专利名称：测量醋酸格拉默功效的方法
本申请要求在2001年12月4日提出的美国临时申请60/338,767的利益，其内容结合于此作为参考。
贯穿本申请，在括号中使用缩短的引用，引用各种参考文献。这些参考文献的完整引用可以在说明书的结尾，紧接着权利要求之前发现。这些出版物它们整个被结合于本申请作为参考以更充分地描述本发明相关的发明领域本发明涉及标准化醋酸格拉默功效的测量的方法，其基于醋酸格拉默为T细胞特异性识别。
背景因为存在有效治疗施用其的疾病的活性成分的最佳功效和质量，期望标准化药物组合物的功效的测量。
醋酸格拉默(GA，也称为共聚物-1(医师办公桌参考)，共聚物1，Cop-1或COPAXONE)，是批准的治疗多发性硬化(MS)的药物。醋酸格拉默由合成多肽的醋酸盐组成，包含4种天然存在的氨基酸(医师办公桌参考)L-谷氨酸，L-丙氨酸，L-酪氨酸，和L-赖氨酸(医师办公桌参考)，平均摩尔份数分别为L-谷氨酸0.129-0.153；L-丙氨酸0.392-0.462；L-酪氨酸0.086-0.100；L-赖氨酸0.300-0.374。醋酸格拉默的平均分子量为4,700-11,000道尔顿(医师办公桌参考)。在化学上，醋酸格拉默被称为含有L丙氨酸，L-赖氨酸和L-酪氨酸的L-谷氨酸聚合物，醋酸盐(盐)(医师办公桌参考)。它的结构式是(Glu，Ala，Lys，Tyr)x·XCH3COOH(C5H9NO4·C3H7NO2·C6H14N2O2·C9H11NO3)X·XC2H4O2
CAS-147245-92-9(医师办公桌参考)。醋酸格拉默还写成聚[L-Glu13-15，L-Ala39-46，L-Tyr8.6-10，L-Lys30-37]nCH3COOH。
醋酸格拉默显示抑制实验自身免疫性脑脊髓炎(EAE)--一种关于各种动物物种中多发性硬化(MS)的实验模型(Lando等，1979；Aharoni，1993)。小鼠EAE的研究提示防止EAE的保护是通过T细胞活性介导的(Aharoni，1993)。通过注射醋酸格拉默特异性的T抑制细胞，可以将这种其中涉及几种自身抗原的通过小鼠脊髓匀浆的EAE主动诱导的保护过继转移给正常接受者(Aharoni，1993)。在III期临床试验中，发现每日皮下注射醋酸格拉默减缓伤残进展和降低恶化-减缓多发性硬化的复发率(Johnson，1987)。制备醋酸格拉默的方法在美国专利3,849,550和5,800,808和PCT国际公开号WO 00/05250中描述。
通常接受高水平的抗原特异性是T细胞激活的特征。免疫系统的T细胞识别免疫原性肽，其与在抗原呈递细胞(APC)上表达的主要组织相容性复合体(MHC)II类或I类分子复合。T细胞抗原识别的特异性由几个参数确定1)T细胞受体对MHC肽复合体的亲和力；2)抗原性肽的一级结构；和3)抗原性肽内部某些氨基酸组合的协同作用。基于当前关于醋酸格拉默作用机制的了解，认为在MS中的醋酸格拉默的生物活性受T细胞活性的免疫调节的介导。
发明概述本发明提供测量试验批次的醋酸格拉默的功效(相对于参考批次的醋酸格拉默的已知功效)的方法，其包含a.用预定量的来自参考批次的醋酸格拉默免疫8-12周龄的雌性(SJLXBALB/C)F1小鼠；b.在免疫9-11天后制备来自步骤(a)小鼠的淋巴结细胞的原代培养物；c.分别温育至少5个参考样品，其中每个包含预定数量的来自步骤(b)原代培养物的细胞和预定量的来自参考批次的、1μg/ml-25μg/ml的醋酸格拉默；
d.温育至少2个样品，其中每个包含预定数量的来自步骤(b)原代培养物的细胞和预定量的来自试验批次的醋酸格拉默；e.对于步骤(c)和(d)中的每个样品测定在温育该样品18-21小时后在每个样品中由细胞分泌的白细胞介素-2的量；f.将由与试验批次的醋酸格拉默温育的样品分泌的白细胞介素-2的量与由与参考批次的醋酸格拉默温育的样品分泌的白细胞介素-2的量关联，以便测定试验批次的醋酸格拉默相对于参考批次的醋酸格拉默的功效，其中在步骤(c)和(d)的每个样品中，预定的细胞数量基本上相同，并且其中对于包含预定量的试验批次的醋酸格拉默的每个样品，存在相应的参考样品，其含有基本上相同的预定量的来自参考批次的醋酸格拉默。
本发明还提供测量试验批次的醋酸格拉默的功效(相对于参考批次的醋酸格拉默的已知功效)的方法，其包含a.用预定量的来自参考批次的醋酸格拉默免疫试验动物；b.在免疫后预定时间制备来自步骤(a)试验动物的细胞的原代培养物；c.分别温育至少2个参考样品，其中每个包含预定数量的来自步骤(b)原代培养物的细胞和预定量的来自参考批次的醋酸格拉默；d.温育至少2个样品，其中每个包含预定数量的来自步骤(b)原代培养物的细胞和预定量的来自试验批次的醋酸格拉默；e.对于步骤(c)和(d)中的每个样品测定在温育该样品预定时期后在每个样品中由细胞分泌的细胞因子的量；f.将由与试验批次的醋酸格拉默温育的样品分泌的细胞因子的量与由与参考批次的醋酸格拉默温育的样品分泌的细胞因子的量关联，以便测定试验批次的醋酸格拉默相对于参考批次的醋酸格拉默的功效，其中在步骤(c)和(d)的每个样品中，预定的细胞数量基本上相同，并且其中对于包含预定量的试验批次的醋酸格拉默的每个样品，存在相应的参考样品，其含有基本上相同的预定量的来自参考批次的醋酸格拉默。
附图简述

图1用GARS(参考标准)。LN细胞的原代培养物。通过ELISA的IL-2检测。
图2GA-特异性T细胞的诱导。在增加浓度的GARS的存在下培养LN细胞的原代培养物，其来源于用250μg GARS+CFA或单独用CFA免疫的小鼠。在37℃下温育过夜后收集培养基并通过ELISA测定IL-2。
图3血细胞计数器。
图4免疫方案-培养源和GA参考标准(RS)剂量效应的优化。淋巴结(LN)和脾细胞的原代培养来源于用10或250μg GARS+完全弗氏佐剂(CFA)免疫的小鼠。在增加浓度的GARS的存在下培养细胞。在37℃下温育过夜后收集培养基并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定IL-2。
图5免疫方案-佐剂和剂量效应的优化。LN细胞的原代培养物来源于用250Ag GARS+CFA或用10mg GARS+不完全弗氏佐剂(ICFA)免疫的小鼠，在增加浓度的GARS的存在下培养。在37℃下温育过夜后，收集培养基并通过ELISA测定白细胞介素-2(IL-2)。
图6免疫时期的影响。用CFA中的250Ag GARS免疫小鼠并在9，10和11天后去除LN。通过ELISA测量IL-2分泌体外检测来自不同组的LN细胞对各种浓度GARS的反应。
图7培养基对GA-特异性的T细胞反应的影响。用含有1％正常小鼠血清(NMS)，1％胎牛血清(FBS)或合成细胞培养基(DCCM1)的不同培养基培养LN细胞的原代培养物。在37℃下用增加浓度的GARS培养细胞21小时。随后，收集培养基并通过ELISA测定IL-2。
图8响应GARS的IL-2分泌的动力学。从用250μg GARS+CFA免疫的小鼠制备LN细胞的原代培养物。将细胞与0，0.5，2.5和5pg/ml GARS在37℃下温育指示的时间间隔。在每个时间点，将5×106个细胞的等分试样离心并将上清液保持在-20℃。通过ELISA同时测定所有样品的IL-2。
图9IL-2在培养基中的稳定性。从用250Ag GARS+CFA免疫的小鼠制备LN细胞的原代培养物。在37℃下将细胞与不同浓度的GARS温育。过夜温育后，收集上清液并分成两等分试样。一等分试样通过ELISA立即测定，第二个在测定前在-20℃下保持7天。
图10GARS溶液在-20℃下的稳定性。制备1mg/ml的GARS溶液，分成等分试样并保持在-20℃。在时间零点(日期1)和在-20℃下5个月后测定GA-特异性细胞对GARS溶液的剂量反应。
图11平均分子量(MW)对GARS特异性T细胞反应的影响。从用250Ag GARS+CFA免疫的小鼠制备LN细胞的原代培养物。在2种不同浓度的GARS和不同分子量的GA药物物质(DS)的存在下培养细胞。在37℃下温育过夜后，收集培养基并通过ELISA测定IL-2。
