专利名称：细胞中变化的检测方法
细胞中变化的检测方法优先权本申请是2008年12月15日提出的U. S. 12/335，393的继续申请，本文以引用的方式将其整体并入。本申请交叉引用2008年12月15日提出的题为“离子通道调节剂的识别方法 (Methods For Identifying Modulators of Ion Channels) ” 的美国序号 12/3；35，433 专利，本文以引用的方式将其整体并入。
背景技术：
药物探索科学需要更为有效的工具，这些工具用于测定生物材料和试验化合物对人细胞和组织的影响。通常，许多生物学平台(一些使用工程的细胞或标记物)建立在基于细胞的系统中的用于这些测定的组织内。这些平台需要许多不同的读数器，这些读数器经常提供不一致的数据集。它们经常使用工程的细胞，所述工程的细胞含有在疾病过程中涉及的特别目标的过度表达。这种工程的系统的净效果和最初所寻求的恰好相反，结果被从天然或自然的响应中除去。在其它情况下，这些平台使用标记物以监测实验结果。在标记物中引入新的化学实体也会以难以测定的方式对实验结果产生显著影响。所需要的是可以和许多不同种类的细胞一起用于试验潜在治疗法的单一平台，所述治疗法反映对试验材料的自然的细胞反应。
发明概要本发明的一个实施方案提供细胞对刺激源的响应的检测方法。该方法包括(i)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将细胞加入生物传感器；或(ii)将细胞和一种或多种细胞外基质配体混合，其中细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将带有一种或多种细胞外基质配体的细胞加入比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面。细胞在这两种情况下可以
在无血清培养基中。将细胞暴露于刺激源并检测细胞对刺激源的响应。所述刺激源可以是调节G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体(transient receptor)电势通道、磷脂酶C、 受体酪氨酸激酶、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号(印igenetic signal)或信号转导路径的活性的化合物。和检测方法中不包括一种或多种细胞外基质配体的方法相比，细胞对刺激源的响应的检测可以增大。本发明的另一个实施方案提供用于试验的细胞的制备方法。该方法包括用缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液洗涤细胞；从细胞除去所述缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液；将等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂加入细胞；用缓冲盐水溶液中和所述等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂；用缓冲盐水溶液洗涤细胞；和将细胞加到生物传感器表面并使细胞附着于生物传感器的表面。可以在粘着调节剂的存在下将细胞加到生物传感器表面。生物传感器表面可具有固定于其的一种或多种细胞外基质配体，或者其中在细胞加入生物传感器表面前，将它们和一种或多种细胞外配体混合。可以检测到细胞和细胞外基质配体的结合。本发明的又一个实施方案提供细胞对刺激源的响应的检测方法。该方法包括用缓冲盐水溶液洗涤所述细胞。然后(i)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将细胞加入生物传感器；或(ii)将细胞和一种或多种细胞外基质配体混合，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述带有一种或多种细胞外基质配体的细胞加入比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面。将细胞暴露于刺激源并检测细胞对刺激源的响应。在所列举的方法步骤之前，可进行下列步骤用缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液洗涤细胞；从细胞除去所述缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液；将等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂加入细胞；和用缓冲盐水溶液中和所述等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂。可以在粘着调节剂的存在下将细胞加到生物传感器表面。所述刺激源可以是调节G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、 受体酪氨酸激酶、细胞因子、β -抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径的活性的化合物。本发明的又一实施方案提供测定试验试剂是否影响细胞运动的方法。该方法包括将一种或多种细胞外基质蛋白配体固定于微量滴定板的孔底部，其中所述孔底部包括比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器，且其中所述孔具有微流体通道，所述微流体通道可将试验试剂递送至该孔内的一个位置。将具有对所述一种或多种细胞外基质蛋白配体特异性的细胞表面受体的细胞加入所述孔。使用所述微流体通道将试验试剂加入孔；其中所述试验试剂是疑似趋化剂(suspected chemotactic agent)。检测细胞在孔中的运动，其中如果检测到细胞在孔中的运动，则所述试验试剂影响细胞的运动。所述试验试剂可以是调节G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β -抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径的活性的化合物。本发明的又一实施方案提供测定试验化合物是否影响细胞和细胞外基质配体的特异性结合的方法。该方法包括将第一细胞加入第一比色共振反射生物传感器表面或第一基于光栅的波导生物传感器表面，其中所述生物传感器表面包括固定的细胞外基质配体，其中第一细胞具有对所述细胞外基质配体特异性的细胞表面受体，使第一细胞附着于第一生物传感器的表面，和对第一细胞测定峰波长值或信号。将第二细胞加入第二比色共振反射生物传感器表面或第二基于光栅的波导生物传感器表面，其中所述第二生物传感器表面包括固定的细胞外基质配体，其中第二细胞具有对所述细胞外基质配体特异性的细胞表面受体，将试验化合物加入生物传感器表面，使第二细胞附着于生物传感器的表面，和对第二细胞测定峰波长值或信号。比较对第一细胞获得的峰波长值或信号和对所述第二细胞获得的峰波长值或信号；其中如果对第二细胞的峰波长值或信号基本上不同于对第一细胞的峰波长值或信号，则所述试验化合物影响细胞和细胞外基质配体的特异性结合。所述试验化合物可以是调节G蛋白-偶合的受体、离子通道、Ρ13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β -抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径的活性的化合物。