专利名称：一种从鸡蛋中同时提取阿莫西林、阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林的方法
技术领域：
本发明涉及兽药残留检测领域，具体涉及ー种鸡蛋中阿莫西林、阿莫西林酸、ニ酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林同时提取和浄化的方法。
背景技术：
在对食品残留物进行检测时，如果能同时对多种物质进行检測，那么将大大提高工作效率，但只有同时能将多种残留物同时从样本中提取出来，才可能建立起高效的检测方法。阿莫西林和氨苄西林均为白色或类白色结晶性粉末，味微苦，在水中微溶，在こ醇中几乎不溶。但是二者的钠盐或三水合物，在水中易溶，こ醇中略溶。阿莫西林酸和ニ酮哌嗪阿莫西林是阿莫西林主要的代谢物。国内外关于阿莫西林和氨苄西林的提取方法有许多报道。提取剂一般为磷酸ニ氢钾缓冲溶液、こ腈、甲醇水溶液等。但到目前为止，国内外对鸡蛋中阿莫西林、阿莫西林酸、ニ酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林同时提取和浄化的方法尚未见报道。申请号为2011101751983的中国专利申请公开了一种从鸡蛋中同时提取并衍生化阿莫西林和氨苄西林的方法，但该方法提取对象仅为两种，且步骤复杂。

发明内容
为了解决现有技术不能同时从鸡蛋中提取阿莫西林、阿莫西林酸、ニ酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林的问题，本发明提供了 ー种同时提取和净化的方法，该方法简单、方便、快速，回收率高。本发明所采用的技术方案是一种同时从鸡蛋中提取阿莫西林、阿莫西林酸、ニ酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林的方法，是将鸡蛋制成匀浆后，加入PV (青霉素V)内标溶液，カロ入こ腈振荡、混匀直接提取，离心，将上清液移出，重复提取1-2次，合井上清液，即得提取液。向提取液中加入ImLこ酸铵溶液(pH6. 7)，置漩涡混合器上混匀，再加入经超纯水饱和的ニ氯甲烷，充分振荡、混匀、离心，经过此液-液萃取步骤，药物被转移至上层水相中，将上层水相移出，重复提取1-2次，合井水相。最后用氮吹仪吹干，上机前残渣用
I.0mL2%こ腈分两次漩涡振荡溶解，转移至I. 5mL离心管中；12100 Xg离心15min，上清液经O. 22 μ m滤膜过滤，滤液供HPLC-MS/MS測定。采用本发明方法能将鸡蛋中的阿莫西林、阿莫西林酸、ニ酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林同时提取出来，且经净化、浓缩步骤得到的浓缩液可以供HPLC-MS/MS检测用。本发明比较了不同提取剂、提取剂和萃取剂不同体积比对回收率的影响，最終采用14-20mLこ腈作为提取剂，20-30mL ニ氯甲烷作为萃取剂，四种药物的提取效率都很高，均达到80. 15%以上。此外，こ腈可有效去除蛋白质，再用ニ氯甲烷萃取可有效减少内源性杂质，有利于样品净化。最終筛选出鸡蛋中阿莫西林、阿莫西林酸、ニ酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林残留的、最佳前处理方法。该方法简单、方便、快速，回收率高，平均回收率均在80. 15%以上，日内和日间RSD均分别低于8. 45%和10. 00%，符合AOAC残留测定要求。本发明与现有同时提取鸡蛋中阿莫西林和氨苄西林的方法相比，样品无需进行衍生化处理，简化了样品提取步骤，回收率提高了 3个百分点，同时提取对象还包含了阿莫西林的代谢产物(阿莫西林酸、ニ酮哌嗪阿莫西林)，提高了工作效率。
具体实施例方式本发明中所涉及的试剂的百分浓度，除特别说明外均指质量百分浓度。I.实验鸡的饲养、给药和样品采集随机选取28周龄京海黄鸡产蛋鸡25只，体重I. 78±0. 22kg，作为空白对照组，单笼饲养。试验前预饲I周，饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料(自制于江苏京海禽业集団有限公司饲料厂)，自由饮水。连续5d饲喂不含任何抗菌药物的全价饲料,于姆天17:30 18:00收集鸡蛋，鸡蛋样品保存在低温蛋库中。2本发明提取、萃取及浄化步骤⑴用匀浆机将鸡蛋制成匀浆；(2)准确称取5. 