专利名称：甲型肝炎病毒株hav-zl2012，由其制备得到的疫苗及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种甲型肝炎病毒株，由该病毒株制备得到的疫苗以及应用，特别涉及一种甲型肝炎病毒株HAV-ZL2012，由其制备得到的减毒活疫苗及灭活疫苗，本发明还提供了所述病毒株的减毒适应方法。属于生物工程领域。
背景技术：
甲型病毒性肝炎，简称甲型肝炎、甲肝，是由甲型肝炎病毒(Hapatitis Avirus,HAV)引起的，以肝脏炎症病变为主的传染病，主要通过粪-口途径传播,临床上以疲乏,食欲减退，肝肿大，肝功能异常为主要表现，部分病例出现黄疸，主要表现为急性肝炎，无症状感染者常见。任何年龄均可患本病，但主要为儿童和青少年。成人甲肝的临床症状一般较儿童为重。冬春季节常是甲肝发病的高峰期。本病病程呈自限性，无慢性化，引起急性重型肝炎者极为少见，随着灭活疫苗在全世界的使用，甲型肝炎的流行已得到有效的控制。
甲肝疫苗是用于预防甲型肝炎的疫苗，目前在中国已经成为儿童接种的主要疫苗之一，2008年5月被列入扩大免疫疫苗之一。目前，市场上的甲肝疫苗主要有国产甲型肝炎减毒活疫苗和进口的甲型肝炎纯化灭活疫苗。甲肝灭活疫苗是世界卫生组织推荐使用的疫苗之一。国产甲肝减毒活疫苗免疫效果好，接种方便，价格也便宜，国产甲肝疫苗只需接种一次；进口甲肝疫苗是死疫苗，则需接种两次，接种完第一针后相隔6个月后还需接种第二针。接种甲肝疫苗后8周左右便可生产很高的抗体，获得良好的免疫力。抗体阳性率可达98% 100%，具有良好的免疫持久性，国产减毒活疫苗免疫力一般可持续5 10年。5 10年后补种一针，可以保持对甲肝病毒的免疫能力，获得长期的持续保护。进口灭活疫苗免疫力据称可持续20年及以上。对甲肝病毒疫苗株的建立和鉴定，促成了甲肝疫苗在世界范围内的广泛应用，但是目前的甲肝疫苗存在生产成本高，甲肝病毒的生长周期长，在宿主细胞上无细胞病变等特点，因此使疫苗的生产和质控周期长达半年。为了克服这一缺点，本发明从河北盐山县医院病人粪便中分离到一株甲肝病毒，经二倍体细胞传代10次，猴肾传代细胞传代15次进行病毒富集、然后通过分子克隆技术进行病毒鉴定，得到了一株甲肝病毒株，利用逆向分子生物学技术，对其进行传统方法的适应和减毒、并快速促成其减毒适应后得到了本发明所述的毒株HAV-ZL2012，经生长性、免疫性、安全性研究，表明本发明的毒株既能用于制备减毒活疫苗，又能用于制备灭活疫苗。

发明内容
本发明的目的之一在于提供一株经减毒适应后的甲型肝炎病毒株；本发明的目的之二在于提供所述的甲型肝炎病毒株在制备甲型肝炎疫苗中的应用；及在制备甲肝的诊断试剂中的应用。本发明的目的之三在于提供由以上所述的甲型肝炎病毒株制备得到的疫苗，所述疫苗包括减毒活疫苗及灭活疫苗。
本发明的目的之四在于提供一种使甲型肝炎病毒株快速减毒适应的方法。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术特征本发明发明人从河北盐山县医院病人粪便中分离得到一株甲肝病毒株，该毒株经二倍体细胞传代10次，猴肾传代细胞传代15次进行病毒富集、然后通过分子克隆技术进行病毒鉴定，从而鉴定并得到了一株甲肝病毒株，利用逆向分子生物学技术，对其进行传统方法的适应和减毒、并快速促成其减毒适应后得到了本发明所述的毒株HAV-ZL2012，经生长性、免疫性、安全性研究，表明该毒株既能用于制备减毒活疫苗，又能用于制备灭活疫苗。本发明的一株甲型肝炎病毒株，命名为HAV-ZL2012，经鉴定发现该病毒为一株基因组包含定点突变的无致病性的甲肝病毒株，其在第3839核苷酸位点上的核苷酸由尿嘌呤核苷酸突变为腺嘌呤核苷酸，并且，第5204位点上核苷酸由腺嘌呤核苷酸突变为尿嘌呤核苷酸。(参考毒株为HAJ85-1株，Genebank登号AB27935 ；IND HAV-9F株，登录号FJ360730以及H2疫苗株，AB020564,和HM175疫苗株，M14707。)