本发明的另一实施方案提供实时分析细胞变化的方法。该方法包括将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面； 将细胞加入生物传感器，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；将细胞暴露于刺激源；和使用分辨率约2到10微米的检测装置检测细胞对刺激源的响应。所述刺激源可以是调节G蛋白-偶合的受体、离子通道、Ρ13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β -抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径的活性的化合物。所述细胞变化可以是细胞生长模式、细胞死亡模式、细胞运动、细胞尺寸或体积或者细胞粘着中的变化。本发明的又一实施方案提供检测细胞响应变化的方法。该方法包括将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面； 在无血清培养基中将细胞加入所述生物传感器，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；将细胞暴露于刺激源而不洗去所述无血清培养基；和检测细胞对刺激源的响应。所述刺激源可以是调节G蛋白-偶合的受体、离子通道、Ρ13激酶、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径的活性的化合物。本发明的又一实施方案提供比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器表面，其中所述生物传感器通过将卵清蛋白或胎牛血清和两种或更多种细胞外基质配体施用于所述生物传感器的表面并将所述生物传感器的表面干燥而制备。本发明的又一实施方案提供识别影响细胞粘着的化合物的方法。该方法包括(i)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将细胞加入生物传感器；或(ii)将细胞和一种或多种细胞外基质配体混合，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述带有一种或多种细胞外基质配体的细胞加入比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面。用试验化合物处理细胞。检测比色共振反射光学第一 PWV或信号，并将它和来自未用所述试验化合物处理的对照细胞的第二 PWV或信号比较，以测定所述试验化合物是否影响所述细胞的粘着。所述试验化合物可以是调节G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道或磷脂酶C的活性的化合物。在试验期间，在加入试验化合物之前或加入期间，或者在加入之后，可将粘着调节剂加入细胞，其中对照细胞也用粘着调节剂处理。本发明的另一实施方案提供识别影响细胞粘着的经修饰的细胞外基质(ECM)配体的方法。该方法包括将细胞施用至比色共振反射光学生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中将经修饰的ECM配体固定于生物传感器的表面；将粘着调节剂加入细胞；对细胞检测比色共振反射光学第一 PWV或信号，并将第一 PWV或信号和第二 PWV或信号比较，所述第二 PWV或信号来自加入比色共振反射光学生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面的对照细胞，其中将未经修饰的ECM配体固定于生物传感器的表面，以测定所述试验化合物是否影响细胞粘着。本发明的又一实施方案提供测定转染细胞是否生产重组蛋白的方法。该方法包括将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；将细胞加入所述生物传感器的表面，所述细胞已用编码重组蛋白的核酸分子转染且具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；对所述细胞测定第一 PWV或信号；加入调节剂，和不表达所述重组蛋白的转染细胞相比，所述调节剂在表达所述重组蛋白的转染细胞中引起差别响应；对所述细胞测定第二 PWV或信号；比较第一峰波长值或信号和第二峰波长值或信号；其中如果第二峰波长值或信号基本上不同于第一峰波长值或信号，则所述转染细胞表达所述重组蛋白。本发明提供细胞粘着作为监测细胞对刺激源响应的模式之一。许多主要的科学来源报道，细胞性活动(cellular event)的过剩及响应和几种细胞粘着模式之一有联系。本发明描述生物传感器的操作方法，用于监测对刺激源的自然响应中的细胞粘着。本发明提供商业上可行的高通量方法，它可以进行高灵敏度的基于细胞的试验， 而没有任何类型的标记物，其在型式(format)上容易和最常用于高通量生物分子相互作用分析的基于微量滴定板或基于微阵列的基础设施相容。附图简述

图1显示细胞-蛋白相互作用试验的示意图。图2显示细胞-蛋白相互作用试验的结果。发明详述本文使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数个指示物，除非上下文另外清楚地指明。生物传感器本发明的生物传感器可以是比色共振反射生物传感器。参见例如，Cunningham 等人， “Colorimetric resonant reflection as a direct biochemical assay technique (作为直接生化试验技术的比色共振反射)〃，Sensors and Actuators B，81卷， 316-328页，2002年1月5日；美国专利公布号2004/0091397 ；美国专利号7，094，595 ；美国专利号7，沈4，973。比色共振生物传感器不是表面等离子共振(SPR)生物传感器。SI3R生物传感器具有薄金属层，比如银、金、铜、铝、钠和铟。该金属必须具有能够和适当波长的光共振的导带电子。暴露于光的sra生物传感器表面必须是纯金属。氧化物、硫化物及其它膜干扰SPR。比色共振生物传感器不具有金属层，而是，它们具有高折射率材料(比如硫化锌、二氧化钛、氧化钽和氮化硅)的电介质涂层。基于光栅的波导生物传感器描述于，例如，美国专利号5，738，825中。基于光栅的波导生物传感器包括波导膜和衍射光栅，它将入射光场耦合进入波导膜，产生衍射光场。检测到波导膜的有效折射率变化。诸如基于光栅的波导生物传感器的装置(其中波必须在装置内传输显著距离)缺乏本发明的空间分辨率。比色共振反射生物传感器可以不使用荧光标签(tag)、比色标记物(label)或任何其它类型的检测标签或检测标记物而在生物传感器的表面上测量生物化学相互作用。生物传感器表面含有光学结构，该光学结构设计成用准直光和/或白光照明时仅反射窄波长带(“共振光栅效应”)。该窄波长带被描述为波长“峰”。当生物传感器表面上沉积或者除去材料(比如生物材料)时，该“峰波长值”(PWV)变化。使用读数仪器以准直光和/或白光照明生物传感器表面上的不同位置(distinct location)，并收集反射的光。将收集的光聚集于波长分光计内用以测定PWV。