图12(A&B)GARS-特异性T细胞与GADS和药物产品(DP)批次的交叉-反应性。从用250Ag GARS+CFA免疫的小鼠制备LN细胞的原代培养物。将GARS-特异性T细胞对另一GADS批次(图12A)，与GADP批次和与甘露糖醇(图12B)的反应和对GARS批次的反应相比较。通过ELISA测量培养基中IL-2的水平。
图13通过胰蛋白酶的GARS蛋白酶解的动力学。通过胰蛋白酶将GARS蛋白酶解指示的时刻。通过体外功效试验检测蛋白酶解的样品的活性。
图14在通过胰蛋白酶蛋白酶解之前和之后GA的反相高效液相色谱(RP-HPLC)。通过胰蛋白酶蛋白酶解GARS，通过RP-HPLC检测样品的色谱曲线。
图15通过胰凝乳蛋白酶GARS蛋白酶解的动力学。通过胰凝乳蛋白酶蛋白酶解GARS指示的时刻。通过体外功效试验检测蛋白酶解的样品的活性。
图16在通过胰凝乳蛋白酶蛋白酶解之前和之后GA的RP-HPLC。通过胰凝乳蛋白酶蛋白酶解GARS，通过RP-HPLC检测样品的色谱曲线。
详细描述本发明提供测量试验批次的醋酸格拉默的功效(相对于参考批次的醋酸格拉默的已知功效)的方法，其包含a.用预定量的来自参考批次的醋酸格拉默免疫8-12周龄的雌性(SJLXBALB/C)F1小鼠；b.在免疫9-11天后制备来自步骤(a)小鼠的淋巴结细胞的原代培养物；c.分别温育至少5个参考样品，其中每个包含预定量的来自步骤(b)原代培养物的细胞和预定量的来自参考批次的、1μg/ml-25μg/ml的醋酸格拉默；d.温育至少2个样品，其中每个包含预定数量的来自步骤(b)原代培养物的细胞和预定量的来自试验批次的醋酸格拉默；e.对于步骤(c)和(d)中的每个样品测定在温育该样品18-21小时后在每个样品中由细胞分泌的白细胞介素-2的量；f.将由与试验批次的醋酸格拉默温育的样品分泌的白细胞介素-2的量与由与参考批次的醋酸格拉默温育的样品分泌的白细胞介素-2的量关联，以便测定试验批次的醋酸格拉默相对于参考批次的醋酸格拉默的功效，其中在步骤(c)和(d)的每个样品中，预定的细胞数量基本上相同，并且其中对于包含预定量的试验批次的醋酸格拉默的每个样品，存在相应的参考样品，其含有基本上相同的预定量的来自参考批次的醋酸格拉默。
在一个实施方案中，在步骤(d)中分别温育6个参考样品。
本发明还提供测量试验批次的醋酸格拉默的功效(相对于参考批次的醋酸格拉默的已知功效)的方法，其包含a.用预定量的来自参考批次的醋酸格拉默免疫试验动物；b.在免疫后预定时间制备来自步骤(a)试验动物的细胞的原代培养物；c.分别温育至少2个参考样品，其中每个包含预定数量的来自步骤(b)原代培养物的细胞和预定量的来自参考批次的醋酸格拉默；d.温育至少2个样品，其中每个包含预定数量的来自步骤(b)原代培养物的细胞和预定量的来自试验批次的醋酸格拉默；e.对于步骤(c)和(d)中的每个样品测定在温育该样品预定时期后在每个样品中由细胞分泌的细胞因子的量；f.将由与试验批次的醋酸格拉默温育的样品分泌的细胞因子的量与由与参考批次的醋酸格拉默温育的样品分泌的细胞因子的量关联，以便测定试验批次的醋酸格拉默相对于参考批次的醋酸格拉默的功效，
其中在步骤(c)和(d)的每个样品中，预定的细胞数量基本上相同，并且其中对于包含预定量的试验批次的醋酸格拉默的每个样品，存在相应的参考样品，其含有基本上相同的预定量的来自参考批次的醋酸格拉默。
在一个实施方案中，细胞因子是白细胞介素。
在一个优选实施方案中，自细胞介素是白细胞介素-2。
在另一实施方案中，白细胞介素是白细胞介素-6。
在另一实施方案中，白细胞介素是白细胞介素-10。
在另一实施方案中，细胞因子是γ-干扰素。
在一个实施方案中，哺乳动物生产对醋酸格拉默参考标准特异性的T细胞。
在另一实施方案中，哺乳动物是啮齿动物。
在还有另一实施方案中，啮齿动物是小鼠。
在另一实施方案中，小鼠是雌性(SJLXBALB/C)F1小鼠。
在另一实施方案中，哺乳动物是约8至约12周龄。
在还有另一实施方案中，细胞是淋巴结细胞。
在一个实施方案中，细胞是脾细胞。
本发明另外提供制备一批作为药用可接受的醋酸格拉默的方法，其包含a.制备一批醋酸格拉默；b.按照权利要求1的方法测量批次的相对功效；和c.如果如此测量的相对功效是参考批次的醋酸格拉默的80％-125％，使批次具有作为药用可接受的资格。
另外，本发明提供制备药用可接受的醋酸格拉默的方法，其包含a.制备一批醋酸格拉默；b.按照权利要求3的方法测量批次的相对功效；和c.如果如此测量的相对功效是参考批次的醋酸格拉默的80％-125％，使批次具有作为药用可接受的资格。
因此，本发明提供GA功效的测量的标准化。功效试验定量地测定GA的生物活性。这是至今第一次显示这种试验。为了显示批次之间关于DS和DP的功效和质量的再现性，该标准化方法是关键的。在本申请的上下文中，DS是指活性成分，即GA。DP用来表示成品，即Copaxone。RS表示平均分子量约7000Da批次的醋酸格拉默。
本发明利用观察即与细胞因子例如IL-2温育的T细胞响应该细胞因子增殖(Lisak等，1974)。
以下实施例详细描述本发明，其关于显示如何可以制备其某些特定的代表性的实施方案，材料，装置和处理步骤应当理解为仅意欲是说明性的实例。尤其是，本发明意欲不受限于本文具体引用的方法，材料，条件，工艺参数，装置等。
实验实施例常规方法概述用CFA中的250Ag GARS免疫小鼠。如美国专利5,800,808或PCT国际出版物WO 00/05250生产GARS。基于在上述Copaxonee的中列数(midrange)中的化学和生物性质选择GARS。在9-11天后，制备LN细胞的原代培养物，将细胞与不同浓度的GARS和试验样品温育。在37℃下在湿润CO2培养箱中温育18-21小时后，收集培养物并通过ELISA测量IL-2的水平。在2种浓度下测试T细胞对每个DS批次的反应(在线性范围内)，相对于GARS批次计算DS批次的％功效。
实施例1标准方法目的本方法的目的是使用GARS-特异性T细胞体外测定GADS批次的相对功效。
装置层流通风橱，血细胞计数器，一次性盖玻片，细胞计数离心机，温控振荡培养箱，湿润、温控5％CO2培养箱，ELISA读出器(450nm滤色片)，冷冻机，冷冻机剪刀，镊子，分档器，pipettman 40-200μl，pipettman 200-1000μl，pipettman 5-40μl，powerpette，无菌玻璃注射器和luer桥(bridge)。
一次性用品Cryotubes，96-孔增强结合ELISA板(Nunc，目录号442404)，96-孔未消毒微量培养板(Falcon目录号3911)，24-孔平底无菌组织培养板(Nunc，目录号143982)，培养皿，Eppendorf管(聚丙烯)，无菌移液管管头200-1000μl，移液管2，5&10ml，实验室外套，手套，0.2μ醋酸纤维素滤器，过滤的系统200ml(Corning，目录号430767)，Kim抹布，支持平台，10ml注射器，21Gxl 1/2″针，胰岛素注射器和注射器式吸嘴(combitip)5ml。
材料和试剂用于免疫方法95％乙醇(Bio Lab，目录号13680605，或等价物)，通过用蒸馏水稀释从95％乙醇制备的70％乙醇，磷酸盐缓冲盐水(PBS)x1(SIGMA，目录号3813，或等价物)，含有1mg结核杆菌(MT)的CFA(H37Ra，ATCC255177)，(SIGMA，目录号F-5881，或等价物)，和GARS批次。