本发明的一株甲型肝炎病毒细胞适应株，命名为HAV-ZL2012，其由该病毒株的传染性克隆感染细胞后产生，所述的该病毒株的传染性克隆存在于甲肝传染性克隆工程菌中，所述的甲肝传染性克隆工程菌，命名为pHAV-ZL2012/DH5 a，分类命名为甲肝传染性克隆工程菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 6215，保藏日期为2012年6月14日。为了方便保藏，本发明提取了分离得到的命名为HAV-ZL2012的甲型肝炎病毒细胞适应株的RNA，设计引物，进行RT-PCR，将病毒基因组克隆到细菌载体中，从而得到了该病毒株的传染性克隆，接着将该传染性克隆转入大肠杆菌DH5 a中，得到了本发明所述的甲肝传染性克隆工程菌，命名为pHAV-ZL2012/DH5a。从培养的甲肝传染性克隆工程菌(pHAV-ZL2012/DH5 a )中提取质粒，即得到该病毒的传染性克隆，将其转化目的细胞(例如veix)细胞、FRhK6细胞等)即可得到本发明所述的甲型肝炎病毒细胞适应株HAV-ZL2012。本发明得到的甲型肝炎病毒，经原代猴肾细胞、传代猴肾细胞、人二倍体细胞、传代猴肾细胞多次传代，再经逆向遗传学技术突变，实现快速减毒和适应，使其生长周期缩短至二周，病毒滴度达 IO8IogELISA-TC ID5Q/ml。研究发现，本发明的一株甲型肝炎病毒细胞适应株HAV-ZL2012，可在人二倍体细胞2BS、Kongming-17、MRC-5、WI-38、Vero或BHK-21细胞上增殖传代，且该甲肝病毒株可诱导人体或高级灵长类动物的保护性应答，而不引起甲型肝炎的主要症状。因此，本发明的甲型肝炎病毒株HAV-ZL2012可用于制备甲型肝炎疫苗；所述疫苗包括减毒活疫苗及灭活疫苗。减毒活疫苗能够在动物或人体复制不引起甲肝症状，而保持诱导机体的全身的免疫保护，灭活疫苗诱导抗体产生保护性抗体，但不能在机体复制，更安全。另外，本发明的甲型肝炎病毒株HAV-ZL2012也可用于制备甲肝的诊断试剂。进一步的，本发明还提供了一种使甲型肝炎病毒株快速减毒适应的方法其特征在于包括以下步骤(I)将甲型肝炎病毒株在FRhK6的单层细胞上传代10次后，转至Vero细胞，Vero细胞传至第10代，病毒培养液经Elisa-TCID5ci测定病毒滴度，rt-pcr检测阳性；(2)在二倍体细胞上的减毒适应将步骤I中得到的在Vero细胞上传至第10代的细胞，按0. 01-0. IMOI接种单层二倍体MRC-5细胞，传至5-8代，病毒培养液经Elisa-TCID5ci测定病毒滴度，RT-PCR检测阳性，得到所述病毒株的二倍体细胞适应株；(3) 二倍体细胞适应株在Vero细胞上的传代和适应细胞培养瓶形成Vero细胞单层后用不含胎牛血清的MEM培养液洗3次，接种人二倍体细胞上适应的甲肝病毒株，经32°C 4小时的吸附，每隔I周换液I次，每4周至6周传代一次，每次传代细胞经冻融超声，经5-7次传代后，病毒液按10-100稀释，用ELISA测定滴度，继续在32°C下每2周传代一次，传至25-30代次时，进行RT-PCR检测；(4)中和实验或免疫电镜观察 步骤3得到的培养物经冻融、超声处理，离心，取上清液0. 05ml加入0. 