通过将该结构(生物传感器一侧朝上)和无底的微量滴定板筒的底部结合，可将生物传感器并入标准的一次性实验室物品(比如微量滴定板)。由于和现有微量滴定板处理设备(比如混合器、培养箱和液体分配设备)的相容性，将生物传感器并入常见实验室型式的筒是合乎需要的。生物传感器也可并入，例如，微流体、大流体或微阵列装置(参见，例如，美国专利号7，033，819、美国专利号7，033，821)。生物传感器可以本领域公知方法(参见，例如，Jun-Lin Guan 编辑的 Methods of Molecular Biology (分子生物学方法)，294 卷，Humana Press, Totowa, New Jersey)用于监测暴露于一种或多种细胞外试剂时的细胞行为变化或缺乏这些变化。比色共振反射生物传感器包括亚波长结构的表面(SWS)且是可以模仿薄膜涂层效果的非常规类型的衍射光学。(Peng和Morris，“Resonant scattering from two-dimensional gratings ( 二维光栅的共振散射)”，J. Opt. Soc. Am. A, 13 卷，No. 5，993 页，1996 年 5 月；Magnusson 禾口 Wang，"New principle for optical filters (滤光器新原理)”，Appl. Phys. Lett.，61，No. 9，1022 页，1992 年 8 月；Peng 和 Morris，“Experimental demonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensional gratings ( 二维光栅衍射中共振异常的实验证实)”，Optics Letters, 21卷，No. 8，549页， 1996年4月)。SffS结构含有一维、二维或三维光栅，其中光栅周期和入射光的波长相比要小，从而除反射和透射的零级外没有衍射级可以传播(propagation)。导模(guided mode) 沿着横向的传播不被支持。而是，导模共振效果在距任何光子进入生物传感器结构的点大约3微米的高度局部化区域内发生。比色共振反射生物传感器的反射或透射的光可以通过将分子(比如配体或结合配偶体(binding partner)或者两者)加入生物传感器的上表面而调制。加入的分子增大入射辐射经过该结构的光程长度，并因此改变将发生最大反射或透射的波长。在一个实施方案中，比色共振反射生物传感器设计成用白光和/或准直光照明时反射单一波长或窄波长带(“共振光栅效应”)。当物质沉积在生物传感器的表面上时，反射的波长因生物传感器上显示的光的光程变化而移动。检测系统包括例如光源(其通过例如光纤探针以法向入射而照明生物传感器的小点)和光谱仪(其通过例如第二光纤探针收集反射的光，所述第二光纤探针也处于法向入射)。由于激发/检测系统和生物传感器表面之间不发生物理接触，因此不需要特殊的耦合棱镜，且该生物传感器可以容易地适应包括例如微量滴定板的任何常用试验平台。单个光谱仪读数可在几毫秒内进行，因此可以快速测量在生物传感器表面上并行发生的大量分子间相互作用，并可以实时监测反应动力学。比色共振反射生物传感器包括，例如，由高折射率材料组成的光学光栅、支持光栅的衬底层，以及任选的一种或多种特异性结合物质或连接物，其固定于和衬底层相反的光栅表面上。该高折射率材料具有比衬底层更高的折射率。参见，例如，美国专利号 7，094，595;美国专利号7，070，987。任选地，覆盖层覆盖光栅表面。光学光栅涂有高折射率电介质膜，该膜可由包括例如硫化锌、二氧化钛、氧化钽、氮化硅和二氧化硅的材料组成。具有光学特征的光栅的截面分布可以包括任何周期性重复功能，例如，“方波”。光学光栅也可包括选自线(一维)、正方形、圆形、椭圆形、三角形、梯形、正弦波、卵形、矩形和六边形的形状的重复图案。本发明的比色共振反射生物传感器也可包括光学光栅，该光学光栅由例如涂有高折射率材料的塑料或环氧树脂组成。线性光栅(S卩，一维光栅)具有照射光偏振垂直于光栅周期而取向的共振特征。比色共振反射生物传感器也可包括，例如，二维光栅，例如，孔或正方形的六角形阵列。可使用其它形状。线性光栅具有和六角形阵列光栅相同的间距(即高和低折射率的区域之间的距离)、周期、层厚度和材料性质。然而，光必须垂直于光栅线偏振以共振地耦合进入该光学结构。因此，必须在照明源和生物传感器表面之间插入以其偏振轴垂直于线性光栅而取向的偏振滤光器。由于仅小部分照射光源被正确偏振，因此需要较长的积分时间，以收集和六角形光栅相比等量的共振反射光。光学光栅也可包括，例如，“台阶式”分布，其中单一的固定高度的高折射率区域嵌入较低折射率覆盖层内。高和低折射率的交替区域提供平行于生物传感器顶面的光学波导。本发明的比色共振反射生物传感器可以进一步包括在和衬底层相反的光学光栅表面上的覆盖层。存在覆盖层时，所述一种或多种特异性结合物质固定在和光栅相反的覆盖层的表面上。优选地，覆盖层包括折射率比组成光栅的材料低的材料。覆盖层可以由例如玻璃(包括旋涂玻璃(spin on glass，SOG))、环氧树脂或塑料组成。例如，满足生物传感器的折射率要求的各种聚合物可用于覆盖层。可以使用S0G， 这是由于它的良好的折射率、易于处理以及容易使用玻璃表面活化技术的资源而由特异性结合物质活化。当生物传感器表面的平坦度对于特别的系统设置不是问题时，SiN/玻璃的光栅结构可以直接用作感应表面，它的活化可以使用和玻璃表面上相同的方法来完成。光学光栅上没有平坦化(planarizing)覆盖层也可以获得共振反射。例如，生物传感器可以仅含有涂有高折射率材料的结构化薄膜层的衬底。不使用平坦化覆盖层，则周围介质(比如空气或水)填充该光栅。因此，将特异性结合物质在暴露于该特异性结合物质的所有光学光栅表面上固定于生物传感器，而不是仅仅在上表面上。总的来说，比色共振反射生物传感器可以用白光和/或准直光照明，所述白光和/ 或准直光将会含有每个偏振角的光。偏振角相对于生物传感器光栅中的重复特征的取向将决定共振波长。例如，由一组重复的线和间隔组成的“线性光栅”(即，一维光栅)生物传感器将具有两种光学偏振，它们可以产生单独的共振反射。垂直于线而偏振的光称作“S-偏振”，同时平行于线而偏振的光称作“P-偏振”。入射光的S和P组分两者同时存在于未滤光的照明束中，且各自产生单独的共振信号。生物传感器可以通常设计成仅使一种偏振 (S-偏振)的性能最佳，并通过偏振滤光器容易地除去未最佳化的偏振。为了除去偏振依赖性，从而每个偏振角产生相同的共振反射光谱，可以使用由一组同心环组成的替代性生物传感器结构。在这个结构中，各个同心环的内径和外径之间的差异等于光栅周期的约一半。各个连续的环的内径大于前面的环的内径约一个光栅周期。 同心环图案延伸至覆盖单个传感器位置-比如阵列点或微量滴定板孔。各个单独的微阵列点或微量滴定板孔具有位于其中心的单独的同心环图案。这种结构的所有偏振方向具有相同的截面分布。必须精确地照射在同心环结构中心以保持偏振独立性。同心环结构的光栅周期小于共振反射的光的波长。光栅周期为约0.01微米到约1微米。光栅深度为约0.01 到约1微米。在另一实施方案中，孔或柱的阵列排列为紧密地近似于上述同心圆结构，无需照明束在栅格的任何特别位置居于中心。这样的阵列图案通过在表面上以相等角度从三个方向入射的三个激光束的光学干涉而自动产生。在这个图案中，孔(或柱)在密堆积六边形阵列的角上位于中心。孔或柱也存在于各个六边形的中心。这样的孔或柱的六角形栅格具有“看得到”相同截面分布的三个偏振方向。