专利名称：一种紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种光谱法测定三聚氰胺的分析方法。特别是基于三聚氰胺与脱氧核糖核酸(DNA)相互作用而建立的简单、快捷、准确的紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法。
背景技术：
三聚氰胺(Melamine,以下简称MM,分子式C6H6N6是一种用途广泛的化工原料,分子中含氮量达66.6%。一些不法企业将其添加到牛奶、奶制品、饲料中，造成粗蛋白质虚高的假相，不仅对奶制品、养殖业等产业产生不利影响，对人类健康也存在着严重威胁。虽然2008年9月发生的令人震惊的“三聚氰胺”事件在国家相关部门的高度重视下，应急处理工 作已告一段落，但有关三聚氰胺的检测技术的研究一直是近年来的热点话题。研究和建立测定食品、乳制品及组织样品中的三聚氰胺含量的高灵敏度、快速简便的方法具有十分重要的意义。目前关于三聚氰胺的测定方法有GC-MS，HPLC, LC-MS,毛细管电动色谱等，这些方法中有的需要比较复杂的样品预处理，操作繁琐，有的方法检测灵敏度比较低(通常的检测灵敏度在10.9i!g/kg、. 25mg/kg之间)，难以满足日常的快速检测。

发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种准确有效测定，并且可靠、快速、操作简单的紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为一种紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法，该方法包括以下步骤(I)配制pH值4 10的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲溶液；(2)用步骤(I)配制的Tris-HCl缓冲溶液分别配制浓度范围为(TlO y gL的三聚氰胺溶液、浓度范围为I. OX 10_5mOl/L I. 5X 10_4mOl/L的DNA溶液，以及三聚氰胺与DNA的混合溶液，摇匀，放置疒30min，以试剂空白(即步骤(I)配制的Tris-HCl缓冲溶液)为参比，在20(T500nm波长范围扫描紫外光谱，测定各溶液的吸光度(A)；(3)以三聚氰胺溶液的浓度为横坐标、以不加三聚氰胺时DNA的吸光度即DNA溶液的吸光度与三聚氰胺与DNA的混合溶液的吸光度的差值(AA)为纵坐标，建立工作曲线；(4)将三聚氰胺待测提取液加入上述步骤(2)浓度相同的DNA溶液(此处的DNA溶液具体指的是与步骤(2)中配置的DNA溶液浓度相同的溶液，确保与标准曲线建立时用的DNA浓度一致即可)中，测定体系的吸光度，根据工作曲线计算待测液中三聚氰胺的浓度，换算出待测提取液中三聚氰胺的相应含量。其中，所述DNA为鲱鱼精DNA、小牛胸腺DNA (均为市售产品)的任意一种，其纯度通过比较260nm和280nm处的吸光度来确定(A260A280 = I. 8 I. 9/1)，用pH = 7. 00的Tris (0. 05mol/L) -HCl缓冲溶液配制成DNA溶液，浓度通过测定260nm处的吸光度计算而得(e =6600L moF1 cnT1)，储备液置于 4°C保存。进一步，本发明所述DNA的使用浓度范围为1.0X10-5mol/L 1.5X10-4mol/L (此处DNA的使用浓度即是指加入缓冲液后DNA在溶液中的浓度，同理，三聚氰胺和三聚氰胺与DNA混合溶液均为配制后最终浓度);三聚氰胺的检测线性范围为0-2. Oy g/L，方法检测限为 0.056u g/kgo上述步骤(I)中三羟甲基氨基甲烷在缓冲液中的浓度优选为0. 05mol/L，配置的pH 优选=7. 00。上述步骤(2)所述三聚氰胺与DNA的混合溶液是指在步骤(I)配置的三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲溶液中加入DNA和三聚氰胺，使得配制后的混合溶液中三聚氰胺的浓度为0 10 u gL、DNA的浓度为I. OX 10_5mOl/L I. 5X 10_4mOl/L。本发明的优点和有益技术效果为本发明的三聚氰胺与脱氧核糖核酸(DNA)会发生相互作用，并使得DNA在 260nm处的特征吸收峰位置出现小的红移( 2nm)和减色效应(吸光度A减小 0. 05， 10%)，且其减色效应与三聚氰胺浓度符合朗伯-比尔定律，因此，通过紫外光谱法可以实现三聚氰胺的含量准确有效测定，并且可靠、快速、操作简单。


图I是本发明三聚氰胺与DNA之间的相互作用的紫外光谱图。如图所示(1)DNA (c (DNA) = 6. 4 X l(T5mol/L)，(2) MM-DNA (c (MM) = 6. 7 X l(T7mol/L)，(3) MM-DNA (c (MM)=3. 3X 10_6mol/L), (4) MM-DNA (c (MM) = 6. 7 X l(T6mol/L)，(5) MM-DNA (c (MM)=I. OX l(T5mol/L), (6) MM-DNA (c(MM) = I. 3 X l(T5mol/L)，(7) c (MM) = I. 00 X l(T4mol/L, (8)MM+DNA(c (MM) = I. OOX l(T5mol/L, c (DNA) = 6. 7X l(T5mol/L)理论值)。图2是本发明以三聚氰胺的浓度与吸光度的差值(AA)的建立的工作曲线。
