专利名称：：胃癌的淋巴结转移的检测的制作方法胃癌的淋巴结转移的检测^e每年约有876,000新发胃癌病例(Shibuy^Mathere等人，2002)。在美国，2005年胃癌的估i愤发病例和死亡人数分别为21,860和11,550(Jemal,Murray等人，2005)。胃部恶创巾瘤是胃癌的最常见类型(90%至95%),按照发病率次序其紧随淋巴瘤、，瘤和间,形细胞瘤之后(Kumar,Cotran等人2003)。彻底的局部区域控制是挽救胃癌患者的主要治疗方法，其包括胃^t刀除术或胃次全切除术、标记淋巴结清除术、扩展淋巴结清除斜卩受转移影响的邻近组织切除例如脾切除斜Q胰腺切除术(Hartgrink和vandeVelde2005;Kitagawa^Fujii等人，2005)。在手术治疗后遭受复发的所有患者中，高达87.5%的是由局部錢顿ij余局部淋巴结转移弓胞的(Songui^Bonenkamp等人，1996)。在一项涵盖148个胃一錄连接部(GEJ)癌患者的调查研究中，人们得出的结论是局部淋巴结内微转移的存在是预后不良的关谢旨示(Heer叫Kelder等人，2005)。目前胃癌的淋巴结转移的普遍分期/诊断JtM过触诊和手术中冰冻切片检查实现的。淋巴结的冰冻切片检查可以显示74%的灵敏度(Kitagawa^Fujii等人，2005)。利用适当的基因标记物，基因表达分析和检测技术例如逆转录酶PCR(RT-PCR)或定量PCR可以提供一种可选择的用于胃癌的诊断或预后的方法。这些方法有可能提供更好的用于转移检测K^的灵敏度和精确度。先辦艮道的基因标记物包括CK19(Matsuda^Kitagawa等人，2004)、癌胚抗原(CAE)、细胞角蛋白-20(CK-20)、和MAG&3(Okada^Fujiwara等人，2001)、CK18、MUC1、hTRT(Ajisaka和Miwa，2003)。不幸的是，如同公布的数据显示的，它们中的大部分在检测的所有肿瘤组织和肿瘤细胞系内不能一^达。禾拥逆转录酶PCR不能在组织学检查确认的15%(CEA)到70%以上(MAG&3)的具有胃癌转移的淋巴结中检测到标记物(Okada^Fujiwara等人，2001)。CK-20t細作丰^ia物用于M、结肠、胃、禾,癌的血液内播散的癌细胞的逆转录酶PCR检测(Chausovsky，Luchansky等人，1999;Ch叫Chen等人，2004)。在这里，鉴定了一种标记物组合其以可轻易检测的水平在具有胃癌转移的淋巴结内一致表达，这种可检测的水平在正常的淋巴结内可与其背景表达区分开来。这种标记物组合可用于检测来自胃癌、或對,胞来源的癌，例如食道癌、胰腺癌和肠癌的M^性癌细胞。
发明内容在本发明的一方面中，组合使用一组标记物以检测来自胃癌的淋巴结转移。在具有胃癌转移的淋巴结中，这些1^HB物的表ii7jc平显著高于正常淋巴结的表达水平。标记物组合为CK19、CEA和MUC-2标记物。在本发明的另一方面中，诊断胃癌的淋巴结转移包括从患者中获取生物学样品并测定选自标记物组的基因表达水平，其中皿预定临界水平的基因表ii^平则表明胃癌转移。^m地，生物学样品为淋巴结样品。在本发明的另一方面中，标记物被组合用于检测胃癌的淋巴结转移的方法中。仍然在本发明的另一方面中，在手术中分析标记物。可以通过一种方法进行手术中分析，该方法包括如下步骤制备从胃引出的淋巴结的RNA;实施针对一个或多个标记物的定量RT—PCR方法并确定出现的标记物是否超出预定截断值。本发明包括用于实施这里提供的方法的微阵列驢因芯片，还有进摘分析的试剂盒和制品。该说明书中所描述和要求保护的发明方法、组分、制品、和试剂盒包括^HS物的组合。