专利名称：一种检测透明质酸的方法
技术领域：
本发明涉及人类医学卫生，特别是一种检测人的血清、体液或组织匀浆中的透明质酸(HyaluronicAcid，简称HA)的方法。
肝病是一种常见病。尽管血清谷丙转氨酶、白蛋白、色素排泄试验等能够相对特异性地提示肝病的存在，却各有其局限性。谷丙转氨酶提示的是肝细胞的损伤;血清白蛋白可因残存肝细胞的强大合成代偿而不能反映亚临床型肝硬化;酚四溴酞钠和吲哚氰绿试验有较高的敏感性，却因操作较繁或费用昂贵而难以常规使用。因此，寻求能够灵敏地反映肝病变程度、能够随着急性肝炎→慢活肝→肝硬化这一病程演变而反映肝正常结构逐步丧失的指标仍为临床所急需。近年认为HA是在预测肝硬化上优于现有常规肝功能的指标。1988年4月，瑞典Pharmacia Diagnostics HA推出供科研用的“Pharmacia HA Test 50”试剂盒，是将标本先与碘标记结合蛋白(125I-HABP)作用，再加入HA-琼脂糖4B(HA-Sepharose 4B)，以结合剩余125I-HABP，再加入沉淀剂，离心，测125I-HABP-HA-Sepharose 4B的放射性，从标准浓度曲线计量。HABP提取法是采用经亲和层析、Sepharose 6B柱等手段，其中有二次冻干，流程至少七至八天。其125I标记物的制备较繁琐，需在HA-HABP复合物保护状况下标记，125I-HABP-HA过Sephadex-G25柱后，还需用4M GuHCl解离HA与HABP-125I，再经HA-Sepharose 4B亲和纯化有活性125I-HABP，一次获得标记品量少，且所标记的活性蛋白易受损伤，限制了批量临床应用的试剂盒生产，故难以大范围临床使用。
本发明的目的是提供一种新型的检测透明质酸(HA)的方法，可灵敏、准确、快速地对纳克/毫升(ng/ml)水平的透明质酸进行定量检测。
近年发现，肝内皮细胞是血中透明质酸摄取分解的主要场所。肝病时，血清HA因“去路”受阻而升高，其升高程度从急性肝炎→慢活肝→肝硬化逐步加剧。HA被认为在预测肝硬化上优于现有常规肝功能指标。小分子HA亦可少量地从肾小球滤过，故尿毒症时HA亦升高。
本发明提供的检测透明质酸的方法，是在未知HA量的标本中加入一定量透明质酸结合蛋白(HABP);再加入碘标记透明质酸(125I-HA)，使之与标本反应所剩的HABP结合;再用第一抗体即羊或兔抗HABP血清、第二抗体即驴抗羊或羊抗兔血清，将HABP沉淀下来，测其放射性，HABP所结合的125I-HA与标本中HA含量是呈负相关关系。用HA标准品同步对比操作作出放射性浓度标准曲线，把测得的待测标本放射性相对值在标准曲线上查出对应浓度值。
本发明的具体操作程序为1、向各塑料放免试管中加入恒量透明质酸结合蛋白(HABP)。
2、分别加入等体积HA标准品或待测标本，混匀，37摄氏度水浴1～2小时或室温过夜。
3、加入恒量碘标记透明质酸(125I-HA)，混匀，37摄氏度水浴0.5～1.0小时。
4、加入恒量第一抗体，即羊或免抗HABP血清，混匀，37摄氏度水浴0.5～1.0小时。
5、加入恒量第二抗体，即驴抗羊或羊抗免血清，混匀，37摄氏度水浴0.5小时。
6、以3500转/分离心操作15分钟，弃上清，测沉淀物(即125I-HA～HABP～抗体复合物)放射性。
7、将测定的HA标准品各浓度管(0、20、40、80、160、320、640纳克/毫升)放射性与0管(即浓度为0纳克/毫升的一管)放射性的比值B/B0，作出B/B0浓度标准曲线;再以计测的待测标本B/B0值，在标准曲线上查出相应的浓度值。