用于体外生物测定方法95％乙醇(Bio Lab，目录号13680605，或等价物)，通过用蒸馏水稀释从95％乙醇制备的70％乙醇，锥虫蓝(BDH，目录号3407)，DCCM1(合成细胞培养基)(Beit Haemek，目录号05-010-A或等价物)，RPMI 1640(Roswell Park记忆研究所)(Beit Haemek，目录号01-100-1A)，无菌L-谷氨酸2mMx100(Bio Lab，目录号13.015)，无菌MEM(极限基本培养基)-非必需氨基酸x100(Bio Lab，目录号11.080)，无菌丙酮酸钠1mMx100(Bio Lab，目录号13.016)，抗生素/抗真菌溶液1(Bio Lab，目录号13.020)，2-巯基乙醇(SIGMA，目录号M-7154)，PBS(SIGMA，目录号3813)，concavalin A(ConA)(SIGMA，目录号C-5275)，MBP(髓磷脂碱性蛋白)肽(87-99)(BACHEM，目录号H-1964或等价物)，和GARS。
用于ELISA通过ELISA试剂盒测量IL-2OptEIATMSet小鼠IL-2(Pharmingen，目录号2614KI，或等价物)。
动物使用8-12周龄的雌性(SJLXBALB/C)F1小鼠，尽管也可以使用来自其它来源的8-12周龄的雌性(BALB/C)F1小鼠。在无特定病原物(SPF)的条件下保持动物的住宿和养护条件。
表1制备溶液的方法
免疫在无菌条件下，即在层流通风橱中使用无菌装置和材料制备在CFA中的免疫GARS乳剂。
GARS溶液的制备准确称量约15mg GARS并溶解在无菌PBS中至5mg/ml的浓度。
GARS乳剂的制备混合等体积的GARS溶液(5mg/ml)和CFA。将混合物转移至通过luer桥与第二个玻璃注射器连接的无菌玻璃注射器中。通过从一个注射器转移至另一注射器将混合物充分混合直至混合物充分乳化。当一滴乳剂漂浮在水上而不分散时证实稳定的乳剂。
注射将GA RS乳剂转移至胰岛素注射器。然后将100μl乳剂(每只小鼠250Ag GA)注射到每只稚鼠的4个脚垫中(每个脚垫中约25μl)。在免疫以后9-11天将免疫的小鼠用于体外试验。
LN细胞原代培养物的制备在免疫以后9-11天按照下列方法制备LN细胞的原代培养物去除LB细胞的外科手术方法在层流通风橱中开始工作之前将UV灯打开20分钟，当工作开始时关掉。在放置任何试剂在通风橱下之前，用70％乙醇溶液清洗工作表面。制备富集的DCCM1培养基。在使用前在37℃下预热富集的DCCM1和RPMI培养基。通过颈椎脱臼处死小鼠。将每只小鼠背向放置并固定在支架平台上。用70％乙醇喷雾腹部，进行中切(2cm-长切口通常足够)。将皮肤向后腿切割，从后腿和前腿定位LN。将LN转移至无菌的含有约5ml无菌RPMI培养基的平皿，通过无菌注射器柱塞挑出LN细胞。将无菌注射器用来从平皿中收集细胞悬浮液(通过使用无菌针避免组织碎片的收集)。将细胞悬浮液转移至50ml无菌管。
细胞计数用于计数来源于5只免疫小鼠的LN细胞的方法实例用RPMI培养基装满细胞管至40ml。在200xg下在室温(15-25℃)下离心LN细胞10分钟。用40ml RPMI再悬浮沉淀。在微量试验孔中用150μl 0.1％锥虫蓝稀释4倍的细胞悬浮液中每个抽取50μl的两个等分试样。通过轻轻上下吸取充分混合等分试样。用盖玻片覆盖血细胞计数器。使用50-200μl pipettman将两个等分试样加样到血细胞计数器的上腔和下腔中，每腔一种悬浮液。使混合物静置在腔中约2分钟。小心不将气泡引入腔中。使混合物(细胞悬浮液+锥虫蓝)覆盖整个腔表面。如果气泡存在腔中，或者如果它加样过多，彻底清洗血细胞计数器并用抹布干燥，将腔再次加样。
在上下腔的中心正方形(每个由25个大正方形和16个小正方形组成，参见图3)中对活细胞计数。活细胞不吸收锥虫蓝，因此特征是清澈的外观。然而，死细胞是锥虫蓝所能渗透的和显蓝色。出现在中心正方形边上的细胞仅仅如果细胞的一部分确实在中心正方形中才计数。如果细胞在边上，而根本不在中心正方形内部，不将它计数。使用下列方程计算细胞密度活细胞平均数(两个腔)×4×104＝细胞/ml将细胞在200xg下在室温下离心10分钟。用富集的DCCM1将细胞再悬浮至1×107个细胞/ml。
体外生物测定在24-孔的平底组织培养试验板中在1ml的终体积下进行体外生物测定。
GARS校准曲线的制备将1等分试样的1mg/ml GARS贮存液解冻。用富集DCCM1培养基将GARS贮存液稀释至100μg/ml(10倍)并过滤通过0.2μ醋酸纤维素滤器。如表2中实例所述，制备2-50μg/ml的使用富集DCCM1培养基的6个连续稀释的GARS溶液。
表2制备GARS稀释液的实例
GADS稀释液的制备准确称量来自待检测批次的约10-20mg GADS并用ddH2O稀释至1.2mg/ml。在275nm下测量减去溶液空白的OD。将样品的OD用ddH2O调整至约1.03以获得1mg/ml的GA贮存液。用富集DCCM1制备100μg/ml的贮存液并过滤通过0.2μ醋酸纤维素滤器。对于RS批次如表2所述将贮存液稀释至10μg/ml和20μg/ml。
测定反应将下列各项加入24-孔平底组织培养板(参见以下平板模板的实例)GARS0.5ml LN细胞(终密度，例如，5×106个细胞/孔)。
0.5ml每种GARS稀释液，因此在各孔中GARS的终浓度为25，15，10，5，2.5和1μg/ml。
GADS样品0.5ml LN细胞(终密度，例如，5×106个细胞/孔)。
0.5ml每种样品稀释液，因此在孔中试样的终浓度为5和10μg/ml。
每个测试包括下列对照1)阴性对照-与对照肽温育的LN细胞
0.5ml LN细胞(终密度5×106个细胞/孔)0.5ml在富集DCCM1中的MBP肽溶液(20μg/ml)(终浓度10μg/ml)2)阳性对照-用ConA(非特异性T细胞刺激剂)刺激的LN细胞0.5ml LN细胞(终密度5×106个细胞/孔)0.5ml在富集DCCM1中的ConA(5μg/ml)(终浓度2.5μg/ml)平板模板的实例
GARS*-醋酸格拉默参考标样根据它们对GA的反应改变细胞的密度。将培养物保持在37℃下在湿润的5％CO2培养箱中18-21小时。在200xg下在室温下将平板离心10分钟。将上清液收集在cryotube中。将上清液分成工作等分试样以避免样品重复冷冻/解冻。将上清液保存在-20℃下达1周。用70％乙醇清洗通风橱并用Kim抹布干燥。去除手套，用立即消毒剂洗涤。
用于IL-2检测的ELISA所有检测的样品一式三份。每次平板运行(run)包括下列各项1)IL-2标准曲线-包括至少6种非零IL-2浓度。
2)空白+第一抗体，无IL-2标样，+第二抗体(零点)3)样品如下用富集的DCCM1稀释GARS，试样和对照的培养基a)1和2.5μg/ml GARS样品和阴性对照样品的2-倍稀释液；b)5-25μg/ml GARS样品和试样的5-10倍稀释液；和c)阳性对照样品(ConA)的15-20倍稀释液。
按照制造商的推荐进行测量IL-2水平的ELISA方案。如果任何样品的光密度到达平板读出器的上/下限，分别在较高/较低稀释度下重新分析样品。
计算和验收标准ELISA测量将平均吸光度从标样，样品和对照中减去空白样品(零IL-2标准点)，对于每组三份计算平均值(吸光度-空白)，标准偏差(SD)，和相对标准偏差(RSD)。
样品重复只要存在可疑的异常值，必需确保异常值基于统计学上的，以便阐明任何潜在的可能影响总结果的问题。如果一式三份测量之间的RSD高于10％并且平均OD-空白＞0.300，使用Dixon Q-检验实行异常值剔除。当在基于一式三份的测试中不满足相关的验收标准时使用Dixon Q-检验剔除可能的异常值。异常值检验仅可适用于相同标准溶液的重复测量。对于小于10次的观察，仅能够测定和排除1个异常值。该方法可能扩展Dixon Q-检验在从3-7之间任何数目的重复测量中剔除异常值中的使用，置信水平为95％。
方法将可疑的异常值称为X1。参考可疑的异常值标记所有其它的测量值，例如X2是可疑异常值的下一个值，X3是离可疑异常值的第二个值，Xk离可疑异常值最远，Xk-1可是第二离最远的值等。
对于3-7次重复，使用下列方程X2-X1/Xk-X1。
表3k值
