专利名称：肿瘤预后评估试剂盒及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肿瘤预后评估试剂盒及其制备工艺。
正常组织中血管生长处于静止状态，只在受伤或循环再生的器官中出现可调控、短暂的增殖；但肿瘤组织中，血管生长不受控制，持续进行。肿瘤细胞在一定条件下能够产生一系列具有促进血管形成功能的细胞因子，如VEGF，bFGF，ANG等。在肿瘤血管生长中起着重要的作用。VEGF通过与血管内皮细胞表面受体结合介异其生物活性，通过激活纤溶酶原激活物和纤溶系统，降解基底膜成份，从而刺激内皮细胞迁移、浸入，形成管状结构。
肿瘤的发生、发展、转移必须依赖于新生血管的生成，在肿瘤血管的形成过程中，与血管形成有关的生长因子如VEGF开始表达，当肿瘤受到化疗和放疗作用后，肿瘤细胞连同肿瘤血管内皮细胞生长受到抑制或损伤，VEGF表达量下降或不表达。VEGF表达量的高低与肿瘤的体积及生长状态有关，瘤体大，生长快速的肿瘤组织VEGF表达量高；而瘤体小，生长绶慢的肿瘤组织VEGF表达量低。而瘤体相对恒定，增殖与凋亡速率相当的肿瘤组织VEGF相对恒定。肿瘤体积、生长速度受到病人病情、治疗方法、治疗效果等因素的影响，监测癌症病人这些基因的活动情况及波动变化可以预示病情的变化趋势，具有重要意义。本试剂盒为临床医师提供肿瘤病人的血管形成基因分子水平的动态观察，为肿瘤病人的治疗效果、病情发展、预后变化提供判断依据。
本发明的目的在于提供一种肿瘤预后评估ELISA试剂盒及其试剂盒中VEGF单克隆抗体和其它缓冲剂、试剂的制备工艺，能够快速简单地用于肿瘤的预后评估。
本试剂盒每盒是由以下物质组成的包被缓冲液 1 瓶阳性对照(VEGF) 1 瓶阴性对照(生理盐水) 1 瓶VEGF的单克隆抗体或多克隆抗体 1 瓶二抗标记物 1 瓶酶底物溶液 1 瓶终止液 1 瓶洗涤液 1 瓶封口胶 1 块酶标板 1 块其中，阳性对照(VEGF)、阴性对照(生理盐水)、二抗标记物、封口胶、酶标板为现有物质，包被缓冲液、VEGF的单克窿抗体或多克窿抗体、酶底物溶液、终止液、洗涤液为由本发明的工艺制备而成的。
本发明的制备工艺是通过以下步骤实现的1.单克隆抗体的制备1.1小鼠免疫BAL B/C小鼠6-8周，用50-100ug VEGF加福氏完全佐剂腹腔注射，间隔2-3周后，用同样剂量VEGF腹腔加强免疫2-3次，末次免疫后第3-4天取脾细胞融合。
1.2抗原VEGF，由陕西瑞森基因工程药物研究所提供。
1.3细胞融合，免疫小鼠脾细胞和Sp2/0细胞按10∶1的比例混合，在50％PEG(MW＝1500)的作用下，进行细胞融合，用ELISA间接法初步筛选出阳性克隆，再用中和抑制试验证实为阳性克隆后，经有限稀释法克隆2-3次，筛选出分泌抗体阳性的单个克隆，稳定传代3个月，制备腹水和液氮冻存。
1.4单克隆抗体的鉴定1.4.1杂交瘤细胞系染色体分析取对数生长期的杂交瘤细胞用秋水仙素处理，经Giemsa染色，镜检计数。
1.4.2Ig类及IgG亚类测定用美国Sigma公司的抗鼠Ig亚类抗血清与浓缩至原容积1/20的杂交瘤细胞培养上清液作琼脂双向免疫扩散。
1.4.3单克隆抗体特异性的测定将VEGF进行电转移，而后用各株单抗分别进行ELISA染色。
1.4.4单克隆抗体比活性测定将各株单抗的蛋白进行定量，然后按不同稀释度测定各株的滴度。
2.多克隆及克隆ELISA测定尿样中的VEGF2.1各种缓冲液及试剂的配制方法A.包被缓冲液0.05M PH9.6的Na2CO3-NaHCO3Na2CO3(MW 105.99) 1.59克NaHCO3(MW 84.01) 2.93克蒸馏水溶至1000mlB.洗涤液PH 7.4的PBS-Tween 20NaCl(MW 58.44)8.0克KH2PO4(MW 136.09)0.2克Na2HPO4·12 H2O(MW 358.14)2.9克(或者 NaHPO41.14克)KCl(MW 74.56) 0.2克蒸馏水溶至1000mlTween 20 0.5ml
C.酶标记物稀释液在上述洗涤液中加入羊血清，浓度为2％。
D.酶底物溶液邻苯二胺(O.P.D)-H2O2(1)磷酸—柠檬酸缓冲液PH5.0①0.2M Na2HPO4取Na2HPO4·12 H2O 71.63克用蒸馏水溶至1000ml。
②0.1M柠檬酸液取柠檬酸19.2克，用蒸馏水溶至1000ml，取①液25.7ml，②液24.3ml，再加蒸馏水50ml。