具体实施例方式下面根据本发明的具体实施例详细说明本发明，本发明的目的和效果将更加明显。实施例I :三聚氰胺与DNA相互作用的方法建立(I)用 PH = 7. 00 的 Tris (0. 05mol/L) -HCl 缓冲溶液分别配制 MM 溶液，DNA 溶液，DNA-MM的混合溶液，摇匀，放置20min，以试剂空白为参比，扫描电子吸收光谱(即紫外光谱);(2)在Icm比色皿中，加入3. OOmL DNA溶液，通过滴定法扫描电子吸收光谱或测定吸光度，每次滴加MM IOuL,可忽略体积效应。(3)测定pH = 7.00的Tris (0. 05mol/L)-HCl缓冲溶液中加入MM前后DNA的电子光谱，见附图I。丽溶液滴加到DNA溶液中后，观察到DNA在 260nm处的特征吸收峰位置出现小的红移( 2nm)和减色效应(吸光度A减小 0. 05， 10%)，且DNA-MM体系的吸光度小于同浓度DNA与丽吸光度的理论值加和值(附图I (l)DNA，(5)MM-DNA实验结果和
(8)理论值加和结果)，说明测得的MM-DNA吸收曲线并非为丽和DNA紫外-可见光谱的简单加和，而是二者之间发生了一定的相互作用。(4)固定DNA浓度，改变丽浓度，在260nm处测定吸光度。根据双倒数公式1/(A0-A) = IAtl+ IzTKXAciXc(MM)](式中Atl和A分别为加入MM前后体系的吸光度，K为结合常数)，以1/(AQ-A) l/c(MM)作图，计算得到结合常数K= I. (^XlO5Lior1,比以经典的嵌插作用与DNA结合的溴化乙啶、道诺霉素低f 2个数量级，说明丽可能通过氢键与DNA沟槽结合方式作用。实施例2
权利要求
1.一种紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法，其特征在于该方法包括以下步骤 (1)配制PH值4 10的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液； (2)用步骤(I)配制的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液分别配制浓度范围为(TlOy gL的三聚氰胺溶液、浓度范围为I. 0X10_5mOl/L I. 5X10_4mOl/L的DNA溶液，以及三聚氰胺与DNA的混合溶液，摇匀，放置疒30min，以试剂空白即步骤(I)配制的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液为参比，在20(T500nm波长范围扫描紫外光谱，测定各溶液的吸光度； (3)以三聚氰胺溶液的浓度为横坐标、以不加三聚氰胺时DNA的吸光度即DNA溶液的吸光度与三聚氰胺与DNA的混合溶液的吸光度的差值为纵坐标，建立工作曲线； (4)将三聚氰胺待测提取液加入与上述步骤(2)配置的浓度相同的DNA溶液中，测定体系的吸光度，根据工作曲线计算待测液中三聚氰胺的浓度，换算出待测提取液中三聚氰胺的相应含量。
2.根据权利要求I所述的一种紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法，其特征在于所述的DNA为鲱鱼精DNA、小牛胸腺DNA的任意一种。
3.根据权利要求I所述的一种紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法，其特征在于步骤(I)所述的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液中三羟甲基氨基甲烷的浓度为0. 05mol/L。
4.根据权利要求I所述的一种紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法，其特征在于步骤(2)所述三聚氰胺与DNA的混合溶液中三聚氰胺的浓度为(TlOii g/L、DNA的浓度为1.0X10 5mol/L I. 5 X 10 4mol/L。
全文摘要
本发明公开一种紫外光谱法测定三聚氰胺含量的方法，步骤配制pH值4~10Tris-HCl缓冲溶液；用Tris-HCl配制0~10μg/L的三聚氰胺溶液、1.0×10-5~1.5×10-4mol/LDNA溶液，以及三聚氰胺与DNA的混合溶液，以试剂空白为参比,测定各溶液的吸光度；以三聚氰胺浓度为横坐标、以DNA的吸光度与三聚氰胺与DNA的混合溶液吸光度差值为纵坐标建立工作曲线；将三聚氰胺待测液加入DNA溶液中，测吸光度，根据工作曲线计算三聚氰胺浓度换算出待测液中三聚氰胺相应含量。该方法采用基于三聚氰胺与脱氧核糖核酸相互作用而建立紫外光谱检测技术，方法准确，简单方便，具有可重复性。
文档编号G01N21/33GK102749301SQ20121022333
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月27日 优先权日2012年6月27日
发明者徐宁逸, 林峰, 柳杨青, 沈昊宇, 郑惠敏 申请人:浙江大学宁波理工学院