专利名称：禽流感病毒H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种禽流感病毒H5m亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质及制备方 法，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
英国药典(BP)的化学对照物质是从1963年才开始提出，由于WHO在英国建 立了国际生物标准物质中心，所以英国一直沿用国际标准物质，而其本国标准物质建立 较晚，至1970年后，欧洲药典问世，英国除引用国际标准物质外，也用欧洲药典标准物 质，少量使用本国的标准物质。即使如此，BP1968年版及其增补本再加英国药典(1968 年)收载的数量已超过260个，1980年版已超过300个，BP1993版收载了 371个。美 国药典委员会可提供约1805多种药品标准物质；欧洲药典委员会有2098种，其中生物制 品标准物质有319种。目前，我国已研制出国家一级标准物质1262种，二级标准物质1739种，涉及钢 铁、地质、石油、核材料、环境、食品以及临床检验等领域。兽用生物制品的标准物质 研究较滞后，目前只有192种，而兽用生物制品检验用标准物质几乎为零。兽用生物制品标准物质是控制和确定兽用生物制品产品质量、校准验证检验仪 器和方法是否准确的物质标准，是正确诊断传染病、准确监测免疫情况的物质基础。禽流感(Al)是我国重点防控的重大动物疫病，禽流感病毒(AIV)H5亚型属于高 致病性病毒，H5N1亚型Re-5株是针对我国当前流行的高致病性禽流感病毒而研制的。 用该毒株研制的禽流感灭活疫苗是我国目前禽流感防制中应用最广泛的首选疫苗，这个 疫苗在实际应用中取得了十分显著的免疫效果，因此近年来我国的禽流感防制非常令人 满意。目前AIVH5N1亚型的诊断、免疫监测及其疫苗免疫效果评价中应用最广泛的方法 是HI试验，这是2006年我国农业部批准通过的方法，但是目前我国尚无AIV H5亚型血 凝抑制试验用标准物质及其相关研究的报道，国外国际动物卫生组织(OIE)等参考实验 室也没有，严重影响了前后不同时期检测数据的一致性和不同实验室数据的可比性。近 年各级实验室对AIV标准物质的需求越来越多，特别是H5亚型和H9亚型相关的诊断试 剂标准物质，因此研制AIVH5亚型血凝抑制抗原标准物质尤为迫切，该标准物质是AIV H5亚型准确诊断、对AIV H5N1亚型Re_5株免疫情况监测及对其疫苗免疫效果进行正确 评价的根本保障，提高禽流感的防控水平。目前我国标准物质的研制主要参考和遵循1987年7月10日国家计量局发布实施 的《标准物质管理办法》以及一级标准物质技术规范(JJG 1006-94)，但是这个技术规范 是适用于化学成分、物理化学特性及工程技术特性一级标准物质的研制，对于生物制品 标准物质，特别是兽用生物制品标准物质研制目前尚无技术规范可循。因此兽用生物制 品标准物质研制是一项无基础的研究。

发明内容
本发明为制备一种禽流感病毒H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质，该抗 原标准物质含有灭活的禽流感病毒H5N1亚型Re-5株病毒；血凝抑制试验抗原对鸡红细 胞凝集价均劝log2;该抗原只能被禽流感病毒H5亚型Re-5株阳性血清所抑制，而对禽 流感病毒H9亚型、H7亚型阳性血清，鸡新城疫阳性血清和减蛋综合征病毒阳性血清均 呈阴性反应。主要制备方法是(1)制备禽流感病毒H5N1亚型Re-5株病毒血凝抑制试验抗 原标准物质候选物H5N1亚型Re-5株禽流感病毒毒种的制备与检验；病毒液的制备与 检验；病毒液的β-丙内酯灭活、半成品检验；冻干、成品检验、均一性检验及稳定性 检验；(2)标准物质的标定、定值。本发明技术方案的详细阐述包括禽流感病毒Η5Ν1亚型Re-5株血凝抑制试验抗原标准物质、其制备方法和 程序、其制备规程和协作标定操作规范等内容。本发明人在国家现行的AIVH5N1亚型Re-5株血凝抑制方法基础上，制定了禽 流感病毒H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质的质量标准和制备规程，研制出了禽 流感病毒H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质，并与中国兽医药品监察所、中国农 业大学等8家单位对其效价进行了协作标定。一、禽流感病毒H5m亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质的制备1.病毒毒种(1)病毒毒种的来源本发明用于制造禽流感病毒H5m亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质的病毒毒 株为重组禽流感病毒H5N1亚型Re-5株，由中国国家禽流感参考实验室(中国哈尔滨市 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所内)鉴定、保管和供应。