如果通过Dixon Q-检验未鉴定出异常值但是3次重复中的2次之间的差异不超过10％，将最靠近的2次重复用于计算％功效。否则，对该样品重复ELISA试验。
实行从OD＜0.300(空白，阴性对照和低标准点)的样品中的样品剔除。当确定异常值时，将它剔除和报告。将一式两份测量用于％功效的计算。
空白样品每个空白样品的吸光度≤最高浓度的IL-2标样的平均吸光度的10％。如果空白重复之一超过上述范围，剔除它并使用一式二份样品。
IL-2标准曲线按照制造商的推荐将IL-2标准曲线作图。如果6个非零浓度的IL-2标样的最小值保留在曲线中，可以剔除显示差灵敏度或样品处理误差的IL-2标样。后推-计算的(back-calculated)标准浓度对于较低的校准点具有大于20％的相对误差(RE)，对于所有其它浓度15％。从覆盖期望浓度的至少6个非零浓度的点(至少17个校准点)构建IL-2校准曲线。如果高或低浓度失败，标准曲线范围能够被截短。线性回归曲线的R2≥0.97。
测定对照使用线性回归曲线的方程，从IL-2标准线性回归曲线计算所有样品中IL-2的浓度。通过乘以样品稀释因子计算在所有样品中IL-2的终浓度。
阴性对照(MBP肽)
阴性对照样品3次重复中至少2次中IL-2的终浓度低于对于GARS曲线最低校准点测量的IL-2水平。
阳性对照(ConA)阳性对照样品3次重复中至少2次中IL-2的终浓度类似或高于GARS曲线最高校准点的IL-2的水平。
GADS批次相对功效的计算GARS曲线以对数-对数的标度，以对数IL-2浓度为y轴和以对数GARS浓度为x轴绘制GARS曲线。从至少5个非零浓度构建校准曲线(至少14个校准点)。如对于IL-2标准点所述剔除校准点。通过标准点计算最佳拟合回归曲线。R2≥0.97。斜率(β)≥0.77。
平行性分析以对数-对数的标度，以对数IL-2浓度为y轴和以对数GADS浓度为x轴绘制每个试样的剂量-反应曲线。通过样品点计算最佳拟合回归曲线。斜率(β*)在下列范围内β×0.635≤β*≤β×1.365如果β*在范围外，一式二份重复体外试验(两次分开的样品制备)。如果在一次重复试验中β*失败，剔除该批次。如果在两次重复试验中β*在范围内，测定％功效和95％的置信范围。
％功效和置信范围的评估通过使用ANOVA获得用于确定置信范围(其具有包括“真实功效“的95％概率)的随机误差的估计。该统计计数将观察的反应的总差异分成独立的部分，即
由于分别与线性和平行性的非显著的偏差，部分3和4包括在随机误差项中。将总平方和分成3部分(SS-回归，SS-制剂和SS-误差)，适当的自由度数和显著性的F-检验。
如下所述计算试验批次的％功效和对于估计的功效的95％置信范围计算相对功效和95％置信范围的计算算法步骤1计算给定数据转化成log10标度Yki＝log10(反应ki)；i＝1，...nkXki＝log10(剂量ki)；i＝1，...，nk其中k＝1，2分别是GA批次和GA.RS的制剂下标；n1和n2是分别对于GA批次和GA.RS进行的测量总数。
因此，N＝n1+n2是观察的全部总数。
步骤2通过下式基于所有测量的数据点计算对于线性回归的共同斜率β=Σj=1N(Yj-Y‾)·(Xj-X‾)Σj=1N(Xj-X‾)2;]]>其中Y是log10(反应)的总平均值；X是log10(剂量)的总平均值。
步骤3如下计算由于对log10(剂量)回归导致的平方和SSREG=β2·Σj=1N(Xj-X‾)2;]]>步骤4如下计算随机误差的平方和SSERR=Σk=12Σi=1nk[Yki-Y‾k-β·(Xki-X‾k)]2;]]>
其中Yk，Xk分别是制剂k的log10(反应)和log10(剂量)的平均值。
步骤5如下计算均方误差项DF误差(随机误差的自由度)＝N-3；MS误差＝SS误差/DF误差。
步骤6使用t-分布统计表以便发现t-统计的适当值t＝t(0.975，DF误差)。
步骤7如下计算相对功效的点估计 步骤8计算通过下式由C表示的表达式C=SSREGSSREG-MSERR·t2;]]>步骤9计算95％置信区间的上限和下限的对数Log10(Lower Limit)=C·Y‾1-Y‾2β-(X‾1-X‾2)-MSERR·C·tβ1n1+1n2+(Y‾1-Y‾2)2SSREG-MSERR·t2]]>Log10(Upper Limit)=C·Y‾1-Y‾2β-(X‾1-X‾2)+MSERR·C·tβ1n1+1n2+(Y‾1-Y‾2)2SSREG-MSERR·t2]]>步骤10通过采用反对数获得的对数范围和乘以100％将在前述步骤中计算的值转换成原有标度。
GADS批次的估计功效不小于表明功效的80％和不超过125％。估计功效的误差置信范围(P＝0.95)不小于表明功效的70％和不超过43％。如果批次在上述范围外，一式两份重复体外试验。如果两次重复试验的结果都在说明书的范围内，批次可接受。如果一次重复试验失败，剔除该批次。
记录记录LN细胞计数和ELISA平板模板。将原始ELISA读出器记录和结果表格归档。
实施例2实施例1的标准方法的发展实验2A从GARS-特异性T细胞分泌的细胞因子的轮廓LN细胞来源于预先9-11天用在CFA中的250μg GARS免疫的雌性(SJLxBALB/C)F1小鼠，其在各种浓度的GARS的存在下培养。将细胞在37℃下在5％CO2湿润的培养箱中与GARS温育18-24小时。随后，将培养物离心并收集上清液和通过ELISA测定细胞因子。
使用细胞因子特异性的生物素化的抗体和用于检测的偶联的链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(HRP)进行ELISA。每次板运行包括空白对照(不含细胞因子标样的第一和第二抗体)。每次板运行还包括质量控制(QC)样品(在测定线性范围内3种浓度的细胞因子标样)。每个体外试验包括阳性对照(ConA，非特异性T-细胞刺激剂)和阴性对照(无GA或其它任何抗原)。所有细胞因子在温育18-24小时后测量。在温育72小时后再次检测TGF-β，IL-10和IL-4的水平。结果在表4中显示。
表4细胞因子轮廓
在表4中，对于每种细胞因子测量的最大水平以任意单位表示(-)＜检测范围；(+)高达大约400pg/ml；(++)＞400pg/ml。表4显示响应培养物中的GARS，LN细胞分泌IL-2，INF-γ，IL-10和IL-6，而TNF-α，IL-4，IL-13和TGF-β在培养基中未检测到。这些结果显示通过GARS-特异性T细胞生产的细胞因子是属于Th0类型。应当注意在不同免疫方案，即用IFA或用低剂量GA免疫中观察到Th0轮廓。
因为IL-2是T细胞激活的好标记，并且因为响应GARS的IL-2分泌非常可重复，具有线性的剂量-反应关系，IL-2似乎是测量T细胞激活的最佳细胞因子。
实验2B免疫方法的优化进行几个实验以确定最佳免疫方案。第一个实验检测在LN中和在脾中GARS(免疫抗原)剂量对T-细胞反应的影响。用CFA中的250μg GA(组1)(如在EAE封闭试验中)或在CFA中的10μg GA免疫2组每组10只小鼠。从免疫小鼠的LN和脾制备原代培养物。将培养物与各种剂量的GARS温育过夜，之后如实验2A收集培养基并测定IL-2。图4中的结果清楚地表明在两个免疫方案中，与从脾细胞分泌的那些相比从LN细胞分泌的IL-2的水平高。基于这些结果决定将LN细胞的原代培养物用于测定。另外，注射到小鼠中的GARS的剂量不影响培养物中的T细胞反应。无论GARS的免疫剂量，LN和脾细胞分泌相似数量的IL-2。这表明免疫方法是稳固的，甚至GARS免疫剂量的较大变化也不影响免疫结果。
为了进一步优化免疫方案，一组注射在CFA中的250μg GARS，第二组用ICFA中的10mg GA注射。因为使用ICFA，一种较弱的佐剂，第二组中GARS的剂量较高。10天后，体外检测来自两组的LN细胞对GARS的反应。图5显示尽管使用低得多的剂量，用在CFA中的250μg GARS免疫在培养物中诱导强得多的反应。
