专利名称：一种农药生物活性测定方法
技术领域：
本发明属农药生物测定领域，具体涉及一种以剑水蚤(Crustacea)为试验对象的农药生物活性测定方法。
背景技术：
新农药的研发过程中重要一环是新农药的生物筛选。随着研究认知的不断深入和技术手段的不断进步，供试化合物库存日趋大量化，来源多样化和供试样品的逐步微量化，供试化合物样品不仅局限于试验室人工合成的化学样品，还增加了大量组合化学样品、机器自动合成化学样品、组合生物化学样品、微生物源化合物及植物源化合物等多种来源。这些样品或者合成样品量很少，或者有效成分含量很低。然而原有的常规筛选方法每次试验至少需要10毫克左右的样品，少量样品很难完成筛选。
为降低农药筛选的样品耗量，国外有些大农药公司或采用大孔板制作固体饲料或采用大型蚤或孑孓在液体环境下筛选，目前在英国洛桑实验站使用大型蚤长年进行农药杀虫活性的早期鉴别。但试验表明大型蚤和孑孓只对部分农药活性敏感，无法筛出其他潜在的具有杀虫活性的化合物。目前世界范围内新农药开发成功率越来越低，因此对筛选的要求更高。而目前的筛选方法难免发生漏筛活性化合物的现象。

发明内容
剑水蚤(Crustacea)是一种小型的甲壳动物，属于节肢动物门甲壳纲淡水桡足类，在我国分布很广，在湖泊和池塘中都有它的存在。剑水蚤营养丰富，既是幼鱼和某些经济鱼类的天然食料，又是侵袭鱼卵或鱼苗的害虫，也是某些寄生蠕虫的中间宿主。该生物个体较小，且易于在水中生长和繁殖。
本申请的发明人在上海青浦区的野外池塘沟渠中捕获得到剑水蚤，通过分离饲养和鉴定研究发现，该生物可以作为一种非常理想的生测试材，用于新农药的生物筛选和现有农药品种的活性测定。
因此，本发明的首要目的就在于提供一种采用剑水蚤为对象的农药生物活性测定和筛选方法。
在一系列具体的实施例中，发明人以剑水蚤为对象分别对敌百虫、杀灭菊酯、吡虫啉、除尽、氟虫脲和间三氟甲基脲的杀虫活性进行了测定，结果表明，试验对象剑水蚤对上述现有农药品种或未知活性用途的化合物均具有很好的敏感性。本发明可以用来对现有农药品种进行杀虫活性的测定，而且由于测定时所用的剂量可以是微量，同时在目前实验室里合成出新化合物的质量越来越少的情况下，本发明非常适合用来进行新农药筛选。
本发明采用剑水蚤为作用对象，建立一项新型早期鉴别的筛选方法，同时该方法又可以用于现有农药品种杀虫活性的生物测定、农药抗药性研究、农药在环境中的行为研究、未知样品的生物活性筛选，以及化合物/农药对环境中水生生物的安全性检测。
农药活性测定试验可据不同的要求选择试验剂量或试验器皿；杀虫活性筛选试验一般以80％试虫死亡率为筛出标准。一次筛选试验如果使用96孔或48孔板，每个样品筛选剂量按0.1、1、10、50mg/l计，每个孔穴0.3～1ml加液量，每个处理三次重复用剑水蚤进行筛选，每个样品的耗量约为0.06～0.2毫克，然而采用常规试虫浸渍或浸液法筛选每种试虫样品耗量至少10～20毫克。因此本发明尤其适合微量样品的筛选，由于组合化学合成方法得到的新化合物往往只有几个毫克，因此本发明对于组合化学来说意义更为显著。
农药微量筛选是提高新农药开发成功率的重要一环，本发明采用剑水蚤农药生物(杀虫)活性测定方法具有以下优点该靶标对大部分农药活性敏感且易于大量饲养；可以对常规试虫有很好的指示性和代表性；与采用大型蚤或孑孓进行农药生物筛选具有很强的互补性；每个样品一次试验样品耗量小于0.1毫克，尤其适合微量样品的筛选或测定。
具体实施例方式
为了更好地说明本发明，下面通过实施例予以进一步说明。
实验材料敌百虫原药、杀灭菊酯原药、吡虫啉原药、除尽原药和氟虫脲原药均为现有农药品种，市售可得；间三氟甲基脲为未知活性(用途)的化合物样品，市售可得；不同规格的多孔板均为市售产品。
试虫来源在上海市青浦区的野外池塘沟渠中采集剑水蚤，经单个分离鉴定后，室内饲养繁殖到一定数量供测试。
试验方法小心称取供试化合物1毫克左右用100微升丙酮、二甲基甲酰胺等合适溶剂充分溶解，然后加入一滴含10％吐温-80的丙酮溶液，再加入900微升蒸馏水，即得到100mg/L的待测药液。
从剑水蚤的饲养钵中用吸管小心吸取/捞取剑水蚤成虫(雄性)到一个干净的小烧杯中，使该虫的数量达到一定密度，然后用刻度吸管小心吸取约1.5毫升含剑水蚤的培养液到多孔板的孔穴中或小烧杯等待测器皿中，使每个孔穴中或每杯中的虫数达到10～20只左右，处理前检测各个处理试虫基数。然后在每个含1.5毫升剑水蚤培养液的待测器皿中分别加入1.5毫升100mg/L的待测药液，使药剂终浓度分别达到0.1、1、10、50、100mg/L试验要求，每个处理3次重复，并设相同量溶剂和乳化剂的处理作对照，盖上盖子，于20℃左右的培养箱中培养。分别于药后24、48、72小时检查剑水蚤的死亡虫数，剑水蚤以针触不动为死亡。试验结果用死亡率来表示。死亡率的计算方法为(处理后死亡虫数/处理前试虫基数)×100％。
实施例1～6按上述试验方法，分别对敌百虫原药、杀灭菊酯原药、吡虫啉原药、除尽原药和氟虫脲原药以及间三氟甲基脲进行杀虫活性的测定，有关试验内容和条件如表1，测定的结果见表2。
表1