因此，该六角形栅格结构使用任何偏振角的光提供相同的共振反射光谱。因此，不需要偏振滤光器除去不需要的反射信号组分。孔或柱的周期可以是约0.01微米到约1微米且深度或高度可以是约0. 01微米到约1微米。检测系统可以包括比色共振反射生物传感器、将光导向比色共振反射生物传感器的光源和检测从生物传感器反射的光的检测器。在一个实施方案中，可通过使用滤光器简化读数仪器，使得仅超过确定阈值的正结果触发检测。通过测量共振波长在本发明的比色共振反射生物传感器的各个不同位置的移动， 可以测定例如哪个不同位置上面沉积了生物材料。移动的程度可用于测定例如试样中的结合配偶体的量，以及一种或多种特异性结合物质和试样的结合配偶体之间的化学亲合性。比色共振反射生物传感器可以照明两次。第一次测量在例如生物传感器上没有生物材料时测定生物传感器的一个或多个不同位置的反射光谱。第二次测量在例如将一种或多种细胞施用于生物传感器后测定反射光谱。这两次测量之间的峰波长差异是生物传感器上的细胞的存在或者数量的量度。这种照明方法可以控制生物传感器表面中的小缺陷，这些小缺陷可以引起在峰共振波长中具有轻微变化的区域。该方法也可控制生物传感器上的细胞物质的变化的浓度或密度。生物传感器的表面进行一种或多种配体在生物传感器上的固定，使得配体不会被任何漂洗程序洗掉，从而配体和试样中的结合配偶体的结合不受生物传感器表面妨碍。一种或多种配体可以通过物理吸附(即，不使用化学连接物)或通过化学结合(即，使用化学连接物)以及电化学结合、静电结合、疏水结合和亲水结合而附着于生物传感器表面。化学结合可以在生物传感器表面上产生较强的配体附着并提供表面结合的分子的限定的取向和构造。配体也可通过特异性结合物质(比如核酸、肽、蛋白溶液、肽溶液、含有来自组合化学库(combinatorial chemical library)的化合物的溶液、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(ScFV)、F(ab)片段、F(ab' )2片段、Fv片段、小有机分子、病毒、聚合物或生物样品)特异性地和生物传感器表面结合，其中该特异性结合物质固定于生物传感器的表面。此外，配体可以排列于生物传感器表面上的一个或多个不同位置的阵列中，所述表面存在于多孔板的一个或多个孔内并组成多孔板或微阵列的一个或多个表面。配体的阵列包括微孔板内的生物传感器表面上的一种或多种配体，从而表面含有一个或多个不同位置，每个具有不同配体。例如，阵列可包括1、10、100、1，000、10，000或100，000或更多的不同位置。因此，多孔板或微阵列的各个孔可在其内部具有和该多孔板的其它孔分离的一个或多个不同位置的阵列，这允许多个不同样品在一个多孔板上被处理。在任何一个孔内的阵列(一个或多个)可以和相同微量滴定板的任何其它微量滴定孔中可见的阵列(一个或多个)相同或不同。将配体固定于生物传感器表面也可通过和例如下列官能连接物结合而起作用 镍基、胺基、醛基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、氰基、糖基、硫醇基、有机磷酸盐基、脂基、磷脂基或类固醇基。此外，配体可以通过物理吸附、化学结合、电化学结合、静电结合、疏水结合或亲水结合，以及免疫捕获 (immunocapture)方法而固定于生物传感器表面上。在本发明的一个实施方案中，生物传感器可以涂有连接物，比如，例如，镍基、胺基、醛基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、氰基、糖基、硫醇基、有机磷酸盐基、脂基、磷脂基或类固醇基。例如，胺表面可用于附着几种连接物分子而醛表面可用于直接结合蛋白，无需另外的连接物。镍表面可用于结合具有并入的组氨酸(“his”)标签的分子。用镍活化的表面检测“his-标签”的分子在本领域是公知的(Whitesides，Anal. Chem. 68，490，(1996))。连接物、配体和特异性结合物质可以固定于生物传感器的表面上，使得各个孔具有固定于其中的相同的连接物、配体和/或特异性结合物质。或者，各个孔可以含有连接物、配体和/或特异性结合物质的不同组合。配体可以特异性地或非特异性地和固定于生物传感器表面上的连接物或特异性结合物质结合。或者，生物传感器的表面可不具有连接物或特异性结合物质且配体可以非特异性地和生物传感器表面结合。进行一种或多种特异性结合物质或连接物在生物传感器上的固定，使得特异性结合物质或连接物不会被漂洗程序洗掉，从而它和试样中的配体的结合不受生物传感器表面妨碍。对于特异性结合物质共价附着到例如用于多种类型的微阵列和生物传感器中的玻璃，已实施了几种不同类型的表面化学策略。这些相同的方法可以容易地适应本发明的生物传感器。表面制备生物传感器，以便它含有用于结合一种或多种特异性结合物质的正确的官能团，是生物传感器制造方法的整体部分。一种或多种特异性配体可以通过物理吸附(即，不使用化学连接物)或通过化学结合(即，使用化学连接物)以及电化学结合、静电结合、疏水结合和亲水结合而附着于生物传感器表面。化学结合可以产生配体在生物传感器表面上的较强附着，并提供表面结合的分子的限定的取向和构造。配体固定到塑料、环氧树脂或高折射率材料可以基本上如对于固定到玻璃所描述的那样进行。然而，可以除去酸洗步骤，其中这种处理会损坏固定了特异性结合物质的材料。配体配体是和另一个分子结合的分子。配体和特异性结合物质是相似的术语。配体可以是，例如，核酸、肽、细胞外基质配体(参见表1)、蛋白溶液、肽溶液、单链或双链DNA溶液、 RNA溶液、RNA-DNA混合溶液、含有来自组合化学库的化合物的溶液、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(ScFV)、F(ab)片段、F(ab' )2片段、Fv片段、小有机分子、细胞、病毒、 细菌、聚合物或生物样品。生物样品可以是例如，血液、血浆、血清、胃肠分泌物、组织或肿瘤的勻浆、滑液、粪便、唾液、痰、囊内液、羊水、脑脊髓液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、泪液或前列腺液。聚合物选自每分子具有多个活性位点的长链分子的组，该组由水凝胶、葡聚糖、聚氨基酸和它们的衍生物组成，包括聚赖氨酸(包括聚-1-赖氨酸和聚-d-赖氨酸)、 聚-Phe-赖氨酸和聚-glu-赖氨酸。在本发明的一个实施方案中，配体是细胞外基质蛋白配体。优选地，一种或多种配体排列于生物传感器上的一个或多个不同位置的阵列中。 配体的阵列包括本发明生物传感器表面上的一种或多种配体，从而表面含有许多不同位置，每个具有不同配体或具有不同配体数量。例如，阵列可以包括1、10、100、1，000、10，000 或100，000个不同的位置。这样的生物传感器表面称作阵列，因为一个或多个配体一般在 x-y坐标中按规则的栅格图案布局。然而，本发明的阵列可以包括任何类型的规则或不规则图案中的一个或多个配体。例如，不同的位置可以限定一个或多个配体的点的阵列。阵列点的直径可以是约50到约500微米。阵列点的直径也可以是约150到约200微米。一种或多种配体可以和它们的特异性受体结合。本发明生物传感器上的阵列可通过将一种或多种配体的微滴放在例如光栅或覆盖层表面上的位置的x-y栅格上而产生。当生物传感器暴露于包括一种或多种结合配偶体的试样(例如，具有针对配体的受体的细胞)时，结合配偶体会被优先吸引到微阵列的不同位置上，所述微阵列包括对该结合配偶体具有高亲合力的配体。