方法通过利用本发明固定了生理活性物质的支持物进行，并且其中的生理活性物质是选自如权利要求21中所述由过敏原、免疫球蛋白(特别是IgE)以及这些物质的抗体所组成的组中的一个或多个时，则过敏反应相关分析可以精确地用简化的方式完成，而且这是本发明的一个特别有利的的实施方式。
具体的，举例来说，当过敏原的抗体用作为生理活性物质时，则其有利于过敏原分析(关于某个样品中存在过敏原与否以及其中该过敏原的含量)。在另一方面，当过敏原用作为生理活性物质时，则其有利于进行过敏原、过敏反应的起因的特定分析(关于针对何种过敏原发生何种过敏反应，以及关于该过敏反应的程度如何)。当选择抗IgE抗体作为生理活性物质时，则它可用于检测样品中的总IgE含量(关于该样品是否可导致何种程度过敏反应的过敏性体质)。
本发明的分析方法参照据此进行的过敏反应相关分析更具体地加以描述。
(1)过敏原的分析首先，含有待分析成分(过敏原)的样品以如下方式被施加到固定了生理活性物质的支持物上，其中的生理活性物质是该过敏原的抗体以滴加施加或涂敷的方式，或者将支持物浸泡在样品中，藉此两者彼此相互接触，并且该抗体和过敏原的复合体因而形成。其次，支持物用合适的缓冲液洗涤，从而除去样品中未参与复合体形成的成分(例如游离过敏原)。下一步，用与上文相同的方式使这样形成的复合体与由标记物质标记过的这种过敏原的抗体(具有与该成分或该复合体特异结合特性的标记结合物质)接触，从而形成固定的过敏原抗体、该过敏原及过敏原的标记抗体的标记复合体。接着，其用合适的缓冲液洗涤以除去游离的未参与标记复合体形成的标记抗体。然后，依照上文所述的方法测定标记复合体中的标记物质，而这可以阐明样品中的过敏原存在与否。
进一步的，上述方法中标记复合体中标记物质的量根据上文所述方法予以测定，而且这样测得的标记物质的量被应用到标准曲线中，该标准曲线指示利用分别具有已知浓度过敏原的其他样品(标准样品)以上述相同方式测定的过敏原浓度和实际测得的数据(这里实际测得的标记复合体中标记物质的量)之间的关系。该方法能够对样品中存在的过敏原量进行定量或半定量测定。
在上述的方法中，当固定两个或多个不同过敏原的两个或多个不同抗体到支持物上形成的碳或金属或半金属碳化合物层上并且使用这样固定的支持物时，则可在一个操作中对一个样品中不同类型的多种过敏原予以确定、鉴定和定量，而且这是本发明的一个优势的具体实施方式
。
(2)过敏原、过敏反应的原因的具体分析首先，含有待分析成分(过敏原的IgE)的样品以以下方式被施加到固定了生理活性物质的支持物上，其中它表面形成的碳或金属或半金属碳化合物层上固定有生理活性物质过敏原(抗原)以滴加施用或涂敷的方式，或者将支持物浸泡在样品中；藉此两者彼此相互接触，这样形成过敏原和该过敏原的IgE的复合体。其次，支持物用合适的缓冲液洗涤，从而除去样品中未参与复合体形成的成分(例如不用于目的分析的游离IgE)。下一步，用与上文相同的方式使这种形成的复合体与由标记物质标记过的抗IgE抗体(具有与该成分或该复合体特异结合特性的标记结合物质)接触，从而形成固定的过敏原、该过敏原的IgE及标记的抗IgE抗体的标记复合体。接着，其用合适的缓冲液洗涤以除去游离的未参与标记复合体形成的标记抗IgE抗体。然后，依照上文所述的方法检测标记复合体中的标记物质，而这可以阐明样品中的特定过敏原(该固定生理活性物质)的IgE存在与否，或者说，它阐明关于这里所分析的样品供体是否具有针对该特定过敏原的某种过敏反应的原因，进一步换句话说，它确定了过敏原，过敏反应的原因。
另外，上述方法中标记复合体中标记物质的量根据上文所述方法予以确定，而且这样测得的标记物质的量被应用到标准曲线中，该标准曲线指示利用分别具有已知浓度IgE的其他样品(标准样品)以上述相同方式测定的IgE浓度和实际测得的数据(这里实际测得的标记复合体中标记物质的量)之间的关系。该方法能够对样品中存在的针对过敏原(该生理活性物质)的抗体(IgE)的量进行定量或半定量测定。其显示样品供体对该特定过敏原的易感性强度，或者说，样品供体中可能发生的针对该特定过敏原的过敏反应的程度。