^H^明书中所使用的"^HS物"是指a)基因和基因表达产物，例如mRNA和相应cDNA、肽、蛋白质，±M每种物质的片段和补体，和b)组分例如探针、抗体、配体、半抗原、和标记物，其ffi31与a)的物理或化学相互作用表明基因的,或基因表达产物的存在，并且其中该基因、基因敬产物或组分对应于SEQIDNONM_002276、SEQIDNONM—002457、和SEQIDNOMl7303。如果基因包含那鹏列则其对应于SEQIDNO所指示的序列。如果基因,产品的区段(segment)或片断(fegment)包含足以区分其为该基因或基因表达产品的序列的一部分参考基因表达产品，卜体,则该区段或片段相应于该基因或基因表达产品的序列。另外如果基因^ii产物的RNA、mRNA、或cDNA与具有这种序列的组分(例如探针)杂交，贝條基因表ii^也如前述那样对应于这种序列，^在所述产物J1I太或蛋白质的情况下,其由这种mRNA编码。当基因表达产物区段(segment)或片段(fiagment)包含足以区分其为该基因序列或基因鋭产物的部分参考基因表达产物或其互丰唯时，则该基因表达产物区段(segment)或片段(fragment)也对应于这种基因序列或基因表达产物。本发明的标记物对应于编码三个已知蛋白的基因癌胚抗原(SEQIDNOM7303X粘蛋白2(SEQIDNONM—002457)、和细胞角蛋白19(SEQIDNONM—002276)。当它们各自用作癌标记物时这些基因不能使分析具有可接受的功效，尤其是对于在手术中使用。但是，以组合方式，如同实施例中显示的，这些*祝物提供了灵敏和特异性的检测以确定胃癌转移。通常还会分析对照品以确保阴性结果并非产生自分析中所产生的错误。组成性表达的基因例如PBGD(SEQIDNONM_000190)在这方面是有用的并且用于分析它们的试剂ttii包括在试剂盒组分内。雌PBGD是因为，其中，在人体中它不包含已知的假基因、它组成性表达于人体组织并且它以相对低的7K平^ii而且因此很少会引起感兴趣的目标序列扩增的抑制。样品制备一般包括操作切除的组织，im淋巴结组织。组织中转移和微转移的分布在淋巴结或其它组织中并不一致。因此，应当获TO够大的样品使得不会漏掉转移。在目前的方法中一种样品釆集方法是匀质化大组织样品，随后采用适当部分的组织匀浆以制备用于好检湖啲RNA。本发明方法中采用的样品tt^为来自从胃引出的淋巴结的淋巴结样品。接着是制备这种用于RT—PCR分析的样品的有用步骤；OTOmni匀浆器和—次性探针用于匀浆后再用Rneasy(Qiagen)试剂盒试剂纯化RNA:a)如果之前没有记录，以毫克确定样品重量。将一张新的蜡自置在天平上、校准并秤量样品。,淋巴结样品^3l30mg。b)禾i佣新的手术刀，将同一淋巴结的所有组织切碎雌^^勺4mm的块。注意在处M程中避免污染组织。c)将匀化(RLT)缓冲、鄉卩到聚丙烯匀化管中。每100mg组织雌舰2ml匀化缓冲液。d)禾佣干净的镊子，将组织转移到匀腿冲液内。e)将新的匀化Mimg在AX匀浆器上。f)完^J化旨淋巴结。g)按标准Qiagen规程中的齡RNA纯化步骤鹏组织匀浆，在鹏前将RNA存储在一65'C^M低MJt。h)去掉匀化探针。i)#(封可剩余的组织匀浆存储在一65'C^M低旨用于以后可能的利用。然后可以进行诊断分析。本发明的标记物用于提供重要的临床信息例如胃癌是否已经转移到了淋巴结、哪个标记物表示胃癌的临床阶段和患者的预后。总的来说，在本说明书中该信息被称为"诊断信息"。另外，这种诊断信息包括其舒;f提供的治疗中作为组分的用途。例如，拥有这种诊断信息的医生可以使他的治疗(例如，辅助疗法)以胃癌已经转移到了淋巴结的^r征为依据。分析本发明标记物的优选方法包括确定可以编码蛋白或肽的基因产生的mRNA量。