这些不同位置中的一些会将结合配偶体聚集在它们的表面上，而其它的位置则不会。配体特异性地和加入本发明生物传感器表面的结合配偶体结合。配体特异性地和它的结合配偶体结合，而基本上不和加入生物传感器表面的其它结合配偶体结合。例如，配体是抗体且它的结合配偶体是特别的抗原时，抗体特异性地和该特别的抗原结合，而基本上不和其它抗原结合。结合配偶体可以是，例如，核酸、肽、蛋白溶液、肽溶液、细胞外基质蛋白受体、整合蛋白(参见表1)、单链或双链DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA混合溶液、含有来自组合化学库的化合物的溶液、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体(ScFV)、F(ab)片段、F(ab' )2片段、Fv片段、小有机分子、细胞、病毒、细菌、聚合物或生物样品。生物样品可以是，例如，血液、血浆、血清、胃肠分泌物、组织或肿瘤的勻浆、滑液、粪便、唾液、痰、囊内液、羊水、脑脊髓液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、泪液和前列腺液。在本发明的一个实施方案中，结合配偶体是可以和生物传感器上固定的配体结合的受体，其中该受体在细胞表面上。尽管微量滴定板是用于生物化学试验的最常见形式，但微阵列作为使一次可测的生物化学相互作用数最大同时使贵重试剂的量最小的装置越来越多见。通过用微阵列点样器将配体施用于本发明生物传感器上，可以获得10，000配体/in2的配体密度。通过聚焦照明束以查询(interrogate)单个微阵列位置，可将生物传感器用作无标记物微阵列读数系统。此外，可将微阵列和微量滴定板实施方案两者组合，使得一种或多种配体排列于生物传感器表面上的一个或多个不同位置的阵列中，所述表面存在于微量滴定板的一个或多个孔内并包括微量滴定板的一个或多个表面，优选为底表面。配体的阵列包括微量滴定板孔内的传感器表面上的一种或多种配体，从而表面含有一个或多个不同位置，每个具有不同配体或具有不同配体量。例如，阵列可包括1、10、100、1，000、10，000或100，000个不同位置。因此，微量滴定板实施方案的各个孔可在它之内具有一个或多个不同位置的阵列， 它和微量滴定板实施方案的其它孔分离，这允许在一个本发明微量滴定板上处理多个不同样品，每个单独的孔一个或多个样品。在任何一个孔内的阵列(一个或多个)可以和相同微量滴定板的任何其它微量滴定孔中可见的阵列(一个或多个)相同或不同。含液体容器本发明的光栅可以构成含液体容器的内表面，例如，底表面。含液体容器可以是， 例如，微量滴定板孔、试管、陪替氏培养皿或微流体通道。本发明的一个实施方案是并入到任何类型的微量滴定板中的生物传感器。例如，生物传感器可以通过将反应容器壁组装在生物传感器表面之上而并入微量滴定板的底表面，从而各个反应“点”可以暴露于不同的试样。因此，各个单独的微量滴定板孔可以充当单独的反应容器。因此，单独的化学反应可以在相邻孔内发生而不混合反应流体，且在化学上不同的试验溶液可施用于单独的孔。为了将本发明的生物传感器或光栅附着于无底微量滴定板的底表面，可以使用几种方法，包括，例如，粘合剂附着、超声波焊接和激光焊接。用于药物高通量筛分实验室、分子生物学研究实验室和诊断试验实验室的最常用试验形式是微量滴定板。这些板是标准尺寸的塑料筒，可含有约2、6、8、24、48、96、384、 1536,3456,9600或更多个排列在栅格中的单独的反应容器。由于这些板的标准机械构造， 设计了液体分配、自动化板处理和检测系统以对该常用形式作用。本发明的生物传感器可以并入标准微量滴定板的底表面。因为生物传感器表面可以以大面积制造，且因为读数系统不和生物传感器表面物理接触，可以限定任意数量的单独的生物传感器区域，这仅受照明光学装置的聚焦分辨率和x_y阶段(stage)的限制，所述x_y阶段跨生物传感器表面扫描照明/检测探针。使用生物传感器的方法本发明生物传感器可用于并行研究一种或许多种配体/结合配偶体相互作用。一种或多种配体和它们各自的结合配偶体的结合，可以通过将一种或多种结合配偶体施用至在其表面上固定了一种或多种配体的生物传感器进行检测，而不使用标记物。在本发明的一个实施方案中，一种或多种配体是一种或多种细胞外基质蛋白配体且一种或多种结合配偶体是细胞上的受体，其中该受体(例如，整合蛋白)对细胞外基质蛋白配体是特异性的。 用光照明生物传感器，并检测来自生物传感器光的反射波长的最大值或透射波长的最小值。从基于光栅的波导生物传感器检测信号，并按照和比色共振反射生物传感器相似的方式彼此相比或和对照相比。本文描述的所有试验或方法可以在比色共振反射生物传感器和基于光栅的波导生物传感器上进行。如果一种或多种配体已经和它们各自的结合配偶体结合，则和一种或多种配体未与它们各自的结合配偶体结合的情形相比，光的反射波长移动。 生物传感器覆盖有含一种或多种配体的一个或多个不同位置的阵列时，则从生物传感器的各个不同位置检测光的反射波长的最大值或透射波长的最小值。在本发明的一个实施方案中，多种配体(例如，ECM配体)可以以阵列形式固定在本发明生物传感器上。然后将该生物传感器和包括结合配偶体(比如带有ECM配体受体 (例如整合蛋白或粘着斑蛋白)的细胞)的关注的试样接触。仅有特异性地和配体结合的细胞固定于生物传感器上。一旦结合，这些细胞响应于刺激源，不像未结合的细胞。不需要使用酶或荧光标记物。对于高通量应用，生物传感器可以排列于阵列的阵列中，其中将包括特异性结合物质的阵列的几个生物传感器排列在阵列中。这种阵列的阵列可以，例如，浸入微量滴定板以一次进行许多试验。在另一实施方案中，生物传感器可以存在于纤维探针端质的体内检测。或者，可将细胞和ECM配体混合，或者作为细胞和ECM的混合物取得然后加入生物传感器表面。本发明的一个实施方案允许直接检测细胞变化，比如细胞生长模式、细胞死亡模式的变化、细胞运动的变化、细胞尺寸或体积的变化或细胞粘着的变化，因为它们实时存在于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器且不需要并入或者不受辐射测量、比色或荧光标记物(尽管需要的话可以使用标记物)的干扰。随着细胞被扰乱，可以检测到细胞性能和形态的变化。然后可以使用高速、高分辨率仪器(比如BIND Scanner (BP, 比色共振反射生物传感器系统))实时检测细胞变化，并使用相应算法定量化数据。参见， 例如，美国专利号6，951，715和美国专利公开2004/01516 。通过组合该方法、仪器操作和计算分析，可以以无标记物的方式便利地实时监测细胞行为(即，在细胞响应于刺激源瞬间以及在细胞响应于刺激源的同时随着时间便利且方便地观察并定量细胞反应)。比色共振反射生物传感器，比如SRU Biosystems, Inc. BIND 技术(Woburn，ΜΑ) 具有从纳米规模生物学系统测量关于大量附着的表面变化的能力。应用和方法(其中比色共振反射生物传感器在之前已实施)已随仪器分辨率改进而变化。之前，附着于比色共振反射生物传感器表面的细胞数量的测量是首要目标。然而，在观看细胞的一些较差分辨率图像时，注意到对于占据的像素数、信号/像素的强度、每个像素的PWV变化等，细胞给出有差别的信号。在设法减小这些数据的变化性时，以下变得清晰变化性在于单独的细胞内， 且它们的有差别的形态响应于刺激源。