专利名称：多种生物活性物质同时进行荧光定量检测的方法
技术领域：
本发明涉及多种生物活性物质在化学修饰玻片上同时进行荧光定量检测的方法及其在医学诊断上的应用，可对进行高通量的检测。
背景技术：
蛋白芯片是一种高密度的抗原抗体微阵列，将大量特定的抗原或抗体有序地固定在玻璃或硅片上，大量、快速、平行地对相应的抗原或抗体进行定量、定性分析。蛋白芯片技术的成熟和应用将给本世纪的疾病诊断、新药开发、司法鉴定、农作物的优育优选、食品卫生监督、环境检测、国家安全防卫等领域带来一场革命；为人类提供高速、并行采集和分析个体生物信息强有力的技术手段，为生物信息学的研究提供重要的信息采集和处理平台。

发明内容
本发明的目的是在化学修饰玻片上同时进行荧光定量检测多种生物活性物质，将亲和素标记上荧光分子，通过与生物素标记的检测抗原或检测抗体反应，间接地增加待检测物质的标记荧光分子数量，达到增加灵敏度的目的，经荧光扫描，可对生物活性物质进行固相荧光定量检测。
检测原理抗原或抗体经特定的缓冲液稀释，按一定的循序和排列用点样仪点在氨基修饰或醛基修饰的玻片上，经37℃孵浴、PBS-小牛血清封闭，甩干，得到检测芯片。血清或血浆中的生物活性物质被捕获在芯片上，经生物素标记的生物活性物质的单克隆抗体检测和荧光分子标记亲和素的信号放大，再经激光共聚焦荧光扫描仪扫描获得相关生物活性物质的荧光检测信号(如图1)。
在同一玻片上可获得多个已知样品和未知样品的荧光检测信号，由于荧光信号的强弱与样品中含有该生物活性物质的量，有良好线性相关性。对不同浓度已知样品中各种生物活性物质的荧光强度与其相应的浓度进行线性回归，可以得到其回归线Y＝AX+B，未知样品中对应生物活性物质的荧光信号代入对应回归线可得到相应的生物活性物质的量。


图1抗原和抗体的荧光检测原理(F为荧光标记分子)图2妇科肿瘤标志物检测蛋白芯片外观及样品分布图3妇科肿瘤标志物检测蛋白芯片扫描结果A标准品 B血清标本1 C血清标本2图4妇科肿瘤标志物检测蛋白芯片数据线性回归分析结果ACA199线性回归 BCA15-3线性回归 CCEA线性回归 DCA125线性回归Eβ-HCG线性回归具体实施方式
为进一步说明多种生物活性物质在化学修饰玻片上同时进行荧光定量检测的方法及其在医学诊断上的应用及制备，参照下列实施例说明但不是以任何方式限制本发明的应用。
实施例一 玻片氨基修饰和醛基修饰本发明采用常规方法对玻片进行化学修饰，玻片分别浸入新配制的高锰酸钾洗液中过夜，用双蒸水清洗晾干。先后用2％的氨丙基硅烷氨基化溶液处理30分钟，乙醇洗涤，干燥得到氨基修饰玻片。氨基修饰的玻片经5％戊二醛溶液处理60分钟，PBS溶液清洗，晾干，制成醛基化玻片。
实施例二 妇科肿瘤标志物芯片的制备将妇科肿瘤标志物CA199、CEA、CA125、CA15-3及β-HCG的单克隆抗体固定在经化学修饰的玻片上制成蛋白芯片。具体方法如下选用以下抗体作为包被抗体选用瑞士CANAG公司的CA199单克隆抗体C192，(CAT.NO.103-1)、CA15-3单克隆抗体Ma695(CAT.NO.204-01)、CEA单克隆抗体CEA12-140-10(CAT.NO.402-01)及CA125单克隆抗体OV197(CAT.NO.212-01)，美国BIODESIGN公司的β-HCG单克隆抗体E45527，各抗体的纯度达到90％以上，免疫反应性应符合要求。
将以上抗体0.01M PBS(PH7.4)稀释至如下浓度C192为0.6mg/ml、Ma695为1.2mg/ml、CEA 12-140-10为2.0mg/ml、OV 197为1.6mg/ml、E45527为1.0mg/ml。分别加到384孔点样板中，用GENEMACHINE公司的点样仪OMGRID 100将各抗体按一定的循序和排列点在氨基修饰或醛基修饰的玻片上，经37℃孵浴3小时，PBS---小牛血清封闭12小时，甩干即得妇科肿瘤标志物芯片(如图2)。
实施例三 肿瘤标志物单克隆抗体的生物素标记及CY3-亲和素按照sigma的生物素标记试剂盒使用说明书操作，将1mg的各种肿瘤标记抗体分别标记并经Sephadex G25纯化，得到标记产物。
选用以下抗体作为标记抗体瑞士CANAG公司的CA199单克隆抗体C192(CAT.NO.103-1)、CA15-3单克隆抗体Ma552(CAT.NO.209-01)、CEA单克隆抗体CEA12-140-1(CAT.NO.401-01)及CA125单克隆抗体OV185(CAT.NO.203-01)，美国BIODESIGN公司的β-HCG单克隆抗体E20106，各抗体的纯度达到90％以上，免疫反应性应符合要求。
CY3-亲和素选用SIGMA公司的Cy3-Streptavidin Conjugate，CAT.NO.S6402实施例四 标准品及质控品的配制选用瑞士CANAG公司的CA199抗原(13900U/ml)、CA125抗原(58500U/ml)及CA15-3抗原(5125U/ml)，美国BIODESIGN公司的β-HCG(100ug/ml)，CEA(100ug/ml)。
根据所购抗原的浓度，按比例用PBS小牛血清定量稀释至所需浓度(表1)