02ml人的免疫血清后，以I : 10或1:20的体积比与稀释液混合，在37摄氏度孵育I小时，4°C冰箱放置3小时，进行电镜观察，混合液接种二倍体单层细胞，培养二周，RT-PCR检测结果阳性，用Elisa-TCID5ci检测病毒滴度。本发明的一种甲型肝炎病毒快速减毒适应的方法，使其生长周期从100天减至14天，培养温度32°c。在二倍体细胞上传代适应的代次从40代降至10代，在传代细胞上降至10 15代。相较于现有技术，本发明的优点在于I、本发明的一株甲型肝炎病毒株HAV-ZL2012，其在第3839核苷酸位点上的核苷酸由尿嘌呤核苷酸突变为腺嘌呤核苷酸，并且，第5204位点上核苷酸由腺嘌呤核苷酸突变为尿嘌呤核苷酸，该基因位点的突变导致病毒毒力减弱，在宿主细胞上复制周期缩短，病毒复制能力增强，且不易返祖，而且，对猴子的致病性减弱，免疫原性增强。2、本发明的一株甲型肝炎病毒株HAV-ZL2012可在人二倍体细胞2BS、Kunming-17、MRC-5 细胞、WI-38、Vero、BHK-21 细胞上增值传代；3.本发明的一株甲型肝炎病毒株HAV-ZL2012可诱导人体或高级灵长类动物的保护性应答，不引起甲型肝炎的主要症状；4、本发明的一株甲型肝炎病毒株HAV-ZL2012经在易感细胞上传代减毒，利用逆向分子生物学技术突变克隆测序，确定了减毒机制和细胞生长性，其序列带有特定标志，在机体复制后诱导保护性甲肝免疫，复制后经化学法灭活、纯化也可进行甲肝的免疫预防。因此，本发明的病毒株既能制备减毒活度苗，又能制备灭活疫苗。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例I甲型肝炎病毒株的分离鉴定河北盐山县医院急性期病人粪便，溶于PBS (PH7. 2-7. 4)中，制成30 50%的悬液，离心，用30%的蔗糖超速离心，再用CsCl2梯度离心，密度梯度介于1.0和1.6g/ml之间，测定血凝效价，血凝效价为1:32，进一步用含I. 0%胎牛血清细胞培养液，按1:5稀释，用0. 45ml的针孔滤器过滤，再经0. 22 i! m的针孔滤器除菌过滤，接种FRhK6的单层细胞，接种液37°C放置4小时，移去液体，更换为含0. 5%胎牛血清，100IU庆大霉素，10 y g链霉素/ml的MEM培养液，每周置换培养液，37°C培养60天，用ELISA_TCID5(I方法测序甲肝病毒抗原，约至40 - 50天，甲肝病毒抗原显阴性，RT-PCR检测呈阳性。实施例2甲型肝炎病毒株的传代培养I、实施例I中的阳性病毒株在FRhK6的单层细胞上传代10次后，转至Vero细胞，Vero细胞传至第10代，病毒培养液经Elisa-TCID5ci,以病毒株基因组2B-2C区间为模板设计引物进行RT-PCR检测，结果为阳性，病毒滴度达104logELISA-TCID5Q/ml ；2、在二倍体细胞上的减毒适应将步骤I中得到的在Vero细胞上传至第10代的细胞，按0. 01-0. IMOI接种单层二倍体MRC-5细胞，传至5-8代，病毒滴度可达107logELISA-TCID5(l/ml，以病毒株基因组2B-2C区间为模板设计引物进行RT-PCR检测，结果为阳性，得到病毒株的二倍体细胞适应株； 3、二倍体细胞适应株在Vero细胞上的传代和适应75cm2的方瓶形成Vero细胞单层后用不含胎牛血清的MEM培养液洗3次，接种人二倍体细胞上适应的甲肝病毒ZL20121ml，经32°C 4小时的吸附，每隔I周换液I次，每4周至6周传代一次，每次传代细胞经冻融超声，经5-7次传代后，病毒液按10-100稀释，用ELISA测定滴度，病毒滴度达IO8IogTCID5ci，继续在32°C下每2周传代一次，传至25-30代次时，以病毒株2B-2C区间为模板设计引物进行RT-PCR检测，结果为阳性。