为了进一步研究这些细胞活动，构造了更高分辨率版本的BIND Scanner (即，比色共振反射生物传感器系统)。该扫描器具有比之前使用的扫描器更高分辨率的透镜。这些透镜具有约2-5、2-10、2-15、2-20、2-50、2-100、2-200或 2-300微米的分辨率。另外，开发了以更好的分辨率实时分析细胞变化的方法。本发明的另一实施方案提供检测细胞迁移和趋化性的方法。特别地，细胞可以在孔内，或者在阵列形式中，生长在比色共振反射光学生物传感器的一端上。通过使用半透膜或微流体通道，含有细胞的生物传感器的端部可以任选地和放置了趋化性剂的相对端分离。然后可以使用由成像光谱仪，或者可以移动以从生物传感器的多个位置读取的光纤探针所组成的检测系统以检测细胞的位置，并继而允许计算细胞迁移速度。本发明的另一实施方案提供检测细胞生长模式的变化的方法。简单地说，细胞可以生长在比色共振反射光学生物传感器上；检测PWV ；将试验试剂施用于细胞；检测PWV ； 并比较初始PWV和后续PWV，其中初始PWV相对于后续PWV之间的差异指示细胞生长模式的变化。PWV的差异与细胞生长模式的变化有关。细胞生长模式的变化可以选自细胞形态、细胞粘着、细胞迁移、细胞增殖和细胞死亡。一种原核或真核细胞或者两种或更多种真核或原核细胞可以生长于生物传感器上。生物传感器可以包括选自微量滴定孔、微量滴定板、试管、陪替氏培养皿和微流体通道的容器的内表面。通过测量光的反射波长的移动，本发明的生物传感器也能够从样品检测并定量结合配偶体的量，所述样品和界定阵列的一个或多个不同位置结合。例如，可将一个或多个不同位置的波长移动和其它不同位置的正和负对照相比，以测定结合的特异性结合物质的量。重要地，许多这样的一个或多个不同位置可以排列于生物传感器表面上，且生物传感器可以包括容器(比如约2、6、8、24、48、96、384、1536、3456、9600或更多孔的微量滴定板)的内表面。举例来说，96个生物传感器附着于固定器且各个生物传感器包括约100个不同位置时，可以同时进行约9600个生物化学试验。检测系统检测系统可以包括生物传感器、将光导向生物传感器的光源和检测从生物传感器反射的光的检测器。在一个实施方案中，可通过使用滤光器简化读数仪器，使得仅超过确定阈值的正结果触发检测。光源可以从比色共振反射生物传感器顶面(即，固定了一种或多种特异性结合物质的表面)对其照明，或从其底面照明。通过测量本发明生物传感器的各个不同位置的共振波长移动，可以确定哪个不同位置具有和它们结合的结合配偶体。移动的程度可用于测定试样中的结合配偶体的量以及一种或多种特异性结合物质和试样的结合配偶体之间的化学亲合性。生物传感器可以照明两次。第一次测量测定生物传感器上固定了一种或多种特异性结合物质的生物传感器阵列的一个或多个不同位置的反射光谱。第二次测量在将一种或多种结合配偶体施用于生物传感器后测定反射光谱。这两次测量之间的峰波长差异是特异性地和生物传感器或生物传感器的一个或多个不同位置结合的结合配偶体的量的量度。这种照明方法可以控制生物传感器表面中的小不均勻性，这些小不均勻性可以引起在峰共振波长中具有轻微变化的区域。该方法也可控制生物传感器上固定的特异性结合物质的变化的浓度或分子量。一种用于照明生物传感器表面和用于收集反射光的检测系统是探针，它含有例如和光源连接的六条照明光学纤维，以及和光谱仪连接的单条收集光学纤维。纤维的数量不是关键的，照明或收集纤维的任何数量都是可能的。纤维排列成束，使得收集纤维位于束中心，且被六条照明纤维围绕。纤维束的端部和准直透镜连接，准直透镜将照明聚焦在生物传感器表面。在这个探针排列中，照明和收集纤维是肩并肩的。因此，当正确地调节准直透镜以将光聚焦在生物传感器表面上时，观察到六个清楚界定的圆形照明区域，和中心暗区。因为生物传感器不散射光，而是反射准直的光束，因此没有光入射到收集纤维上，且观测不到共振信号。只有使准直透镜散焦直到六个照明区域重叠进入中心区域，才有任何光反射进入收集纤维。因为只有散焦时，稍微非准直的光才可以产生信号，生物传感器不以单个入射角照明，而是以一定范围的入射角照明。入射角的范围引起共振波长的混合。因此，测量到比另外可能的共振峰更宽的共振峰。因此，希望照明和收集纤维探针在空间上分享相同的光程。可使用几种方法协同定位(co-locate)照明和收集光程。例如，在第一端和光源(它将光导向生物传感器)连接的单条照明纤维，和在第一端和检测器(它检测从生物传感器反射的光)连接的单条收集纤维，可以各自在它们的第二端连接第三纤维探针，第三纤维探针既可以充当照明器也可以充当收集器。第三纤维探针和生物传感器成法向入射角取向并支持反传播 (counter-propagating) M明并反射光/[言号另一个检测方法包括使用光束分离器，它使单条照明纤维(其和光源连接)以和收集纤维(其和检测器连接)成90度角取向。光通过照明纤维探针导入光束分离器，光束分离器将光导向生物传感器。反射光导回到光束分离器，光束分离器将光导入收集纤维探针。光束分离器使照明光和反射光在光束分离器和生物传感器之间共享共同的光程，所以不散焦也可以使用完美准直的光。角扫描本发明的检测系统基于生物传感器表面的准直白光照明和反射光束的共振峰的光学光谱学测量。生物传感器表面上的分子结合通过峰波长值的移动而指示，同时波长增大相当于分子吸收增大。如理论模拟和实验数据所示，共振峰波长强烈依赖于检测光束的入射角。由于共振峰波长的角依赖性，入射的白光需要良好准直。光束的角分散使共振峰变宽，并减小生物传感器检测灵敏度。另外，来自光谱测量的信号质量取决于光源的功率和检测器的灵敏度。 为了获得高信噪比，对于每个检测位置可能需要非常长的积分时间，因此延长生物传感器板读数的整个时间。可将可调激光源用于光栅共振的检测，但是昂贵。在本发明的一个实施方案中，这些劣势通过使用用于生物传感器照明的激光束， 和用于反射光束功率测量的光检测器而克服。可以使用扫描镜装置改变激光束的入射角，并使用光学系统维持入射激光束的准直。参见，例如，“Optical kanning(光学扫描)”(Gerald F. Marchall编，Marcel Dekker (1991)。任何类型的激光扫描均可使用。例如，可以以约2线到约1，000线每秒的速率产生扫描线的扫描装置可用于本发明。在本发明的一个实施方案中，扫描装置以约50线到约300线每秒扫描。在一个实施方案中，反射光束穿过激光扫描光学系统的一部分，并通过单个光检测器测量。激光源可以是波长为例如780nm、785nm、810nm或830nm的二极管激光器。诸如这些的激光二极管在最高150mW的功率水平下易于获得，且它们的波长相当于Si光电二极管的高灵敏度。因此检测器可以基于光电二极管生物传感器。光源提供光给扫描器装置， 它将光导入光学系统。光学系统将光导入生物传感器。光从生物传感器反射到光学系统， 然后它将光导入光信号检测器。在一个实施方案中，随着扫描镜改变它的角位置，激光束在表面上的入射角在名义上以镜角位移的两倍变化。扫描镜装置可以是线性电流计，在约2Hz 到最高约120Hz的频率下，和约10度到约20度的机械扫描角下工作。在该实例中，单次扫描可在约10毫秒内完成。也可使用共振电流计或多边形扫描器。用于角扫描的简单光学系统可以由一对透镜组成，它们之间具有共同焦点。光学系统可以设计成，为了激光准直和反射光束的收集而实现最佳性能。角分辨率取决于电流计规格和反射光采样频率。假设电流计机械分辨率为30弧秒，相应的生物传感器角扫描分辨率为60弧秒，即0. 017度。另外，假设采样速率为100千样品/秒，且在10毫秒内扫描20度。结果，量化步长(quantization step)为1000样品 20 度，艮口每样品 0. 02 度。在这个实例中，如 Peng 禾口 Morris (Experimental demonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensional gratings ( ^^T^fllttT 射中的共振异常的实验演示)，Optics Lett. ,21 :549(1996))所示，0. 2度的共振峰宽度将被10个数据点覆盖，每一个相当于检测系统的分辨率。这样的检测系统的优势包括通过激光束的优良的入射光准直、由激光二极管的高光束功率引起的高信噪比、由单元素光检测器代替光谱仪引起的低成本和由角扫描引起的共振峰高分辨率。细胞粘着和细胞响应试验