0-6. Og鸡蛋匀浆样品，放于30-50mL具塞离心管中，加入PV内标溶液(7· 5μ g · mじ1) 100μ L ；(3)加入3-5mLこ腈溶液置漩涡混合器上混匀，漩涡振荡混匀l_3min ；(4)再加入3-5mLこ腈溶液,镟润振荡混勻l_3min,超声波振荡萃取10_15min, 5500-6500 Xg 离心 10_15min ；(5)上清液转移至另ー 50mL具塞离心管中；(6)重复提取一次(一次性加入S-IOmLこ腈溶液，漩涡振荡混匀l_3min，超声波振荡萃取 10-15min，8000-10000Xg 离心 10_15min)，合井上清液；(7)加入ImLこ酸铵溶液(pH6. 7)，置漩涡混合器上混匀；(8)加入20_30mL用超纯水饱和的ニ氯甲烷溶液置漩涡混合器上混匀(使药物溶于上层水相、こ腈溶于ニ氯甲烷溶液中)；(9)漩涡振荡混匀 l_3min，5500-6500X g 离心 5-lOmin ；(10)取I. 0-1. 5mL上层水相至15_20mL有刻度具塞的玻璃离心管中；(11)在45_50°C氮吹仪吹干；冷冻保存；(12)上机前用I. 0mL2%こ腈分两次漩涡振荡溶解，转移至I. 5mL离心管中；(13) 10000-12100Xg离心10_15min，上清液经O. 22 μ m滤膜过滤，滤液供HPLC-MS/MS 測定。3回收率的测定准确称取5. Og匀浆后的空白鸡蛋匀浆液，置于50mL聚丙烯离心管中，添加不同浓度的标准工作液(对应的在空白鸡蛋样品中添加浓度均为5. O、10. 0,20. Oyg · kg—1，加入PV内标溶液(7. 5μ g · mじ1) 100 μ L，每个浓度水平设置6个平行，漩涡振荡混匀，经上述样品提取与浄化后，取20 μ L进样进行检测。液相色谱检测条件色谱柱AgilentC18, 5 μ m, 150mmX 4. 6mm i. d.;保护柱C18柱，5 μ m ;流动相こ腈-O. 1%甲酸，分离AMO、AMA、DIKETO和AMP的梯度洗脱程序见表I ;流速1. OmL · mirf1 ； 柱温25°C ;进样体积20 μし 表I分离AMO、AMA、DIKETO和AMP的梯度洗脱程序
权利要求
1.一种同时从鸡蛋中提取阿莫西林、阿莫西林酸、ニ酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林的方法，是将鸡蛋制成匀浆后，加入青霉素V内标溶液，加入こ腈振荡、混匀直接提取，离心，将上清液移出，重复提取1-2次，合井上清液，即得提取液； 向提取液中加入ImLこ酸铵溶液，pH6. 7，置漩涡混合器上混匀，再加入经超纯水饱和的ニ氯甲烷，充分振荡、混匀、离心，经过此液-液萃取步骤，药物被转移至上层水相中，将上层水相移出，重复提取1-2次，合井水相；最后用氮吹仪吹干。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤如下 ①用匀浆机将鸡蛋制成匀浆； ②准确称取5.0-6. Og鸡蛋匀浆样品，放于30-50mL具塞离心管中，加入青霉素V内标溶液,7. 5 μ g · mじ1,100 μ L ； ③加入3-5mLこ腈溶液置漩涡混合器上混匀，漩涡振荡混匀l_3min； ④再加入3-5mLこ腈溶液，镟润振荡混勻l_3min,超声波振荡萃取10_15min,.5500-6500 X g 离心 10_15min ； ⑤上清液转移至另ー50mL具塞离心管中； ⑥重复提取一次一次性加入S-IOmLこ腈溶液，漩涡振荡混匀l_3min，超声波振荡萃取 10-15min，8000-10000 Xg 离心 10_15min ;合井上清液； ⑦加入ImLこ酸铵溶液，pH6.7，置漩涡混合器上混匀； ⑧加入20-30mL用超纯水饱和的ニ氯甲烷溶液置漩涡混合器上混匀； ⑨漩涡振荡混匀l_3min，5500-6500Xg离心5-lOmin ； ⑩取I.0-1. 5mL上层水相至15-20mL有刻度具塞的玻璃离心管中； 在45-50°C氮吹仪吹干；冷冻保存。
全文摘要
本发明涉及一种鸡蛋中阿莫西林、阿莫西林酸、二酮哌嗪阿莫西林和氨苄西林同时提取和净化的方法。该方法是将鸡蛋匀浆后，加入青霉素V内标溶液，加入乙腈振荡、混匀直接提取，离心，将上清液移出，重复提取1-2次，合并上清液，即得提取液；向提取液中加入1mL乙酸铵溶液，pH6.7，置漩涡混合器上混匀，再加入经超纯水饱和的二氯甲烷，充分振荡、混匀、离心，经过此液-液萃取步骤，药物被转移至上层水相中，将上层水相移出，重复提取1-2次，合并水相；最后用氮吹仪吹干。本发明方法简单、方便、快速，回收率高，平均回收率均在80.15％以上，日内和日间RSD均分别低于8.45％和10.00％，符合AOAC残留测定要求。
文档编号G01N30/06GK102721772SQ201210234268
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者孙瑛瑛, 张小杰, 张跟喜, 戴国俊, 李爱华, 王金玉, 谢恺舟, 谢星, 贾龙飞, 赵敏, 陈学森 申请人:扬州大学