(2)病毒毒种的特性1)HA效价按本说明书附录(简称《附录》)的方法进行鸡红细胞凝集价测定， Re-5株毒种对鸡红细胞凝集价应>91og2。2)鸡胚半数感染量将Re-5株毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10_6、 10_7、10_83个稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5个，每胚0.1ml。置37°C继续 孵育，24h前死亡的鸡胚弃去不计，24 72h内死亡的鸡胚随时取出并于2 8°C冷藏保 存。至72h，测定所有鸡胚液的红细胞凝集价(《附录》)，凝集价>41og2者判为感染， 计算EID5tl(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇〇五年版(三部).中国农业出 版社，2006，本发明简称《中国兽药典》)，每ml病毒含量应M07°EID5(1。3)基因鉴定方法和标准取Re-5株毒种200 μ 1，用QIAGEN RNA提取试剂盒 (QIAGEN公司)提取病毒RNA，用上游引物ACATAGTGAGAAGAGCTG和下游引物 TCCCACTCACTATCAGCTG，采用RT-PCR方法扩增HA裂解位点的基因片段，对扩增 的PCR产物进行序列分析。AIV Re-5株HA基因裂解位点氨基酸序列应为-RETR I -， 符合典型低致病力特征。4)对鸡胚的毒力将Re-5株毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释至10_4，用此浓度病毒液接种10枚10日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚0.1ml，置36°C孵育72h，应至少9个 鸡胚不死亡，且胚体无肉眼可见病变。5)对雏鸡的毒力将Re-5株毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释，静脉接种5 6 周龄SPF鸡10只，每只0.1ml，静脉接种致病指数为0 ；滴鼻接种3 4周龄SPF鸡10 只，每只0.1ml (含IO6EID5tl),另取条件相同的SPF鸡10只，不接种作为对照，在同条件 下分别饲养，观察14日，均应不出现死亡或明显异常反应。6)特异性用微量法进行HI试验，Re-5株毒种对禽流感病毒H5亚型抗血清应为 阳性反应，对禽流感病毒Hl H4、H6 H15亚型、鸡新城疫病毒和减蛋综合征病毒单 特异性抗血清均应为阴性反应。7)纯净性应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒)污染(按《中国兽药典》规定 方法进行检验)。8)基础种子代数2 5代。9)毒种保存在-70°C以下，保存期为60个月。2.实验动物所使用的SPF鸡及SPF鸡胚均由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。3.禽流感病毒H5N1亚型Re_5株血凝抑制抗原标准物质候选物的制备(1)抗原的制备按照常规方法，将毒种接种SPF鸡胚，收获鸡胚液制备禽流感病毒H5N1亚型 Re-5株血凝抑制抗原半成品，经β-丙内酯灭活、浓缩，进行无菌检验、效价测定后， 按每瓶Iml分装冻干。保护剂采用本课题研制的配方和配制方法(用注射用水配制蔗糖 浓度为100%的冻干保护剂，过滤除菌后，保护剂与鸡胚液按1 9比例配制)。(2)抗原检验1)物理性状抗原为白色或灰白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后 迅速溶解。2)无菌检验抽样检验，应无细菌或霉菌生长。3)效价测定按冻干时不同部位随机抽取3个样品进行HA测定，每个样品重复测 2次，凝集价应均不低于81og2。4)特异性检验采用血凝抑制试验的方法(详见《附录》)，用该抗原分别对禽 流感病毒H5亚型、H7亚型和H9亚型阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征病毒阳 性血清进行血凝抑制试验，该抗原只能被禽流感病毒H5N1亚型(Re-5株)阳性血清所抑 制，而对其它阳性血清均呈阴性反应。5)剩余水分测定按《中国兽药典》剩余水分测定法进行，应低于3%。6)真空度测定按《中国兽药典》方法进行，用高频电子火花仪进行检测，应符 合规定。4标准物质的定值(1)定值方法红细胞凝集试验96孔微量板法进行测定(2)定值单位由6 8家具有资质且事先经过比对确认其定值能力相同的试验 室，采用同一方法进行协作标定。(3)定值要求