整合蛋白是和细胞外基质(ECM)相互作用的细胞表面受体并调节细胞内信号。整合蛋白对细胞支架组织、细胞运动性、细胞周期的调节、细胞和整合蛋白亲合力的调节、细胞和病毒的附着、细胞和其它细胞或ECM的附着负责。整合蛋白也对信号转导负责，转导是细胞借此在细胞内和细胞间将一种信号或刺激转化成另一种的过程。整合蛋白可以转导从 ECM到细胞的信息和从细胞到其它细胞(例如，通过其它细胞上的整合蛋白)或到ECM的信息。整合蛋白和它们的ECM配体的列表可见于Takada等人，Genome Biology 8 :215(2007), 如表1所示。表1
整合蛋白ECM配体αιβι层粘连蛋白、胶原蛋白α2βι层粘连蛋白、胶原蛋白、凝血酶敏感蛋白(thrombospondin)、E-钙粘着蛋白、肌腱蛋白(tenascin)α3βι层粘连蛋白、凝血酶敏感蛋白、uPARθ4β 凝血_感蛋白、MadCAM-1、VCAM-I,纤连蛋白、 白、ADAM、 ICAM-4α5βι纤连蛋白、骨 白、肌原纤维蛋白、凝血_感蛋白、ADAM、COMP> Llα^βι层粘连蛋白、凝血酶敏感蛋白、ADAM、Cyr61α βι层粘连蛋白α8βι肌腱蛋白、纤连蛋白、骨 白、玻连蛋白、LAP-TGF-β、肾连蛋白 (nephronectin)α9βι肌腱蛋白、VCAM-1、骨M·白、uPAR、纤溶酶(plasmin)、血管抑素 (angiostatin)、ADAM、VEGF-C、VEGF-Dαιοβι层粘连蛋白、胶原蛋白απβι胶原蛋白ανβιLAP-TGF-β,纤连蛋白、骨 白、LlOtLp2ICAM、ICAM-4αΜβ2ICAM、iC3b、因子X、纤维蛋白原、ICAM-4、肝素αΧβ2ICAM、iC3b、纤维蛋白原、ICAM-4、肝素、胶原蛋白α β2ICAM、VCAM-I、纤维蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、Cyr61、纤溶酶原aiibP3纤维蛋白原、凝血_感蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、vWF、Cyr权利要求
1.细胞对刺激源的响应的检测方法，其包括(a)(i)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述细胞加入所述生物传感器；或( )将细胞和一种或多种细胞外基质配体混合，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述带有一种或多种细胞外基质配体的细胞加入比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；(b)将所述细胞暴露于刺激源；和(d)检测所述细胞对所述刺激源的响应。
2.权利要求1的方法，其中所述刺激源是调节以下的活性的化合物G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β -抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径。
3.权利要求1的方法，其中(a)的细胞处于无血清培养基中。
4.权利要求1的方法，其中和检测方法中不包括一种或多种细胞外基质配体的方法相比，细胞对刺激源的响应的检测增大。
5.用于试验的细胞的制备方法，其包括(a)用缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液洗涤细胞；(b)从所述细胞除去所述缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液；(c)将等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂加入所述细胞；(d)用缓冲盐水溶液中和所述等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂；(e)用缓冲盐水溶液洗涤所述细胞；(f)将所述细胞加到生物传感器表面并使所述细胞附着于生物传感器的表面。
6.权利要求5的方法，其中在粘着调节剂的存在下将所述细胞加入所述生物传感器表
7.权利要求5的方法，其中所述生物传感器表面具有固定于其的一种或多种细胞外基质配体，或者，其中在将所述细胞加到生物传感器表面前，将所述细胞和一种或多种细胞外配体混合。
8.权利要求7的方法，其中检测所述细胞和所述细胞外基质配体的结合。
9.细胞对刺激源的响应的检测方法，其包括(a)用缓冲盐水溶液洗涤所述细胞；(b)(i)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述细胞加入所述生物传感器；或( )将细胞和一种或多种细胞外基质配体混合，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述带有一种或多种细胞外基质配体的细胞加入比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；(c)将所述细胞暴露于刺激源；和(d)检测所述细胞对所述刺激源的响应。
10.权利要求9的方法，其中在步骤(a)之前，进行下列步骤(i)用缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液洗涤细胞；(ii)从所述细胞除去所述缺乏钙和镁的缓冲盐水溶液；(iii)将等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂加入所述细胞；(iv)用缓冲盐水溶液中和所述等渗的乙二胺四乙酸盐螯合剂。
11.权利要求9的方法，其中在粘着调节剂的存在下将所述细胞加入所述生物传感器表面。
12.权利要求9的方法，其中所述刺激源是调节以下的活性的化合物G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β -抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径。
13.测定试验试剂是否影响细胞运动的方法，其包括(a)将一种或多种细胞外基质蛋白配体固定于微量滴定板的孔底部，其中所述孔底部包括比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器，且其中所述孔具有微流体通道，所述微流体通道可将试验试剂递送至该孔内的一个位置；(b)将具有对所述一种或多种细胞外基质蛋白配体特异性的细胞表面受体的细胞加入所述孔；(c)使用所述微流体通道将试验试剂递送至所述孔；其中所述试验试剂是疑似趋化剂；(d)检测所述细胞在所述孔中的运动，其中如果检测到所述细胞在所述孔中的运动，则所述试验试剂影响所述细胞的运动。