上述方法的概要显示于图1。
在上述方法中，当固定两个或多个不同的过敏原到支持物上形成的碳或金属或半金属碳化合物层上并且使用这样固定的支持物时，则其可以对与样品中每种IgE反应的每种过敏原的类型予以具体说明和鉴定(或者说，它阐明关于样品供体是否可能对何种过敏原具有过敏反应)，而且其显示样品供体对这样具体说明或鉴定的过敏原的易感性强度，从而是本发明的一个优势的实施方式。
(3)样品中总IgE量的测定首先，含有待分析成分(IgE)的样品以如下方式被施加到固定了生理活性物质的支持物上，其中它表面形成的碳或金属或半金属碳化合物层上固定有生理活性物质抗IgE抗体以滴加施用或涂敷的方式，或者将支持物浸泡在样品中；藉此两者彼此相互接触，并因而形成抗IgE抗体和IgE的复合体。其次，支持物用合适的缓冲液洗涤，从而除去样品中未参与复合体形成的成分。下一步，用与上文相同的方式使这种形成的复合体与由标记物质标记过的抗IgE抗体(具有与该成分或该复合体特异结合特性的标记结合物质)接触，从而形成固定的抗IgE抗体、IgE及标记的抗IgE抗体的标记复合体。接着，其用合适的缓冲液洗涤以除去游离的未参与标记复合体形成的标记抗IgE抗体。然后，依照上文所述的方法测定标记复合体中的标记物质的量。如此测定后，标记复合体中标记物质的量被应用到标准曲线中，该标准曲线指示利用分别具有已知浓度IgE的其他样品(标准样品)以与上文相同的方式测定的IgE浓度和实际测得的数据(这里实际测得的标记复合体中标记物质的量)之间的关系，而且该方法能够对样品中总IgE量进行定量或半定量测定。其显示样品供体对一般过敏原的易感性强度，或者说，其显示关于样品供体是否具有过敏性体质(具体地，显示样品供体过敏性体质的程度)。
上述方法的概要显示于图2。
在上述方法中，当抗IgE抗体及两种或多种不同的过敏原都被固定到支持物上形成的碳或金属或半金属碳化合物层上、并且这样固定的支持物被用来同时实施(2)和(3)中的两种方法时，则其可以对样品中针对IgE的过敏原的类型予以具体说明和鉴定(或者说，关于样品供体可能如何对何种过敏原具有过敏反应)，和/或其可阐明样品供体对这样具体说明和鉴定的过敏原的易感性程度，进一步显示样品供体对一般过敏原的易感性的程度(关于样品供体是否具有过敏性体质)，从而是本发明的一个优势的实施方式。
具体地，含有待分析成分(IgE)的样品以如下方式被施加到固定了生理活性物质的支持物上，其中它表面形成的碳或金属或半金属碳化合物层的同一个表面上具有生理活性物质抗IgE抗体及两种或多种不同的过敏原以滴加施用或涂敷的方式，或者将支持物浸泡在样品中；藉此两者彼此相互接触，并且不同过敏原和IgE的复合体、以及抗IgE抗体和IgE的复合体都因而形成。其次，支持物用合适的缓冲液洗涤，从而除去样品中未参与复合体形成的成分。下一步，用与上文相同的方式使这样形成的复合体与由标记物质标记过的抗IgE抗体接触，从而形成每种固定的过敏原、IgE和标记的抗IgE抗体的标记复合体，以及固定的抗IgE抗体、IgE及标记的抗IgE抗体的标记复合体。接着，其用合适的缓冲液洗涤以除去游离的未参与标记复合体形成的标记抗IgE抗体。然后，在这样形成的标记复合体中，依照上文所述的方法，测定每种固定过敏原相关的标记复合体中的标记物质，而且这显示样品中是否存在两种或多种不同固定过敏原的抗体(IgE)，或者说，这具体说明和鉴定样品中针对IgE的过敏原的类型。更进一步的，换句话说，这阐明关于样品供体是否可能对何种过敏原具有过敏反应。另外，当根据上文所述的方法基于根据也是上文所述的方法所确定的标记物质的量，对样品中针对这样具体说明和鉴定的过敏原的抗体(IgE)的量予以定量或半定量测定后，则其阐明样品供体对这样具体说明和鉴定的过敏原的易感性程度，或者说，其阐明样品供体对这里具体说明和鉴定的过敏原可能具有的过敏反应的程度。进一步地，当根据上文所述的方法基于根据也是上文所述的方法所确定的标记物质的量，对样品中的总IgE量予以定量或半定量测定后，则其阐明样品供体对一般过敏原的易感性程度，或者说，其阐明关于样品供体是否具有过敏性体质(具体地，显示样品供体过敏性体质的程度)。