基于这些发现，和250μg/小鼠的CFA中的GA在阻断EAE(在该小鼠品系中EAE的至少80％阻断)方面非常有效的事实，250μg/小鼠的CFA中的GA似乎是最佳剂量。
在用CFA单次免疫后，通常在约10天内产生特异性的T细胞。图6显示在免疫后9，10和11天制备的培养物中LN细胞对GARS的反应。因为IL-2分泌的剂量-反应在所有各天类似，免疫周期可以持续9-11天。
实验2C体外试验条件的优化进行几个实验来确定体外反应的最佳方案。这些研究包括培养条件，温育时间的优化，在试样中IL-2的稳定性和GARS在-20℃下的稳定性。
i)培养基通常在补充1％正常小鼠血清的RPMI培养基中保养小鼠淋巴细胞的培养物。正常小鼠血清可以包含内源性IL-2，其可以通过在ELISA试剂盒中使用的抗-小鼠IL-2单克隆抗体检测。另外，不同大量的正常血清的使用可能增加体外试验的日间变化。为了避免与内源性IL-2的交叉感染，和为了减小该方法的日间变化，在4种不同培养基中检测GA-特异性的T细胞反应1)RPMI+1％正常小鼠血清(NMS)；2)RPMI+1％胎牛血清(FBS)(牛IL-2不被在ELISA试剂盒中使用的抗小鼠IL-2识别)；3)Biotarget(由BeitHaemek，以色列专门生产的无血清培养基)；4)DCCM1(由不同制造商生产的无血清培养基)。
图7显示代表性实验的结果，该实验比较在不同培养基中LN细胞对GARS的反应。当使用无血清培养基时观察到最好的反应。在缺少血清下剂量-反应范围左移。这可以通过先前显示GA与白蛋白和其它血清蛋白结合的研究解释。该结合可以降低培养物中GA与APC相互作用的可用性，因此要求更高浓度的GA来刺激T细胞。基于这些结果，最佳培养基似乎是DCCM-1培养基。
ii)IL-2分泌的动力学IL-1是自分泌和旁分泌生长因子，其对于克隆T-细胞增殖和B细胞及巨噬细胞的功能性质是必需的。在用GARS刺激培养物以后，通过激活的GA-特异性T细胞分泌IL-2并随后被LN细胞消耗。进行IL-2分泌的热力学研究试图确定在用GA刺激后收集上清液的最佳(峰)时间。在湿润的CO2培养箱中在37℃下培养LN细胞并与不同浓度的GARS温育。在图8所示的时间间隔中，取样等分试样并通过离心去除细胞。将上清液保存在20℃，在实验结束时用于通过ELISA测定。
图8显示在培养基中IL-2水平的峰在18-21小时之间。从24-48小时收集的样品中的IL-2水平的降低可以通过LN细胞的IL-2消耗来解释。因此，上清液收集的最佳时间似乎是在温育18-21小时后。
iii)细胞因子的测量本方法依赖于GARS样品和试样中IL-2的准确测量。在实验期间，通过OptEIA(Pharmingen，目录号2614KI)-对于小鼠IL-2特异性的ELISA试剂盒来测量IL-2的水平。该ELISA试剂盒非常灵敏并且结果准确和可重现。
iv)在-20℃下试样中IL-2的稳定性在大部分进行的实验中，在通过ELISA分析之前收集培养基并保持在-20℃。IL-2在培养基中稳定性的初步研究表明细胞因子在-20℃下稳定1周(图9)。因此，在测量IL-2之前体外试样的培养基可以保持在-20℃下达1周。该试验的结果还显示ELISA结果是重现非常好的--在隔1周的不同两天进行的两次ELISA板运行中在样品中测量的IL-2水平几乎相同。
v)GARS溶液在-20℃下的稳定性为了检验GARS溶液在-20℃下的稳定性，在制备后即刻和在-20℃下贮存5个月后检测GARS溶液的剂量-反应。图10显示在-20℃下贮存5个月之前和之后GARS溶液的剂量-反应曲线几乎没有差异。因此，可以制备GARS溶液的等份试样并在使用前保存在-20℃下至少5个月。
实验2D确定GARS校准曲线的线性范围基于对于接受分析的21个板中的每一个分别计算和评估的GARS校准曲线进行统计学有效性检查。这些21个样品是在约4个月的期间内的不同时间收集。给定板的GA浓度范围为0.25-50μg/ml。下列源于GARS校准曲线的有效性特征构成分析的主要方面
1.最佳转换以确保线性范围的更宽范围；2.测定线性范围极限；3.接受校准曲线的总标准；4.评估测定准确度和精度；5.评估一式两份的可靠性(参见以下段落)。
实验性质如此以致在每个校准点典型地有3个重复(一式三份)。然而，在一些情形下，当不能提供一式三份的测量时，一式两份的可靠性的评估变得关键。
GA剂量-反应关系的线性以下提供的有效性讨论的大多数方面的基础是将IL-2浓度(pg/ml)与GA浓度(μg/ml)相关联的线性回归模型。该关系的线性假设对于线性回归模型的适当拟合是必需的。以线性-线性标度将数据作图。将相同的关系转化成对数-对数标度，以及对数-线性标度，和对数-平方根标度。对数-对数转化显示最适合的线性特征。因此，选择的回归模型形式是对数-对数的一种Log10(IL-2浓度)＝α+β*Log10(GA浓度)+误差反应变量是在每个校准点测量的3次重复的对数-转换平均值。将该模型与每个校准样品拟合并对于每个拟合曲线计算适当的统计学(R2，截距，和斜率)。R2值通过下式反映残差平方和(RSS)与总平方和(TSS)的比率R2＝1-RSS/TSS线性范围确定基于下列标准确定线性范围1.绘制的Log10(IL-2浓度)比Log10(GA浓度)的目视检查；2.回归影响诊断，如在距离统计学(distance statistic)领域中已知的Cook’s；3.对于几个潜在的线性范围定义的校准曲线计算的精度和准确度值的差异评估提供线性关系的视觉评价。没有在选择的1-25μg/ml线性范围内部非线性关系的证据。
实验2EGARS标准曲线的测定在选择的线性范围极限(1-25μg/ml)拟合的源于GARS校准曲线的有效参数测定如下1.对于研究中每个板的Log10(IL-2浓度)对Log10(GA浓度)的线性回归拟合的R2；2.这些直线拟合的斜率和截距；3.对于每个板对每个校准点计算的准确度；和4.对于每个板对每个校准点计算的精度。
为了计算准确度和精度，将每个校准曲线用于校准(后推计算)给定IL-2浓度值的GA浓度Xi-后推＝10(log10(IL-2Conc)i-α)/βi＝1，2，3-一式三份下标。
所用准确度的基本度量是一式三份样品中浓度估计的平均值和真实浓度之间的差异百分比不准确度＝([平均值(Xi-后推)-GA浓度]/GA浓度)*100％。
所用精确度的基本度量是一式三份浓度估计的浓度的相对标准偏差(RSD或CV)精度＝CV(Xi-后推)＝[标准偏差(Xi-后推)/平均值(Xi-后推)]*100％。
分析的目标是为拟合校准曲线提议验收标准，确保方法的准确度和精度是充分的。验收标准是基于R2和GARS校准曲线的斜率。通过小的不准确度值(＜13％)和通过好的精度(1.1％-6.7％)可以表征约80％的板。对于这些16条“表现良好”的标准曲线，获得下列结果1.高R2值(＞0.98)；2.比较高的斜率值，反应剂量反应关系(在16个板中的15个中＞0.78)。
因为与具有较低R2值(平均值＝0.94)和相当平的斜率(平均值＝0.72)排除的板形成对比，大部分校准曲线的特征在于比较高的R2值(平均值＝0.99)和比较陡的斜率(平均值＝0.87)，在R2和斜率方面考虑校准曲线的总验收标准。确定接受参数的简单规则是分别基于斜率和R2截止点的计算并将它们定位在拒绝曲线的最大值(最大R2＝0.95最大斜率＝0.77)和接受曲线的最小值(最小R2＝0.98最大斜率＝0.77)之间。因此，如下得出验收标准1.R2≥0.97；2.斜率≥0.77。
将这些标准应用于在1-25μg/ml GA浓度范围内拟合校准曲线的至少5个不同(一式三份)浓度。另外，截距值的范围为1.42-1.78，平均值＝1.58。该范围对于16个合格的和5个去除的平板类似。
对于每条曲线和对于板上那些中的各个浓度计算准确度和精度。这些单独的值(对于每条曲线和每个浓度)也在以下各项上平均1.每条曲线的不同浓度；2.每个浓度的不同曲线；和3.在所有曲线和浓度上。