14.权利要求13的方法，其中所述试验试剂是调节以下的活性的化合物G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、 β-抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径。
15.测定试验化合物是否影响细胞和细胞外基质配体的特异性结合的方法，包括(a)将第一细胞加入第一比色共振反射生物传感器表面或第一基于光栅的波导生物传感器表面，其中所述生物传感器表面包括固定的细胞外基质配体，其中所述第一细胞具有对所述细胞外基质配体特异性的细胞表面受体，使所述第一细胞附着于所述第一生物传感器的表面，和对所述第一细胞测定峰波长值或信号；(b)将第二细胞加入第二比色共振反射生物传感器表面或第二基于光栅的波导生物传感器表面，其中所述第二生物传感器表面包括固定的细胞外基质配体，其中所述第二细胞具有对所述细胞外基质配体特异性的细胞表面受体，将试验化合物加入所述生物传感器表面，使所述第二细胞附着于所述生物传感器的表面，和对所述第二细胞测定峰波长值或信号；和(c)比较对所述第一细胞获得的峰波长值或信号和对所述第二细胞获得的峰波长值或信号；其中如果对所述第二细胞的峰波长值或信号基本上不同于对所述第一细胞的峰波长值或信号，则所述试验化合物影响细胞和细胞外基质配体的特异性结合。
16.权利要求15的方法，其中所述试验化合物是调节以下的活性的化合物G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、 β -抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径。
17.实时分析细胞变化的方法，其包括(a)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；(b)将细胞加入所述生物传感器，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；(c)将所述细胞暴露于刺激源；和(d)使用分辨率为约2到10微米的检测装置检测所述细胞对所述刺激源的响应。
18.权利要求17的方法，其中所述刺激源是调节以下的活性的化合物G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β -抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径。
19.权利要求17的方法，其中所述细胞变化是细胞生长模式、细胞死亡模式、细胞运动、细胞尺寸或体积或者细胞粘着中的变化。
20.检测细胞响应变化的方法，其包括(a)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；(b)在无血清培养基中将细胞加入所述生物传感器，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；(c)将所述细胞暴露于刺激源而不洗去所述无血清培养基；和(d)检测所述细胞对所述刺激源的响应。
21.权利要求20的方法，其中所述刺激源是调节以下的活性的化合物G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、磷脂酶C、受体酪氨酸激酶、细胞因子、β -抑制蛋白路径响应、细胞支架重排、后生信号或信号转导路径。
22.比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器表面，其中所述生物传感器通过将卵清蛋白或胎牛血清和两种或更多种细胞外基质配体施用于所述生物传感器的表面并将所述生物传感器的表面干燥而制备。
23.影响细胞粘着的化合物的识别方法，其包括(a)(i)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述细胞加入所述生物传感器；或( )将细胞和一种或多种细胞外基质配体混合，其中所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；和将所述带有一种或多种细胞外基质配体的细胞加入比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；(b)用试验化合物处理所述细胞；(c)检测比色共振反射光学的第一PWV或信号，并将所述第一 PWV或信号和来自未用所述试验化合物处理的对照细胞的第二 PWV或信号比较，以测定所述试验化合物是否影响所述细胞的粘着。
24.权利要求23的方法，其中所述试验化合物是调节以下的活性的化合物G蛋白-偶合的受体、离子通道、P13激酶、瞬时受体电势通道或磷脂酶C。
25.权利要求23的方法，其中在(b)后将粘着调节剂加入所述细胞，其中所述对照细胞也用所述粘着调节剂处理。
26.影响细胞粘着的经修饰的细胞外基质(ECM)配体的识别方法，包括(a)将细胞施用于比色共振反射光学生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中将经修饰的ECM配体固定于所述生物传感器的表面；(b)将粘着调节剂加入所述细胞；(c)对所述细胞检测比色共振反射光学的第一PWV或信号，并将所述第一PWV或信号和来自对照细胞的第二 PWV或信号比较，所述对照细胞加到比色共振反射光学生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，其中将未经修饰的ECM配体固定于所述生物传感器的表面，以测定所述试验化合物是否影响细胞粘着。
27.测定转染细胞是否生产重组蛋白的方法，其包括(a)将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面；(b)将细胞加到所述生物传感器的表面，所述细胞已用编码重组蛋白的核酸分子转染且具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体；(c)对所述细胞测定第一PWV或信号；(e)加入调节剂，和不表达所述重组蛋白的转染细胞相比，所述调节剂在表达所述重组蛋白的转染细胞中引起差别响应；(e)对所述细胞测定第二PWV或信号；(f)比较第一峰波长值或信号和第二峰波长值或信号；其中如果第二峰波长值或信号基本上不同于第一峰波长值或信号，则所述转染细胞表达所述重组蛋白。
全文摘要
提供了不使用检测标记物而检测细胞中变化的方法。在一个实施方案中，细胞对刺激源的响应的检测包括将一种或多种细胞外基质配体固定于比色共振反射生物传感器或基于光栅的波导生物传感器的表面，和将细胞加入所述生物传感器，所述细胞具有对所述一种或多种细胞外基质配体特异性的细胞表面受体。在将刺激源引入该生物传感器之前和之后，通过该生物传感器检测细胞中的变化。
文档编号G01N33/543GK102317781SQ200980157219
公开日2012年1月11日 申请日期2009年12月14日 优先权日2008年12月15日
发明者B·T·坎宁安, L·莱恩, R·沃纳, R·费尔南德斯 申请人:Sru生物系统公司