下面描述的是本发明权利要求22的试剂盒，它是用于分析样品中的成分的。
本发明权利要求22的试剂盒包含权利要求1至12任何一项中的固定了生理活性物质的支持物。在该试剂盒的支持物上，固定了一种或多种能够特异性地与待用该试剂盒分析的相应一种或多种成分结合的生理活性物质。
在本发明的试剂盒中，优选的实施方式和固定了生理活性物质的支持物的具体实例与前文所述的相同。除了这里的支持物，本发明的试剂盒还可以包含标记的结合物质，它具有与目的成分或该成分的复合体特异性结合的性质。
本发明的试剂盒包含权利要求1至12任何一项中的固定了生理活性物质的支持物，而且除此之外，该试剂盒可以包含本领域通常使用的任何试剂。举例来说，它可包含溶液例如缓冲液(洗涤液)，以及着色剂例如可氧化着色剂和偶联剂；而且当其中的标记物质是酶时，它可包含该酶的底物，试剂例如用于终止酶反应的反应终止剂；而且它可包含用该试剂盒所要分析的成分的标准品。试剂盒中可能的每种试剂和每种标准品的浓度可以是任何本领域通常使用的一般浓度。
实施例本发明参照以下实施例予以描述。
(实施例1)根据图1的方法，利用结合了抗IgE抗体的、涂敷了金刚石的支持物来分析IgE。
1.官能团的活化将包被了羧基、涂敷了金刚石的支持物浸泡在0.1M的磷酸盐缓冲液(pH6)中30分钟，其中含有20mM的N-羟基琥珀酰亚胺和0.1M的1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亚胺。这样浸泡后，这种涂敷了金刚石的支持物用无菌蒸馏水洗涤两次，并离心以彻底去除水分。
2.抗人IgE抗体的固定抗人IgE抗体用50mM MOPS缓冲液(pH7.5)处理以具有预定浓度，并利用冲压机(stamping machine)日本激光电子公司(NipponLaser Electronics)的GT-MASS，将其点到上文制备的活化了的涂敷了金刚石的支持物上。
在如此点样之后，在预先控温在65℃的含有50％甲酰胺的潮湿小室中温育1小时。
3.封闭上文2中制备的固定了IgE抗体的、涂敷了金刚石的支持物用含2％牛血清白蛋白的50mM MOPS缓冲液(pH7.5)于室温下封闭一整天。这样封闭后，其在1000rpm离心1分钟。
4.与样本的反应将待分析成分人IgE用含2％牛血清白蛋白的50mM MOPS缓冲液(pH7.5)处理以制备预定浓度的样本。10μl的每个样本被施加到支持物芯片上，用玻璃盖片覆盖以防止气泡，然后放置于杂交室中并于室温下反应1小时。反应后，从上面移去玻璃盖片，并且每个芯片用SSC(0.15M NaCl -0.015M柠檬酸三钠溶液)洗涤3次，并在1000rpm离心1分钟。
5.结合于支持物的人IgE的检测10μl Cy3标记的抗人IgE抗体(0.86μg/ml)被施加到芯片上，用玻璃盖片覆盖以防止气泡，然后放置于杂交液中并于室温下反应1小时。反应后，从上面移去玻璃盖片，并且每个芯片用SSC(0.15M NaCl-0.015M柠檬酸三钠溶液)洗涤5次，并在1000rpm离心1分钟。
利用GSI Lunomicus的共聚焦激光扫描仪来测定Cy3标记的抗人IgE抗体的量，并且这显示了每个芯片上抗原-抗体反应的程度。数据显示于表1和图3中。
表1-抗人IgE抗体的量的数据

根据表1和图3的数据可知，本发明的方法能够进行人IgE的检测和定量分析。
(实施例2)根据图2的方法，利用结合了抗IgE抗体的、涂敷了金刚石的支持物来分析过敏原。
1.涂敷了金刚石的支持物的活化将包被了羧基、涂敷了金刚石的支持物浸泡在0.1M的磷酸盐缓冲液(pH6)中30分钟，其中含有20mM的N-羟基琥珀酰亚胺和0.1M的1-(3-(二甲基氨基)丙基)-3-乙基碳二亚胺。在这样浸泡之后，其用无菌蒸馏水洗涤两次，并离心以彻底去除水分。