1)应对每个被测标准样品分别做6 8次独立的测定，测定分两个单元，每个单 元做三次独立测定；两个单元之间相隔不少于3天。所获得的6个数据应按统计学方法 检验异常值，如发现有异常值，应予标明，并补做一次测定。然后报出全部结果。2)所有用于定值测量的计量器具/测量仪器需经检定或校准合格，并在有效期 内。(4)数据处理1)汇总全部原始数据，考察全部测量数据分布的正态性。2)在数据服从正态分布或近似正态分布的情况下，将每个实验室的所测数据的 平均值视为单次测量值，构成一组新的测量数据。剔除可疑值。计算出总平均值和标准偏差。3)当全部数据服从正态分布或近似正态分布情况下，也可视其为一组新的测量 数据。剔除可疑值，再计算全部原始数据的总平均值和标准偏差。5.均一性检验(1)抽样数量冻干数量在500支以上时取样25支；冻干数量在500只以下时取 样15支。(2)测量分别称量每支内容物的净重量，用统计学方法分析其均一性。6.稳定性检验抗原在-20°C、4°C、37°C条件下保存，并定期进行HA价测定，每 一时间均要进行2次重复测量，用统计学方法从统计上剔除可疑值，再计算每次的平均 值，该值与定值的偏差应不大于标准偏差。二、禽流感H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质的使用抗原系用重组禽流感病毒H5N1亚型Re-5株接种SPF鸡胚，收获感染鸡胚液， 用β-丙内酯灭活，经浓缩后，加适宜稳定剂冻干制成。主要用于(一)HA试验中，校定Η5Ν1亚型Re-5株抗原HA效价1.标准抗原的稀释取禽流感H5N1亚型Re-5株抗原冻干安瓿1支，启封后加Iml 生理盐水恢复原量；先进行10倍、20倍稀释，然后依次进行80、160、320、400、480、 560倍稀释。2.工作抗原的稀释取禽流感H9亚型工作抗原1支，启封后加生理盐水恢复原 量；先进行 10 倍、20 倍稀释，然后进行 80、160、320、400、480、560、640、720、 800…依次递增80倍进行稀释。3.红细胞凝集试验(1)取96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别取25 μ L加入到孔中，加入生理 盐水25 μ L，再加入鸡红细胞悬液25 μ L。(2)对照50 μ L生理盐水+25 μ L 1 %鸡红细胞悬液。(3)在微量振荡器振荡Imin 2min。(4)室温(24 26°C )放置30min，判定结果。将血凝板倾斜70°且静置10秒左 右开始记录，凡反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面向下呈泪珠状流淌，呈现与红细胞 对照孔一样者为完全不凝集孔(_)；反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面缓慢向下呈泪 珠状流淌者为不完全凝集孔(+)；反应孔底部有红细胞沉积但不沿倾斜面流淌者为50% 凝集孔(++)；除底部有少许红细胞外，反应孔其他部位几乎为完全凝集孔者(+++)；反应孔底部无红细胞，整个反应孔完全凝集者为完全凝集孔(#)。(5)结论当标准抗原完全凝集孔对应的最高稀释度为300士60倍，且对照孔呈 (“)时，工作抗原完全凝集孔对应的最高稀释度即为该抗原的红细胞凝集价。(二)HI试验中，校定禽流感病毒H5N1亚型(Re_5株)抗体的HI效价1.抗原的稀释取禽流感H5m亚型Re-5株抗原冻干安瓿1支，启封后加Iml 生理盐水恢复原量；先做10倍、20倍稀释。然后依次进行80、160、320、400、480、 560倍稀释。2.红细胞凝集试验(1)取96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别取25 μ L加入到孔中，加入生理 盐水25 μ L，再加入鸡红细胞悬液25 μ L。(2)对照50 μ L生理盐水+25 μ Ll %鸡红细胞悬液。(3)在微量振荡器振荡1 2min。(4)室温(24 26°C )放置30min，判定结果。将血凝板倾斜70°且静置10秒左 右开始记录，凡反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面向下呈泪珠状流淌，呈现与红细胞 对照孔一样者为完全不凝集孔(_)；反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面缓慢向下呈泪 珠状流淌者为不完全凝集孔(+)；反应孔底部有红细胞沉积但不沿倾斜面流淌者为50% 凝集孔(++)；除底部有少许红细胞外，反应孔其他部位几乎为完全凝集孔者(+++)；反 应孔底部无红细胞，整个反应孔完全凝集者为完全凝集孔(#)。(5)结论完全凝集孔对应的最高稀释度应为300士60倍。3.微量血凝抑制试验(1) 4HAU抗原的配制与验证1)抗原稀释方法将含有320个血凝单位的抗原先进行10倍稀释，再进行8倍稀释，即80倍稀 释液为4HAU血凝素。将配制的4HAU血凝素用生理盐水进行1 2、1 3、1 4、