本发明有如下优点和积极效果1、本发明与瑞典PharmaciaHAKit比较，HABP的提取中省去二次冻干，亲和层析后省去过Sepharose6B柱，整个流程至多3-4天，速度快。
2、所用125I标记物制备简单，HA衍生物直接用125I标记，125I-HA过Sephadex-G25柱后即可使用，易批量生产和供临床应用，可大范围推广。
3、本发明的发明人设计的新型透明质酸检测试剂盒，其组成试剂如下(1)透明质酸(HA)标准品，其浓度分别为0、20、40、80、160、320、640纳克/毫升，共七瓶。
(2)透明质酸结合蛋白(HABP)一瓶。
(3)碘标记透明质酸(125I-HA)一瓶。
(4)羊或兔抗HABP血清(第一抗体)一瓶。
(5)驴抗羊或羊抗兔血清(第二抗体)一瓶。
本发明的试剂盒经试用和测定，其灵敏度为4～9纳克/毫升，批内变异数为4.56～6.96%，批间变异数小于10%，有效检测范围为4～640纳克/毫升，回收率为84.85～113.94%，健全性、特异性、稳定性均为良好。
4、用本发明的方法及其试剂盒对千余例肝病患者血清HA检测结果表明，肝病时血清HA升高，其程度随着急性肝炎→慢活肝→肝硬化逐步加剧。HA的检测具有以下临床意义(1)有助于慢迁肝与慢活肝的鉴别诊断。
(2)有助于亚临床型(代偿性)肝硬化的诊断。
(3)有助于估价肝病发展趋势和疗效。
5、本发明的方法与试剂盒亦为进行对人和动物的其他疾病的血清、体液(胸水、腹水、尿液、脑脊液)或组织匀浆中的HA含量的科学研究和临床诊断应用提供了必要的方法和试剂。
权利要求
1.一种检测透明质酸(HA)的方法，其中包括用标准品同步对比操作作出放射性浓度标准曲线，计测待测标本放射性相对值后在标准曲线上查出相应浓度值，其特征在于在未知量标本中加入一定量透明质酸结合蛋白(HABP)，再加入碘标记透明质酸(125I-HA)，使之与标本反应所剩的HABP结合，再用第一抗体即羊或兔抗HABP血清、第二抗体即驴抗羊或羊抗兔血清将HABP沉淀下来，测其放射性；HABP所结合的125I-HA与标本中HA含量呈负相关。
2.根据权利要求1所述的检测透明质酸的方法，其特征在于其具体操作程序为(2，1)向塑料放免试管中加入恒量透明质酸结合蛋白(HABP);(2，2)加入等体积HA标准品或待测标本，混匀，37摄氏度水浴1～2小时或室温过夜;(2，3)加入恒量碘标记透明质酸(125I-HA)，混匀，37摄氏度水浴0.5～1.0小时;(2，4)加入恒量第一抗体，即羊或兔抗HABP血清，混匀，37摄氏度水浴0.5～1.0小时;(2，5)加入恒量第二抗体，即驴抗羊或羊抗兔血清，混匀，37摄氏度水浴0.5小时;(2，6)在3500转/分离心操作15分钟，弃上清，测沉淀物放射性;(2，7)将测定的HA标准品各浓度管放射性与0管(即浓度为0纳克/毫升的一管)放射性的比值B/B0，作出B/B0浓度标准曲线，计测待测标本B/B0值，从标准曲线上查出相应的浓度值。
全文摘要
本发明提供了检测血清、体液或组织匀浆中透明质酸(HA)含量的灵敏、准确、快速的方法。它将未知量标本中加入定量透明质酸结合蛋白(HABP)，再加入碘标记透明质酸使之与标本反应所剩的HABP结合，再用第一抗体、第二抗体将HABP沉淀下来，测其放射性后定标其浓渡。血清HA的检测有助于肝病的诊断和鉴别诊断、病情判断和预后估价。本方法及其试剂盒也为HA与疾病关系的科研和临床应用提供了必要的方法和物质基础。
文档编号G01N33/576GK1047391SQ9010287
公开日1990年11月28日 申请日期1990年6月7日 优先权日1990年6月7日
发明者张鲁榕, 孔宪涛 申请人:上海长征医院