4、中和实验或免疫电镜观察 步骤3得到的培养物经冻融、超声处理，离心，取上清液0. 05ml加入0. 02ml人的免疫血清后，以I : 10或1:20的体积比与稀释液混合，在37摄氏度孵育I小时，4°C冰箱放置3小时，滴在金属网上进行电镜观察，如果甲肝病毒和抗体反应，则可看到27nm的甲肝病毒被甲肝抗体包围。混合液接种二倍体单层细胞，培养二周，以病毒株2B-2C区间为模板设计引物进行RT-PCR检测，结果为阴性，Elisa-TCID50法检测不到病毒滴度。甲肝疫苗株的鉴别甲肝病毒分离适应后、浓缩抽取RNA，设计引物，进行RT-PCR，将病毒基因组克隆到细菌载体，进行测序，对特定基因片段设计引物测序，和分离的毒株以及国内外的疫苗株测序比较，该分离株属基因IA型，序列比对结果表明该病毒为一株基因组包含定点突变的无致病性的甲肝病毒株，其在第3839核苷酸位点上的核苷酸由尿嘌呤核苷酸突变为腺嘌呤核苷酸，并且，第5204位点上核苷酸由腺嘌呤核苷酸突变为尿嘌呤核苷酸。得到减毒适应后的甲型肝炎病毒，并将其命名为HAV-ZL2012，为方便保藏，将得到的含有该病毒基因组克隆的细菌载体载入大肠杆菌DH5 a中，得到了本发明所述的甲肝传染性克隆工程菌，命名为pHAV-ZL2012/DH5a，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 6215，保藏日期为2012年6月14日。从培养的甲肝传染性克隆工程菌(？通￥-212012/1)册0)中提取质粒，即得到病毒的传染性克隆，将其转化目的细胞(例如veix)细胞、FRhK6细胞等)即可得到本发明所述的甲型肝炎病毒细胞适应株HAV-ZL2012。实施例3灭活疫苗制备
采用生物反应器，悬浮培养Vero细胞，细胞密度达I一 2X 108ml时，按0. OlMOI接种减毒适应后的本发明的甲型肝炎病毒株HAV-ZL2012，病毒经37°C二周的灌注连续培养消化后，收获细胞，经冻融、超声、氯仿抽取、离心，500K中容纤维柱浓缩S印hawsebFF或Eephorose4FF纯化或鹿糖密度连续流超离心纯化,按照1:4000 (v/v)加入福尔马林溶液在37°C灭活3天，残余福尔马林用双硫代硫酸钠中和，所有操作必须在无菌的条件下进行。灭活的疫苗抗原Im为一剂，4个剂量注射恒河猴静脉产生甲肝抗体或4个剂量注射恒河猴后进行攻毒。实施例4灭活疫苗的配制甲肝病毒HAV-ZL2012株，按实施例3所述的方法制备，澄清除菌液经30%蔗糖混合超速离心100，OOOg, 24小时，沉淀重悬与5mMEDTA，IOOmM硼酸，pH8溶液中，再经20-50%蔗糖梯度超速离心(lOOOOOg)，取密度为I. 35-1. 25g/ml的离心液，用0.9% NaCl 4°C透析12小时，重复透析2-3次，透析液经1/2000-1/4000的福尔马林溶液灭活4_5天，透析除去 残余甲醒，稀释使甲肝抗原1000-2000 V- g/ml,按0. 8%A1 (OH)3悬液加入等体积的甲肝抗原吸附，每剂加入0. 5ml吸附液。使灭活疫苗每剂含IOOng HAV抗原实施例5细胞工厂制备减毒活疫苗用细胞工厂在37°C培养二倍体细胞MRC-5，细胞长成单层后接种按0. 01—0. 1M0I接种减毒适应甲型肝炎病毒株HAV-ZL2012，32°C吸附4小时，加入含0. 5-1. 0%人白蛋白的病毒维持液，32°C孵育一周，一周后换新鲜维持液继续培养2周，用EDTA-胰酶消化细胞置于_30°C冻溶，再移到37°C融化，反复3-5次，移到无菌的离心管超声(频率5kHz)三次，病毒悬液离心(200(T3000g，30分钟)、冻融、超声反复三次，上清合并，用0. 45iim的膜澄清，0. 22um的膜除菌过滤置于_20°C冰箱，以备配苗，疫苗的成分如表I所示表I减毒活疫苗的成分