2.过敏原的固定过敏原(螨虫抗原或日本柳杉花粉抗原)用50mM MOPS缓冲液(pH7.5)处理以具有0.5mg/ml的浓度，并利用冲压机，日本激光电子公司的GT-MASS，将其点到上文制备的活化了的涂敷了金刚石的支持物上面。在如此点样之后，其在含有50％甲酰胺的潮湿小室中温育1小时。
3.封闭将10μl含2％牛血清白蛋白的50mM MOPS缓冲液(pH7.5)施加到涂敷了金刚石的支持物上，其用玻璃盖片覆盖以防止气泡，并且这样封闭2小时。
从上面移去玻璃盖片，并且支持物用1×SSC洗涤3次，然后离心除去过多的水分。
4.样本的施加制备对日本柳杉花粉或螨呈阳性过敏反应的人血清(日本柳杉花粉阳性血清或螨虫阳性血清)，以及对两者呈阴性的人血清(阴性血清)作为样本。10μl的每个血清样本被施加到支持物微阵列上，用玻璃盖片覆盖以防止气泡，并于4℃反应一整天。反应后，从上面移去玻璃盖片，并且每个微阵列用1×SSC冲洗3次，并离心除去剩余的水分。
5.与标记抗体的反应10μl溶于含2％牛血清白蛋白的50mM MOPS缓冲液(pH7.5)中的Cy3标记的抗人IgE抗体(4.3μg/ml)被施加到微阵列上，用玻璃盖片覆盖以防止气泡，并反应3小时。反应后，从上面移去玻璃盖片，并且每个微阵列用1×SSC洗涤3次，并离心除去多余的水。
6.结果利用GSI Lunomicus的共聚焦激光扫描仪来测定Cy3标记的抗人IgE抗体来源的荧光，并且这显示了每个微阵列上的抗原一抗体反应的程度。阴性血清样本的结果显示于图4；日本柳杉花粉阳性血清样本的结果显示在图5；而螨阳性血清样本的结果显示在图6。
根据图4的结果可知，阴性血清样本在微阵列上日本柳杉花粉抗原固定部位和螨固定部位两者中均几乎没有Cy3标记的抗人IgE抗体来源的荧光。根据图5的结果可知，日本柳杉花粉阳性血清样本在微阵列上的日本柳杉花粉抗原固定部位给出清晰的Cy3标记的抗人IgE抗体来源的荧光，而在其上的螨固定部位几乎没有。根据图6的结果可知，螨阳性血清样本在微阵列上的螨抗原固定部位给出强烈的Cy3标记的抗人IgE抗体来源的荧光。
在图6中，在微阵列上的日本柳杉花粉抗原固定部位发现少许微弱的Cy3标记的抗人IgE抗体来源的荧光。在这方面，对螨阳性血清的供体进行了详细的检查。结果发现，该供体不仅对螨过敏反应呈阳性，而且在某种程度上对日本柳杉过敏反应也呈阳性，或者说，这里测试的螨阳性血清不仅对螨而且对日本柳杉的过敏反应都呈阳性。
根据这些结果可知，本发明的方法使得特异性地鉴定导致过敏反应的过敏原成为可能，而且使得确定样本供体对这样鉴定的过敏原的易感性程度成为可能。
工业实用性本发明的支持物上可高密度地固定生理活性物质，而且该固定了生理活性物质的支持物实现了高固定效率，而不需消耗大量的该物质。另外，即使对于具有各种表面电荷的生理活性物质，该支持物也可以确保这种高固定效率。
本发明的方法可有效地制备这种支持物。
在本发明分析样品成分的方法中，利用了这种支持物，并且这种方法能够精确地分析样品中的各种不同成分。
进一步地，利用本发明的试剂盒，有可能以更简化的方式分析样品中的成分。
特别地，由于其上固定有抗IgE抗体的支持物能够与过敏原反应而精确地分析与过敏反应密切相关的IgE，因此它可用于各种不同的免疫诊断，以确定过敏反应的原因。
因此，本发明可用于多种领域，举例来说，用于医学领域的疾病诊断，以及用于生物化学和分子生物学领域的研究。
权利要求
1.固定了生理活性物质的支持物，其表面形成有碳或金属或半金属碳化合物层，并且该层上固定有生理活性物质。
2.如权利要求1中所要求保护的固定了生理活性物质的支持物，其中生理活性物质通过碳或金属或半金属碳化合物层的官能团固定于支持物表面。
3.如权利要求1中所要求保护的固定了生理活性物质的支持物，其中生理活性物质通过该物质的官能团与碳或金属或半金属碳化合物层的官能团结合而固定于支持物表面。
4.如权利要求3中所要求保护的固定了生理活性物质的支持物，其中生理活性物质的官能团和/或碳或金属或半金属碳化合物层的官能团是从由羟基、羧基、磺基、氰基、硝基、硫醇基、氨基、氨基苯基以及环氧基组成的组中选择的一个或多个。