实施例五 血清或血浆中的肿瘤标志物抗原的检测采静脉血，用离心法分离血清或血浆，轻度溶血、脂血或黄疸标本不影响实验结果，标本中含纤维蛋白，重度溶血，重度脂血或浑浊可能出现错误结果。
标本储存于2-8℃2天，如长期保存，应将标本分量后存于-20℃，避免反复冻融标本，标本解冻时应缓慢，检测前标本需达到室温。
将蛋白芯片取出，标鉴向上平放桌上，编号；分别在相应格中加入标准品和质控品(1、3、5、7、9、11)10ul及待检标本(2、4、6、8、10、12)10ul；置保湿盒中，37℃水浴60分钟；将格内液体甩掉，注满洗涤液静置10秒，甩掉，重复5次；每格加10ul生物素标记检测抗体；置保湿盒中，37℃水浴30分钟；将格内液体甩掉，注满洗涤液静置10秒，甩掉，重复5次；加CY-3-AVIDIN每格加10ulCY-3-AVIDIN；置保湿盒中，37℃水浴30分钟；将格内液体甩掉，注满洗涤液静置10秒，甩掉，重复5次，再用蒸馏水或去离子水充分洗涤2遍，甩干；芯片置室温晾干；扫描与分析用AXON GENEPIX 4000B专用生物芯片扫描仪扫描芯片，得到相应的图片(如图3)；扫描结果用Imagene等专用图像分析软件分析，得出原始数据并保存；运行“妇科肿瘤标志物蛋白芯片检测结果分析”软件(该软件可进行线性回归和未知样品中肿瘤标志物定量分析，由深圳益生堂生物企业有限公司编制)，软件将对原始荧光数据进行自动处理，得出结果如图4，样品检测结果如表2。
表2样品检测结果

权利要求
1.多种生物活性物质在不同载体上同时进行荧光定量检测的方法及其在医学诊断上的应用。
2.根据权利要求1所述的荧光检测方法可为直接标记或间接标荧光分子。
3.根据权利要求1所述的载体为玻璃片、聚苯乙烯等高分子聚合物。
4.根据权利要求1所述的荧光标记物为各种荧光分子，不仅限于Cy3、荧光素等分子。
5.根据权利要求1所述的荧光定量检测方法不仅限于蛋白芯片方面的应用，也适合其他检测靶DNA、激素等方面的应用。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述的临床疾病诊断为传染病诊断、性病诊断、癌症诊断等。
全文摘要
本发明涉及多种生物活性物质在化学修饰玻片上同时进行荧光定量检测的方法及其在医学诊断上的应用，属于生物医学工程领域。通过间接标记的方法来增加检测信号、提高检测灵敏度。该发明涉及的方法有固相荧光定量检测、多种生物活性物质的同时检测。本发明的实施在临床诊断、药物疗效评价、药物筛选及疾病相关基因分析等生物医学领域具有重要作用。
文档编号G01N33/533GK1627071SQ20031011255
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月10日 优先权日2003年12月10日
发明者曹恒杰, 张文, 耿永尧 申请人:深圳益生堂生物企业有限公司