有关结论是对于基于在线性范围1-25μg/ml内至少5个不同校准点的GARS校准曲线，当将校准曲线限制为具有R2≥0.97和斜率≥0.77，得到的平均准确度和精度估计如下1.方法的平均(±SD)准确度值是8.0％±2.3％；并且2.方法的平均(±SD)精度值是2.9％±1.7％。
基于一式两份的GARS校准曲线的可靠性评估为了评估在每个校准点使用一式两份测量拟合的GARS校准曲线的可靠性，进行测定的准确度和精度描述性统计的比较。另外，对于在给定一式三份中所有3种可能的一式两份测量的选择，研究单个的准确度和精度值(对于每条曲线和每个浓度)。当在满足在先前部分中所述验收标准并且在确定的线性范围1-25μg/ml的极限内的那些曲线上集中时，明显的是当由于某些原因不能提供一式三份测量时，可以成功地用一式两份测量替代。
表5准确度和精度描述性统计总结
基于一式三份的方法的平均(±SD)准确度和精度分别是8.0％±2.3％和2.9％±1.7％(表5)。
基于一式两份的方法的平均(±SD)准确度和精度是1.准确度8.1％±2.8％；精度2.5％±1.7％；2.准确度8.0％±2.5％；精度2.9％±2.1％；和3.准确度8.4％±2.8％；精度2.4％±1.5％。
实验2F统计学关系的测定发现方法的平均(不)准确度为8.0％，SD＝2.3％。目标是发展用于新GA批次与GARS的两条对数(剂量)-对数(反应)直线的斜率比较的可靠性检验。检验考虑上述方法的(不)准确度。方法平均(不)准确度的约95％个别容许区域的最高极限用作阈值平均值+2*SD＝12.6％。因此，在范围±12.6％内的变化被认为是非显著的。
如下是β*(批次直线的斜率)，β(标准直线的斜率)和最高允许(不)准确度值之间的关系的完整数学解释。未失去一般性，将仅证明其中β*＞β的情形(由于存在对称性，扩展到β*＜β的情形的证据是明显的)。对于给定log(反应)的后推-计算剂量值为X后退＝10(Y-α)/β，其中Y＝log10(IL-2浓度)。
(不)准确度计算的式子为(不)准确度＝[(10(Y-α)/β-X真实)/X真实]*100％。
Y低和Y高是可容许的±12.6％(不)准确度允许的最低和最高log(反应)值。
因此，接受斜率相等的假设的区域是 因此，斜率相等的边界是 直线的斜率计算如下β*＝(Y高-Y低)/(logX2-logX1)＝[β·log([X2/X1]·[1.126/08.74])]/log(X2/X1)β＝[β·log(1.288)]/log(X2/X1)＝β·(1+log(1.288)/log(X2/X1))假设在考虑X2/X1＝2(对于5和10μg/ml的剂量水平)下的特定情形，如下计算β*β*＝β·(1+log(1.288)/log2)＝β·1.365将该结果与对于其中β*＜β的对称情形获得的结果结合，如下计算范围 在给定数据中，所有斜率在匹配的临界范围内，意味着未观察到从平行行假设的偏差。
一旦接受批次为统计学有效(已经证明线性和平行性的存在)，估计试验制剂相对于标样的功效比率。这通过将平行直线与数据拟合和确定它们之间的水平距离在平行线测定中完成M=logρ=Y‾T-Y‾SB-(X‾T-X‾S);]]>其中ρ表示功效，Ys，YT，Xs，XT分别是标样和试验制剂的平均log(反应)和log(剂量)。B-是标样和试验log(剂量)-log(反应)直线的共有斜率。共有斜率-B的最小平方估值是分别来自标样线和试验线的两个斜率的最小平方估值的加权平均。采用上述表达式的反对数，能够获得试验制剂相对于它标样的“真实％功效”的点估计 实施例3实施例1的标准方法的有效性以下显示的分析的目的是确定GA批次相对功效的有效释放规定。如果满足基于统计推断的下列标准，GA批次认为有效1.未违反包括在生物测定分析方法中的下列假设(a)log(反应)的独立性和正态性；(b)log(反应)方差的均匀性；(c)无异常值；(d)平行性(斜率比率检验的非显著性)2.相对功效的点估计在预先规定的范围内80％-125％；并且3.“真实相对功效”值的95％置信范围在更广的预先限定的置信范围内70％-143％。
该模型假设标样和试验制剂应当表现为似乎一个是另一个的简单稀释。这意味着对于两种制剂的log(剂量)-反应线应当不显著偏离线性和平行性。因此，这些直线之间的常数水平位移的反对数能够作为功效比率的估值。这两个要求，线性和平行性，构成测定有效性的概念。有效性的检查是估计相对功效和它的置信范围的前提。
为了计算相对功效真实值的置信范围需要估计随机误差。这个度量是通过实行称为“方差分析”(ANOVA)的统计技术而获得。因此，必须已经满足ANOVA的常规统计学假设。如下是平行线生物测定模型的统计学分析的要求1.关于它们的期望值反应是独立正态分布；2.反应的方差不受反应平均值的影响；3.不存在异常值；4.log(剂量)和反应之间的关系能够由跨越剂量范围的直线表示；和5.试验制剂的直线与标样的直线平行。
批次分析数据获自由不同操作者在不同天进行的不同实验。通过一系列实验进行实施例1的标准方法的有效性试验，所述实验每个包括1)用CFA中的250μg GARS免疫小鼠；2)在免疫后9-11天从LN细胞中制备原代培养物；3)将LN细胞与不同浓度的GARS和试样温育；4)收集培养基并通过ELISA分析IL-2水平；5)基于在1-25μg/ml的6个剂量水平进行的一式三份的IL-2测量绘制GARS曲线；和6)在线性范围内的两个浓度(5和10μg/ml)下比较对每个试样的T细胞反应与对RS批次(一式三份)的反应。还对每个一式三份计算％CV以便检测与一式三份之间的变异性有关的任何问题(通常，一式三份之间的％CV应当不超过10-15％)。对于给定数据，未检测到违反条件。
用于提供分析方法能力的总的认识的有效性特征是线性，范围，准确度，精度，特异性和稳定性。有效性的标准和分析是基于ICH共同准则，“分析方法的有效性方法学”，1996年11月(CPMP/ICH/281/95)。为了分析目的将在“欧洲药典”指南中推荐的统计学方法适用于给定数据。
实施例3A线性和范围在每个体外试验中，将GARS批次的剂量-反应曲线用于计算细胞对试样的相对反应。每条校准曲线包括至少5个点(无零点)。从在发展和有效性检查阶段期间进行的不同体外试验中收集21条校准曲线，对于每个板作图和评估。
数据的统计学分析显示log10(IL-2浓度)对log10(GARS浓度)的作图提供最好的线性拟合。线性范围主要通过目视检查和校准点的准确度和精度评估而出现。对于每个一式三份计算％RSD以便检测与一式三份之间变异性有关的任何问题(通常一式三份之间的％RSD应当不超过10-15％)。GARS曲线的范围规定在1-25μg/ml之间。
基于这些分析，GARS曲线应当由至少6个校准点组成，一个浓度为零(阴性对照)，和在1-25μg/ml范围内的至少5个GARS浓度。log10(IL-2浓度)对log10(GARS浓度)的线性回归应当具有R2≥0.97和斜率≥0.77。
实验3B准确度跨越GARS曲线的指定线性范围确定方法的准确度。数据的统计学分析显示方法的平均准确度为8.0％±2.3％。
实验3C精度所用精度的基本度量是浓度重复(通常一式三份)估值的相对标准偏差(RSD)。
跨越GARS曲线的线性范围确定RSD。数据的统计学分析显示方法的平均精度是2.9％±1.7％。一式两份测量的可靠性等同于一式三份。因此，当三次重复之一被鉴定为异常值，忽略异常值并接受来自一式两份测量的结果。
实验3D方法重现性在相同的体外试验中重复3次测量对GADS批次的GA特异性T细胞应答。将相同批次的3个重量每个稀释至5和10μg/ml并与GA-特异性T-细胞温育。通过ELISA一式三份测量试样和GARS样品的培养基中IL-2的水平。相对于GARS计算细胞对每个一式三份的％功效和95％置信范围。表6显示对于每个一式三份计算的％反应。
制备有表1所示组成的液体，并评价沉淀的情况和铝的腐蚀。所用表面活性剂是磷酸辛基苯氧基聚乙氧基乙酯(Triton QS-44(UnionCarbide))。