(2)O.P.D-H2O2邻苯二胺(O.P.D)10mg磷酸—柠檬酸缓冲液25ml3％H2O2(分析纯)0.4mlE.终止液2MH2SO4浓硫酸(95-98％)22.2ml蒸馏水 177.3ml(配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边摇匀。)2.2操作步骤取单克隆或多克隆抗体，正常鼠IgG(均稀释成10mg/ml)平行包被40孔板(如A排包被单克隆或多克隆抗体，B排包被正常鼠IgG)，0.1ml/孔，放入湿盒中4℃冰箱过夜，用洗涤液洗涤板3次，每次3分钟，甩干。在平行包被的孔中加入被检抗原0.1ml/孔，37℃孵育1小时，同上洗涤3次，甩干。再在各孔内加入单克隆或多克隆抗体(稀释成10mg/ml)，0.1ml/孔，37℃孵育1小时，同上洗涤3次，甩干，在各孔中加入酶标的二抗(稀释成1∶4000)，0.1
加入酶底物溶液0.1ml/孔，37℃避光孵育20分钟。在各孔内加入2M H2SO40.025ml/孔，终止反应，用酶联检测仪测定各孔的490nm的吸光度。
2.3结果判定OD比值计算
实施例一、试剂盒组成96人份48人份 20人份包被缓冲液 瓶10ml 5ml 2.5ml阳性对照(VEGF) 瓶1ml 0.5ml 0.25ml阴性对照(生理盐水) 瓶1ml 0.5ml 0.25mlVEGF的单克隆抗体或多克隆抗体瓶10ml 5ml 5ml二抗标记物 瓶10ml 5ml 5ml酶底物溶液 瓶6ml 3ml 3ml终止液 瓶6ml 3ml 3ml洗涤液 瓶25ml 12.5ml 6ml封口胶 块10块 10块1块酶标板 块96孔板48孔板 24孔板二、标本收集
1.晨尿、脱水及大量输液病人不宜采尿。
2.最好新鲜尿样，4℃可保存48小时，-20℃可保存4周。
3.尿液不能反复冻融。
三、试剂贮存1.4℃保存，有效期为4-6个月。
2.包被液必须盖紧，4℃保存，长期不用，应更换新包被液。四、检测步骤1.取出酶标板，每孔加包被液2滴(其中3孔不加，直接加阳、阴性对照液各2滴，一孔留作空白对照)。
2 加病人尿液10ul，与包被液混匀。加盖封口膜，置湿盒，4℃过夜或37℃3.5-4小时以上。
3 到时取出，吸去包被液，每孔加洗涤液200ul，洗3次，每次加洗液后静置1分钟后，甩净，拍干余液。
4 加一抗2滴，37℃湿盒60分钟。
5 同步骤3，洗3次。
6 加二抗2滴，37℃湿盒60分钟。
7 同步骤3，洗3次。
8 每孔滴加底物A和B各1滴(空白不滴)，混匀，置湿盒37℃×30分钟(或室温45分钟)避光。到时，每孔加终止液1滴，在酶标仪490mm处测OD值。五、判断结果OD比值计算
六、临床评估参考
1 待检标本OD比值≥2.1，表明血管形成肽基因表活跃。
2 待检标本OD比值在1.5-2.0之间为可疑。
3 待检标本OD比值在1.5以下，表示血管形成肽基因表达处于静止期。
权利要求
1.肿瘤预后评估ELISA试剂盒，包括阳性对照(VEGF)，生理盐水，二抗标记物，封口胶，酶标板，其特征在于，其中还包括包被缓冲液、VEGF的单克隆抗体或多克隆抗体、酶底物溶液、终止液和洗涤液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所说的包被缓冲液为0.05M、PH9.6的Na2CO3-NaHCO3，所说的酶底物溶液为邻苯二胺(O.P.D)-H2O2，所说的终止液2MH2SO4，所说的洗涤液为PH 7.4的PBS-Tween 20。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所说的VEGF的单克隆抗体采用以下方法制备(1)小鼠免疫BAL B/C小鼠6-8周，用50-100ug VEGF加福氏完全佐剂腹腔注射，间隔2-3周后，用同样剂量VEGF腹腔加强免疫2-3次，末次免疫后第3-4天取脾细胞融合；(2)细胞融合，免疫小鼠脾细胞和Sp2/0细胞按10∶1的比例混本混合，在50％PEG(MW＝1500)的作用下，进行细胞融合，用ELISA间接法初步筛选出阳性克隆，再用中和抑制试验证实为阳性克隆后，经有限稀释法克隆2-3次，筛选出分泌抗体阳性的单个克隆，稳定传代3个月，制备腹水和液氮冻存。
全文摘要
本发明提供一种肿瘤预后评估试剂盒,其中包括阳性对照(VEGF)、生理盐水、二抗标记物、封口胶、酶标板缓冲液、VEGF的单克隆抗体或多克隆抗体、酶底物溶液、终止液、洗涤液;同时,本发明还提供了VEGF的单克隆抗体和其它缓冲液、试剂的制备工艺,能够快速简单地用于肿瘤的预后评估。
文档编号G01N33/531GK1260492SQ9911590
公开日2000年7月19日 申请日期1999年11月9日 优先权日1999年11月9日
发明者赵永同, 祁淼 申请人:赵永同, 祁淼