表2、应用剑水蚤筛选/测定不同农药或化合物的生测结果

以上试验结果表明，剑水蚤不仅可以有效地检测已知农药(实施例1～5)在不同剂量下的生物活性，同时又可以用现有的药剂检验该筛选模型的敏感性，同时还可以筛选出未知活性的新化合物(实施例6)。作为一种新型的生测和筛选方法，首先各待测化合物的检测范围可以从0.1ppm～100ppm，因此可根据试验的需要适当选择实验器皿。如果采用微量器皿样品的最低耗量只有0.05mg，尤其适合组合化学样品的筛选。其次由于剑水蚤易于获得和大量饲养且可以在水中生活，因此与常规试虫相比操作简单，同时试验结果可以在处理后24或48小时检测，因此使试验效率提高。
本发明所述的方法与现有农药生物测定方法相比，有如下优点1、用剑水蚤做该靶标对大部分农药活性敏感且易于大量饲养；2、可以对常规试虫有很好的指示性和代表性；3、与目前采用大型蚤或孑孓进行农药生物筛选的方法有很强的互补性；4、每个样品一次试验样品最小耗量小于0.1毫克，尤其适合微量样品的筛选或测定。
权利要求
1.一种农药生物活性测定方法，其特征在于，该方法以剑水蚤(Crustacea)为试验对象对样品的杀虫活性进行测定。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品是农药现有的杀虫剂品种或未知农药生物活性的化合物样品。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品的测定剂量为0.1～100mg/L。
4.一种剑水蚤(Crustacea)用于农药生物活性测定的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述农药为现有的杀虫剂品种或未知生物活性的化合物样品。
全文摘要
本发明涉及一种农药生物活性测定方法，它以剑水蚤为作用对象，在微量器皿中，通过剑水蚤对样品的敏感性进行杀虫活性检测，主要以剑水蚤的死亡率与待测样品浓度相关性进行杀虫活性测定。该方法操作简单方便，尤其适合微量样品的生物测定。可应用于农药现有品种的活性测定和新农药的筛选研究。
文档编号G01N33/00GK1904609SQ20051002837
公开日2007年1月31日 申请日期2005年7月29日 优先权日2005年7月29日
发明者张雅凤 申请人:上海南方农药研究中心, 上海市农药研究所