5.如权利要求1至4任何一项中所要求保护的固定了生理活性物质的支持物，其中生理活性物质是对生物体具有特定作用的物质，或者是生物蛋白或肽。
6.如权利要求1至5任何一项中所要求保护的固定了生理活性物质的支持物，其中生理活性物质是抗原和/或抗体。
7.如权利要求6中所要求保护的固定了生理活性物质的支持物，其中抗原和/或抗体是从由肿瘤标志、激素、激素干扰性化学制品、微生物来源的蛋白或肽或糖链抗原、受体、配体、过敏原、免疫球蛋白、凝集素、糖链、脂类、脂多糖以及这些物质的抗体组成的组中选择的一个或多个。
8.如权利要求7中所要求保护的固定了生理活性物质的支持物，其中抗原和/或抗体是从由过敏原、免疫球蛋白以及这些物质的抗体组成的组中选择的一个或多个。
9.如权利要求1至8任何一项中所要求保护的固定了生理活性物质的支持物，其中碳或金属或半金属碳化合物层包含结晶碳。
10.如权利要求1至8任何一项中所要求保护的固定了生理活性物质的支持物，其中碳或金属或半金属碳化合物层包含非结晶碳。
11.如权利要求9中所要求保护的固定了生理活性物质的支持物，其中结晶碳是金刚石或金刚石样碳。
12.如权利要求10中所要求保护的固定了生理活性物质的支持物，其中非结晶碳是石墨或无定形炭。
13.制备固定了生理活性物质的支持物的方法，包括使生理活性物质同其表面形成有带官能团的碳或金属或半金属碳化合物层的支持物接触。
14.制备固定了生理活性物质的支持物的方法，包括将官能团引入其上形成有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物中，然后将该支持物同生理活性物质接触。
15.如权利要求13或14中所要求保护的制备固定了生理活性物质的支持物的方法，其中官能团是从由羟基、羧基、磺基、氰基、硝基、硫醇基、氨基、氨基苯基以及环氧基组成的组中选择的一个或多个。
16.固定于其上形成有碳或金属或半金属碳化合物层的支持物表面上的生理活性物质。
17.分析样品中成分的方法，其中使用了权利要求1至12任何一项的固定了生理活性物质的支持物。
18.如权利要求17中所要求保护的分析样品中成分的方法，其中权利要求1至12任何一项的固定了生理活性物质的支持物同含有待分析成分的样品进行接触，并对所生成的生理活性物质与该成分的复合体予以分析。
19.如权利要求17或18中所要求保护的分析样品中成分的方法，其中固定于支持物表面的生理活性物质是任何的抗原或抗体，而样品中的成分是该生理活性物质的抗原或抗体。
20.如权利要求19中所要求保护的分析样品成分的方法，其中抗原或抗体是从由肿瘤标志、激素、激素干扰性化学制品、微生物来源的蛋白或肽或糖链抗原、受体、配体、过敏原、免疫球蛋白、凝集素、糖链、脂肪、脂多糖以及这些物质的抗体组成的组中选择的一个或多个。
21.如权利要求20中所要求保护的分析样品中成分的方法，其中抗原或抗体更优选是从由过敏原、免疫球蛋白以及这些物质的抗体组成的组中选择的一个或多个。
22.分析样品中成分的试剂盒，其包含权利要求1到12任何一项的固定了生理活性物质的支持物。
全文摘要
本发明目的是提供一种表现出高固定效率的支持物，在它上面可以高密度地固定生理活性物质；一种利用该固定载体有效地分析生物成分的方法；以及一种用于该分析的试剂盒。本发明公开了固定生理活性物质的支持物，它包含在其表面形成的携带生理活性物质的碳或金属或半金属碳化合物层；制备用以固定生理活性物质的支持物的方法，其特征在于使具有带官能团的碳或金属或半金属碳化合物层的支持物同生理活性物质进行接触；利用该支持物分析样品中成分的方法；以及包含上面的支持物的用于分析样品中成分的试剂盒。
文档编号G01N33/544GK1511257SQ02810390
公开日2004年7月7日 申请日期2002年5月14日 优先权日2001年5月24日
发明者丹花通文, 冈村浩, 高木研一, 天野诚, 黑泽龙雄, 一, 雄 申请人:东洋钢钣株式会社