各测试液都调至pH＝13.5备用。
铝腐蚀的测量方法使点涂于硅氧烷基体之上的2×2cm2尺寸的铝试样在35℃的50ml各测试液中浸泡5分钟。通过ICP(感应式高频等离子光谱测定法)测量溶于液体中的铝量。
液体稳定性的测量方法将测试液在45℃下储存规定的时间，目视评价沉淀的存在。
表1
由实验数据可见Ca沉淀和铝腐蚀取决于螯合剂的类型，1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸酯产生良好结果。
实施例12中，用螯合剂B-G代替螯合剂A时，获得与螯合剂A相同的良好结果。
实施例2用螯合剂A制备有表2所示组成的测试液，并评价沉淀的情况和铝的腐蚀。
表8方法重现性
基于上述实验，可以得出结论体外试验是可重现的。
实验3G特异性在3个水平上检测方法的鉴别1)与/不与GARS(基体效应(matrixeffect))温育的样品间的鉴别；2)GARS和其它相关和非相关蛋白质以及肽，包括GARS之间的鉴别；和3)GARS和GA相关共聚物之间的鉴别，在所述共聚物中肽序列被精心修饰。
i)GARS被GARS-特异性的T细胞识别(基体效应)通过用CFA中250g GARS免疫雌性(SJLxBALB/C)F1小鼠诱导GA-特异性的T细胞。该剂量的GA通常用于在该小鼠品系中使用EAE阻断试验检测GA批次的生物活性。该实验中的对照组仅用CFA注射。在免疫后10天，从两组小鼠中取出LN细胞。将细胞与GARS在37℃下在5％CO2湿润的培养箱中温育18-24小时。
随后，将培养物离心，收集上清液并通过ELISA测定白细胞介素-2(IL-2，从激活的T细胞分泌的细胞因子)，所述ELISA使用生物素化的对IL-2特异性的抗体和用于检测的链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(HRP)偶联物(图1)。每次板运行包括空白对照(不含细胞因子标样的第一和第二抗体)。每次板运行还包括质量控制(QC)样品(在测定线性范围内的3个细胞因子标样浓度)。每个体外试验包括阳性对照(ConA，非特异性T-细胞刺激剂)和阴性对照(无GA或其它任何抗原)。图2显示来自用GARS免疫的LN细胞依赖性地响应培养物中的GARS分泌IL-2剂量，而来自对照小鼠的LN细胞对培养物中的GARS无反应。阴性对照样品中的IL-2水平通常低于或接近ELISA检测极限(约3pg/ml)。这些IL-2水平通常低于GARS最低校准点(1μg/ml)分泌的水平。这些结果显示GA特异性T-细胞的IL-2分泌是GA依赖性的。
ii)相关和非相关抗原之间的鉴别通过检测GARS-特异性T细胞对不同抗原的体外反应证明相关和非相关抗原(蛋白质和单肽)之间的鉴别。LN细胞的原代培养物来源于提前9-11天用CFA中的250μg GARS免疫的雌性(SJLxBALB/C)F1小鼠。将原代培养物与GARS和各种其它抗原在37℃下在5％CO2湿润的培养箱中温育过夜。然后，如实验3G(i)将培养物离心，收集上清液并通过ELISA测定IL-2。
表9显示在本实验系统中GA-特异性T细胞对人MBP(髓磷脂碱性蛋白)，MBP免疫显性肽pp.87-99(致脑炎肽)，或它的类似物pp.87-99Ala96(EAE抑制肽)无反应。溶菌酶，一种非相关碱性蛋白质，也不被GA-特异性的T细胞识别。TV-35和TV-109是肽分子量分别为3757和11727的肽(PCT国际公开号WO 00/18794)。这些肽含有由与GA相同的4种氨基酸(Ala，Glu，Lys，Tyr)以与GA相同的摩尔比组成的确定的序列。GARS特异性LN细胞对TV-35无反应，与TV-109具有极低的交叉反应性。这些结果可以通过观察即用GARS免疫诱导具有针对GA中存在的多个T-细胞表位的不同特异性的T细胞的混合物形成来解释。然而，TV-35和TV-109可以与GA共享共有序列，GA-特异性的T细胞与单肽的温育可能仅导致培养物中小部分GA-特异性细胞的部分刺激。因此，总T-细胞反应(IL-2的分泌)低于或接近检测极限。
表9GARS-特异性LN细胞的特异性
1％功效＝抗原培养基中IL-2浓度×100/GARS培养基中的IL-2浓度体外试验对GA批次的平均分子量(MW)敏感。图11显示GARS特异性细胞对GARS(MW＝7900)和对平均MW不同的GADS各批次的反应。可以看出，反应通常与平均MW相关；平均MW越高，反应越大。然而，应当注意GADS平均MW的释放规定是4700-10000，响应具有规定内的平均MW的DS批次分泌类似水平的IL-2(图11)。这些结果说明方法对GA高度特异性并且对于GA平均MW的变化敏感。
iii)GARS-特异性T细胞对GA药物物质(DS)和Copaxone药物产品(DP)的识别在用CFA中250μg GARS免疫雌性(SJLxBALB/C)F1小鼠之后9-11天，取出LN细胞并与不同剂量的GARS批次(免疫抗原)和与DS批次一起培养。
如实验3G(i)测量IL-2。图12A显示LN细胞与两个标样批次交叉反应。两个批次的IL-2分泌的剂量-反应曲线(如上通过ELISA测量)类似，说明试验批次共有类似的T-细胞表位。GARS和Copaxone批次之间的比较显示GARS-特异性T细胞也与DP批次交叉反应，甘露糖醇，Copaxone制剂中的赋形剂不影响或干预T-细胞反应(图12B)。因此，该方法提供批次之间重现性的指示。
v)GA和相关共聚物之间的鉴别在实验3G(ii)中，使用它们平均分子量不同的GADS批次证明体外试验对GA肽的平均MW敏感。因为实验基于GA-特异性T细胞对GA的生物识别，其特异性地对线性序列反应，期望方法将对GA肽序列中的变异/修饰敏感。这通过使用下列各项证明1)由组成GA的4种氨基酸中的仅3种合成的共聚物；2)由在制备条件中精心修改得到的GA批次(XX)，即在合成期间将过量的游离氨基酸加入GA单体。该批次的平均MW高并超出规定(MW＝11150Da)；和3)通过用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶蛋白酶解获得的GARS的降解产物。
表10显示GA-特异性T-细胞对缺少赖氨酸，丙氨酸或酪氨酸的3种氨基酸共聚物不反应。另外，细胞对批次XX的％反应较高并超出方法规定(100±30％)，表明方法可能对生产方法的修改敏感。如所显示，高％反应还可以通过试验对GA肽的MW的敏感性来解释。
表10方法特异性
通过胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的GARS蛋白酶解的动力学研究表明体外试验对GA肽的降解敏感。图13和15显示经蛋白酶解时间后细胞的IL-2分泌减少，细胞对蛋白酶解的肽的％功效超出方法规定(100±30％)(表11)。降解样品的重叠色谱图(通过RP-HPLC)(图14和16)分别显示通过胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的蛋白酶解的动力学。所有特异性研究的累积结果显示方法对于GA是高度特异性的并且在GA和紧密相关的抗原之间鉴别。
表11方法特异性-蛋白酶解的影响
实验3G稳定性i)验收标准的稳定性通过比较对于重复GA批次获得的相对功效得到的估值检验确定验收标准的一致性和稳定性。批次分析数据包括许多重复GA批次。由不同操作者在不同3天测量两个批次。另外由不同操作者在不同2天检测一个批次。
在对于重复GA批次的平行性检验中，所有GA批次的斜率值在对于平行性斜率比率检验的适当临界范围内。所有GA批次满足具有95％置信范围的相对功效值的点估计的验收标准(估计的％功效在80％-125％的范围内并且95％置信范围在70％-143％的范围内)。对于重复GA批次的分析数据，它们的有效性不依赖于实验日或进行试验的操作者。这数据支持确定的规定的稳定性。