1 5、1 6 禾口 1 7 稀释。2)取96孔V型微量血凝板，每一稀释度分别取25 μ L加入到孔中，加入生理盐 水25yL，再加入鸡红细胞悬液25 μ L。3)对照50 μ L生理盐水+25 μ L 1 %鸡红细胞悬液。4)以上试验做2个平行重复。5)在微量振荡器振荡1 2min。6)室温(24 26°C )放置30min，判定结果。7)判定标准如果配制的抗原液为4HAU，则1 4稀释度将给出100%凝集， 即反应孔底部无红细胞，整个反应孔完全凝集；如果4HAU高于4个单位，可能1 5或 1 6为100%凝集点；如果较低，则可能1 2或1 3为100%凝集。应根据测定结 果适当调整，使抗原工作液确为4HAU。(2)血清的稀释1)标准阳性血清的的稀释血清恢复原量后，依次进行10倍、20倍稀释；然后 进行80、160、240、320、400、480、560倍稀释。将稀释好的阳性血清每一稀释倍数取 0.025ml,分别加入到V型微量反应板对应孔中。
2)阴性血清的稀释在V型微量反应板中，每孔加0.025ml生理盐水；第1孔加 入恢复原量后的阴性血清0.025ml，反复抽打3 5次混勻；从第1孔吸取0.025ml血清 加入第2孔，混勻后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行对倍稀释至第6孔，从第6孔吸 取0.025ml弃去。3)被检血清的稀释血清恢复原量后，依次进行10倍、20倍稀释；然后进行80、160、240、320、 400、480、560…依次120倍递增进行稀释。将稀释好血清每一稀释倍数取0.025ml，分 别加入到V型微量反应板对应孔中。(4)充分振荡后，室温(24 26°C )下静置30min。每孔再加入鸡红细胞悬 液25yL，充分振荡。(5)室温(24 26°C )放置30min后判定结果。将血凝板倾斜70°且静置10秒左 右开始记录，凡反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面向下呈泪珠状流淌，呈现与红细胞 对照孔一样者为完全不凝集孔(_)；反应孔底部有红细胞沉积且沿倾斜面缓慢向下呈泪 珠状流淌者为不完全凝集孔(+)；反应孔底部有红细胞沉积但不沿倾斜面流淌者为50% 凝集孔(++)；除底部有少许红细胞外，反应孔其他部位几乎为完全凝集孔者(+++)；反 应孔底部无红细胞，整个反应孔完全凝集者为完全凝集孔(#)。(6)结论阳性血清HI效价为200 士 40倍；50 μ L生理盐水对照孔为(_), 25 μ L生理盐水 +25 μ L4HAU抗原孔为(#)，此时试验方可判为成立。被检血清的完全不凝集孔对应的最高稀释度即为该血清的红细胞凝集抑制价。本发明的优点本发明涉及禽流感病毒Η5Ν1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质及制备方法。 本标准物质是由禽流感病毒H5N1亚型Re-5株病毒经过病毒液的制备与检验；病毒液灭 活、半成品检验；冻干、成品检验、均一性检验及稳定性检验及标准物质的标定、定值 等一系列的工艺过程而制成。该标准物质是禽流感H5N1亚型准确诊断、禽流感H5N1亚 型Re-5株免疫监测及对其疫苗免疫效果进行正确评价的根本保障，提高禽流感的防控水 平。实施例1抗原制造及半成品检验1生产用毒种制备(1)毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10_4稀释度，尿囊 腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，密封针孔，置36°C继续孵育，不必翻蛋。接种 24h后，每12h照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出弃去不用，至72h收集所有活胚，在2 8°C中冷却。将冷却4 24h的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剔除气 室部的卵壳，揭去卵黄壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸出鸡胚液(尿 囊液和羊水)。尿囊液分别收集于一灭菌容器内。逐一进行无菌检验和HA价测定，将 检验无菌且对鸡红细胞悬液凝集效价M01og2的鸡胚液混合，定量分装，-70°C保存， 注明收获日期、毒种代次等。(2)病毒液的制备