权利要求
1.一株甲型肝炎病毒株，命名为HAV-ZL2012，其由该病毒株的传染性克隆感染细胞后产生，所述的该病毒株的传染性克隆存在于甲型肝炎病毒工程菌中，所述的甲型肝炎病毒工程菌，命名为pHAV-ZL2012/DH5a，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为=CGMCC No. 6215，保藏日期为2012年6月14日。
2.权利要求I所述的甲型肝炎病毒株在制备预防由甲型肝炎病毒引起的疾病的药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的药物为甲肝减毒活疫苗或甲肝灭活疫苗。
4.权利要求I所述的甲型肝炎病毒株在制备甲肝的诊断试剂中的应用。
5.ー种甲肝疫苗，其特征在于所述的疫苗中含有权利要求I所述的甲型肝炎病毒株。
6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于所述的疫苗为甲肝减毒活疫苗或甲肝灭活疫苗。
7.—种使甲型肝炎病毒株快速减毒适应的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)将甲型肝炎病毒株在FRhK6的单层细胞上传代10次后，转至Veix)细胞，Veix)细胞传至第10代，病毒培养液经Elisa-TCID5ci測定病毒滴度，rt-pcr检测阳性； (2)在二倍体细胞上的减毒适应 将步骤I中得到的在Vero细胞上传至第10代的细胞，按0. 01-0. IMOI接种单层二倍体MRC-5细胞，传至5-8代，病毒培养液经Elisa-TCID5ci测定病毒滴度，RT-PCR检测阳性，得到所述病毒株的二倍体细胞适应株； (3)二倍体细胞适应株在Vero细胞上的传代和适应 细胞培养瓶形成Vero细胞单层后用不含胎牛血清的MEM培养液洗3次，接种人二倍体细胞上适应的甲肝病毒株，经32°C 4小时的吸附，每隔I周换液I次，每4周至6周传代ー次，每次传代细胞经冻融超声，经5-7次传代后，病毒液按10-100倍稀释，用ELISA测定滴度，继续在32°C下每2周传代一次，传至25-30代次时，进行RT-PCR检测； (4)中和实验或免疫电镜观察 步骤3得到的培养物经冻融、超声处理，离心，取上清液0. 05ml加入0. 02ml人的免疫血清后，以1:10或1:20的体积比与稀释液混合，在37°C孵育I小吋，4°C冰箱放置3小时，进行电镜观察，混合液接种二倍体单层细胞，培养ニ周，RT-PCR检测结果阳性，用Elisa-TCID50检测不到病毒滴度，即得。
全文摘要
本发明公开了一株甲型肝炎病毒株HAV-ZL2012，由其制备得到的疫苗及应用。本发明利用逆向分子生物学技术，并采用了一种新的传代方法实现了原始分离得到的病毒株的适应和减毒、并快速促成其减毒适应，经生长性、免疫性、安全性研究，表明毒株HAV-ZL2012既能用于制备减毒活疫苗，又能用于制备灭活疫苗。而本发明的一种甲型肝炎病毒快速减毒适应的方法，使其生长周期从100天减值14天。在二倍体细胞上传代适应的代次从40代降至10代，在传代细胞上降至10～15代，大大降低了生产周期和成本，对于甲肝疫苗的开发来说起到了极大地促进作用。
文档编号G01N33/576GK102757941SQ201210226440
公开日2012年10月31日 申请日期2012年6月29日 优先权日2012年6月29日
发明者吕宏亮, 张澍 申请人:北京健翔和牧生物科技有限公司, 山西隆克尔生物制药有限公司