ii)免疫方法和体外反应的关键参数的稳定性评估免疫方法和体外反应的关键参数的稳定性。简短地，表明1)LN细胞的免疫反应不受GARS的免疫剂量的影响；2)免疫时期是9-11天；3)与脾细胞反应相比LN细胞对GARS的反应较高；4)用GARS+CFA免疫导致与用ICFA免疫相比具有更强反应的LN细胞；5)在培养基中血清的存在强烈影响GA-特异性的T细胞反应，因此体外反应在无血清培养基中进行；6)收集培养基的最佳期限是与GARS和试样温育18-21小时以后；和7)在ELISA检测以前培养基可以保存在-20℃下达1周。因此，表明方法是稳定的。
对于相对功效的点估计和95％置信范围的总结统计平均相对功效的95％容许极限为了评估估计的新批次相对功效的验收范围，计算单个log(功效)估值的平均值和标准偏差平均值(Mi)＝0.0074SD(Mi)＝0.0402基于分析的数据，相对功效平均值的约95％容许范围是[10平均值(Mi±2*SD(Mi))]*100％＝[84％，122％]。
相对功效95％置信范围的范围对于单个相对功效估值，95％置信范围的最小值和最大值是最小值(下限)＝79.3％最大值(上限)＝147.3％
验收标准的满足基于分析，确定验收标准为1.满足包括在生物测定分析方法中的假设，即(a)log(反应)的独立性和正态性；(b)log(反应)方差的均匀性；(c)无异常值；和(d)平行性(斜率比率检验的非显著性)2.估计的相对功效不小于标样功效的80％并且不超过其125％；并且3.估计相对功效的误差的95％置信范围不小于标样功效的70％并且不超过其143％。
实施例3的讨论体外试验的有效性显示方法是可重现的并且平均值的准确度和精度在可接受的范围内。方法对GA肽是高度特异性的，并且对活性物质的质量敏感。
总结和讨论对于GADS和Copaxone批次发展了一种体外方法。该方法是基于GARS-特异性T细胞对T-细胞表位(线性序列)的生物识别。GARS-特异性的T细胞分泌响应于培养物中的GA的Th0细胞因子。在该方法中，通过ELISA测量培养基中IL-2的水平来监视T细胞对GA批次的识别。显示GARS-特异性的T细胞与DS和DP批次交叉反应，表明这些批次与RS批次共有类似序列，并且甘露糖醇，DP制剂中的赋形剂不干涉反应。
该方法对于GA肽非常特异性并且对肽混合物的平均MW敏感。GA-特异性T细胞不识别MBP。MBP免疫显性肽(致脑炎的和抑制肽)，以及具有与GA类似的氨基酸组成的单肽，不刺激T细胞。在本实验中优化免疫方法以及体外反应中的关键参数。本实验显示该方法非常具有非常好的可重现性和稳定性。
可以将方法修改以标准化在药物组合物中使用的其它T细胞抗原。从针对抗原RS免疫的动物可以制备对于抗原RS，而不是GARS特异性的T细胞的原代培养物。可以测量该培养物响应抗原RS和响应样品抗原的细胞因子生产。可以将响应抗原RS的细胞因子生产对抗原RS浓度作图以产生标准曲线。可以将响应样品抗原的细胞因子生产与标准曲线比较以确定抗原是否在可接受的功效范围内。
如实验2A可以测定对于监视器的最佳细胞因子。如实验2B和C可以优化免疫和体外试验的条件。
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PCT国际公布号WO 00/18794Aharoni，R.等，T suppressor hybridomas and interleukin-2dependentlines induced by copolymer 1 or by spinal cord homogenate down-regulateexperimental allergic encephalomyelitis，Eur.J.Immunol.，(1993)，2317-25.
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European Pharmacopoeia.1997.
权利要求
1.一种测量相对于参考批次的醋酸格拉默的已知功效的试验批次的醋酸格拉默的功效的方法，其包含a.用预定量的来自参考批次的醋酸格拉默免疫8-12周龄的雌性(SJLXBALB/C)F1小鼠；b.在免疫后9-11天制备来自步骤(a)小鼠的淋巴结细胞的原代培养物；c.分别温育至少5个参考样品，其中每个包含预定数量的来自步骤(b)原代培养物的细胞和预定量的来自参考批次的、1μg/ml-25μg/ml的醋酸格拉默；d.温育至少2个样品，其中每个包含预定数量的来自步骤(b)原代培养物的细胞和预定量的来自试验批次的醋酸格拉默；e.对于步骤(c)和(d)中的每个样品测定在温育该样品18-21小时后在每个样品中由细胞分泌的白细胞介素-2的量；f.将由与试验批次的醋酸格拉默温育的样品分泌的白细胞介素-2的量与由与参考批次的醋酸格拉默温育的样品分泌的白细胞介素-2的量关联，以便测定试验批次的醋酸格拉默相对于参考批次的醋酸格拉默的功效，其中在步骤(c)和(d)的每个样品中，预定的细胞数量基本上相同，并且其中对于包含预定量的试验批次的醋酸格拉默的每个样品，存在相应的参考样品，其含有基本上相同的预定量的来自参考批次的醋酸格拉默。
2.权利要求1的方法，其中在步骤(d)中分别温育6个参考样品。
3.一种测量相对于参考批次的醋酸格拉默的已知功效的试验批次的醋酸格拉默的功效的方法，其包含a.用预定量的来自参考批次的醋酸格拉默免疫试验动物；b.在免疫后预定时间制备来自步骤(a)试验动物的细胞的原代培养物；c.分别温育至少2个参考样品，其中每个包含预定数量的来自步骤(b)原代培养物的细胞和预定量的来自参考批次的醋酸格拉默；d.温育至少2个样品，其中每个包含预定数量的来自步骤(b)原代培养物的细胞和预定量的来自试验批次的醋酸格拉默；e.对于步骤(c)和(d)中的每个样品测定在温育该样品预定时期后在每个样品中由细胞分泌的细胞因子的量；f.将由与试验批次的醋酸格拉默温育的样品分泌的细胞因子的量与由与参考批次的醋酸格拉默温育的样品分泌的细胞因子的量关联，以便测定试验批次的醋酸格拉默相对于参考批次的醋酸格拉默的功效，其中在步骤(c)和(d)的每个样品中，预定的细胞量基本上相同，并且其中对于包含预定量的试验批次的醋酸格拉默的每个样品，存在相应的参考样品，其含有基本上相同的预定量的来自参考批次的醋酸格拉默。
4.权利要求3的方法，其中所述细胞因子是白细胞介素。
5.权利要求4的方法，其中所述细胞因子是白细胞介素-2。
6.权利要求4的方法，其中所述细胞因子是白细胞介素-6。
7.权利要求4的方法，其中所述细胞因子是白细胞介素-10。
8.权利要求3的方法，其中所述细胞因子是干扰素-γ。
9.权利要求3的方法，其中所述哺乳动物生产对醋酸格拉默参考标准特异性的T细胞。
10.权利要求3的方法，其中所述哺乳动物是啮齿动物。
11.权利要求10的方法，其中所述啮齿动物是小鼠。
12.权利要求11的方法，其中所述小鼠是雌性(SJLXBALB/C)F1小鼠。
13.权利要求3的方法，其中所述哺乳动物是约8至约12周龄。
14.权利要求3的方法，其中所述细胞是淋巴结细胞。
15.权利要求3的方法，其中所述细胞是脾细胞。
16.一种制备一批作为药用可接受的醋酸格拉默的方法，其包含a.制备一批醋酸格拉默；b.按照权利要求1的方法测量批次的相对功效；和c.如果如此测量的相对功效是参考批次的醋酸格拉默的80％-125％，使所述批次具有作为药用可接受的资格。
17.一种制备药用可接受的醋酸格拉默的方法，其包含a.制备一批醋酸格拉默；b.按照权利要求3的方法测量批次的相对功效；和c.如果如此测量的相对功效是参考批次的醋酸格拉默的80％-125％，使所述批次具有作为药用可接受的资格。
全文摘要
本发明提供测量试验批次的醋酸格拉默的相对功效的方法。另外，本发明提供制备一批作为药用可接受的醋酸格拉默的方法。
文档编号G01N33/68GK1618018SQ02827773
公开日2005年5月18日 申请日期2002年12月4日 优先权日2001年12月4日
发明者E·克林格尔 申请人:特瓦制药工业有限公司