1)接种取生产用毒种，用灭菌生理盐水作10倍系列稀释至10_4，尿囊腔内接种 11日龄SPF鸡胚，每胚0.1ml，密封针孔，置37°C继续孵育，不必翻蛋。2)孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋2次，将24h前死亡的鸡胚弃去，24h后死 亡的鸡胚随时取出，至72h，无论死亡与否，全部取出，气室向上直立，置于2 8°C冷 却8h以上。3)收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部 位卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(谨防卵黄破裂)，用灭菌小镊子亚压住鸡胚，用IOml 无菌注射器吸取胚液。在吸取胚液前应对每个鸡胚仔细检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及 有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获，每若干个鸡胚分为一组，吸取胚 液放于同一灭菌中性瓶中，每更换一中性瓶时同时更换注射器，每吸取完一枚胚应将聂 子在火焰上烧一下再用来接触下一枚胚。收获的鸡胚液放在2 8°C条件下保存。(3)病毒液的检验1)无菌检验每瓶鸡胚液分别取样，按《中国兽药典》规定的方法进行检验，无 细菌或霉菌或支原体生长也无外源病毒。2) HA价测定每瓶鸡胚液分别取样，样品对鸡红细胞凝集价不低于91og2。3)灭活将上述检验合格的胚液以灭菌多层纱布滤过，混合于一个大容器内，按 最终浓度为0.03%的量加入β-丙内酯，充分混勻，置于4°C灭活24h后取出再置于37°C 水浴终止灭活lh。灭活后将胚液置于2 8°C条件下保存。4)灭活检验取10 11日龄SPF鸡胚5个，各尿囊腔内接种灭活胚液0.1ml， 37°C孵育72h，收获鸡胚液，测定血凝性(详见《附录》)，为阴性，并盲传1代，测定 血凝性，无血凝现象，判为灭活完全。5)半成品检验鸡胚液分别取样，进行无菌检验，无细菌或霉菌生长。鸡胚液分 别取样，样品对鸡红细胞凝集价沖log2。7)抗原配制、分装及冻干保护剂的配制用注射用水配制蔗糖浓度为100%的冻干保护剂，过滤除菌后备用。抗原制备将检验合格的鸡胚液，混入同一容器内，保护剂与鸡胚液按1 9比例 配制。分装与冻干将配好的抗原液用安瓶进行分装，每瓶lml，精确度在士5%以内， 分装后迅速进行冷冻真空干燥。密封后放置-20°C保存。实施例2成品检验1.物理性状白色或灰白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。2.无菌检验抽样检验，无细菌或霉菌生长。检验结果见表1，所有冻干制品全部 呈阴性。表1无菌检验统计表
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权利要求
1.一种禽流感病毒H5N1亚型Re-5株病毒血凝抑制试验抗原标准物质，其特征在于 该抗原标准物质含有灭活的禽流感病毒H5N1亚型Re-5株病毒；血凝抑制试验抗原对鸡 红细胞凝集价均劝log2 ；该抗原只能被禽流感病毒H5亚型Re-5株阳性血清所抑制，而 对禽流感病毒H9亚型、H7亚型阳性血清，鸡新城疫阳性血清和减蛋综合征病毒阳性血 清均呈阴性反应。
2.一种禽流感病毒H5N1亚型Re-5株病毒血凝抑制试验抗原标准物质的制备方法， 其特征在于是通过利用由重组的禽流感病毒H5N1亚型Re-5株病毒经过以下步骤(1)制备禽流感病毒H5N1亚型Re-5株病毒血凝抑制试验抗原标准物质候选物H5N1亚型Re-5株禽流感病毒毒种的制备与检验；病毒液的制备与检验；病毒液的β-丙内酯灭活、半成品检验；冻干、成品检验、均一性检验及稳定性检验；(2)标准物质的标定、定值。
3.如权利要求2所述的一种禽流感病毒Η5Ν1亚型Re-5株病毒血凝抑制试验抗原标 准物质的制备方法，其特征在于制备过程中使用的冻干保护剂是用注射用水配制蔗糖浓 度为100%的冻干保护剂，过滤除菌后，保护剂与鸡胚液按1 9比例配制。
全文摘要
本发明涉及禽流感病毒H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗原标准物质及其制备方法。本标准物质是由禽流感病毒H5N1亚型Re-5株病毒经过病毒液的制备与检验；病毒液灭活、半成品检验；冻干、成品检验、均一性检验及稳定性检验及标准物质的标定、定值等一系列的工艺过程而制成。该标准物质是禽流感H5亚型准确诊断、H5N1亚型Re-5株血凝抑制抗体免疫监测及对其疫苗免疫效果进行正确评价的根本保障，提高禽流感的防控水平。
文档编号G01N33/569GK102012430SQ20101053231
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者刘景利, 孙建宏, 张从禄, 徐姗姗, 曾显营, 杨帆, 田国彬, 胡井雷, 韩正博 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所