这可以ail竞争f4^转录酶PCR(RT-PCR)、实时RT-PCR、北方吸印技术(NorthemBlot)分析或其它具有相似功能的试验来实现。也可以从mRNA(RNA)制备扩增的互补RNA(cRNA)，然后应用到DNA微阵列和其它正在开展的用于测縱吩析的检测方式。用于生产所述阵列的许多阵列构型和方法为本领域技术人员所熟知并且在如下列美国专利中得到了描述，例如5,445,934、5,532,128、5，556，752、5,242,974、5,384,261、5,405,783、5,412,087、5,424,186、5,429,807、5,436,327、5,472,672、5,527,681、5,529,756、5,545,531、5,554,501、5,561,071、5,571,639、5,593,839、5,599,695、5,624,711、5,658,734和5,700,637。最受欢迎的用于对PCR结，行定量的的检测方法是Ct(循环阈值)测定，其中Ct被定义为荧光^t皿固定临界值的循环数。根据用于确定Ct的算法的公知程序这很容易确定，该,被^A大多数PCR分析仪的软件内。一个这样的实例体现为Cepheid公司的SmartCyclerPCR仪，其为优选的分析平台。微阵列技术允许测定基因的稳态mRNA水平。这些分析的结果通常^接收自用于检测从样品制备的目标序列的探针组信号弓M^进行的测定，该探针组在微阵列的已知位置与核,列杂交。通常，该信号5M与制备的目标物的量成比例，并且因此其也与样品细胞内^ii的mRNA量成比例。许多这样的脉是可获得的并且是有用的。在美国专利6,271,002、6,218,122、6，218，114、和6,004，755中可以找到确定基因表达的,方法。可以通过比较微阵列的信号强度来进行基因表达水平的分析。通过生成测试样品内基因表达强m对照样品内的那些基因表达强度的比值矩阵来完成这种分析。例如，病变组织的基因,5M可以与产生自相同类型的良性或正常组织的基因表达强度相比。这些表达强度的比例^测试样品和对照样品之间基因表达的倍数变化。本发明还包括，方法，在，方法中利用模式识别方法进行,模式的比较。可以根据杂交的微阵列探针的测定强度的倍数变化区分上调和下调水平。优选1.5倍的差异用于作出这种区分(或者p值小于0.05)。也就是，在说某个基因在病变与正常细胞内^ii不同之前，应发现病胞比正常细胞产生至少多于约1.5倍或少于1.5倍的强度。倍数差异越大，越ttii^ffi该基因作为一种诊断或预后工具。选择用于本发明组合的基因具有能弓l起信号产生的表达水平，禾拥临床实验室仪器该信号以皿背景的量可区分于正常或未调节基因的那些信号。本发明包括用于实施这里提供的方法的微阵列或基因芯片。微阵列可以包含分离的核,列、它们的补体、或其对应于标记物的部分，在该部分的结合足以表征生物样品内胃癌或复发风险。微阵列，测定或定性至少约1.5倍的过度^足^ii,JK共统计上有显著意义p值的皿^^达，或p值小于0.05。ifci^地，微阵列包含cDNA阵列g核苷酸阵列并且可以包含一个或多个内对照试剂。相对于那些没有转移情况的淋巴结，具有胃癌转移的淋巴结中基因标记物有差别iiy:调表达。上调为一个相对性术语，意,相对于一些基线在基因的表达量中发现可检测的差异(超过用于测定其的系统内的噪音贡献)。在这种情况下，基线是没有胃癌转移的淋巴结内标记物的测定的基因表达。然后利用相同的测定方法测试淋巴结样品内感兴趣的基因相对于基线水平或上调或不变。诊断或予鹏包括疾病/状态问题的确定，例如确定复发的可能性以及治疗类型。确定錢的可能性包括该模式与已知錢禾n/或已知未錢情况相关的模式比较，或与舰用于这种区分而设定的截断值(在PCR的情况下通常为Ct)比较。在本发明的一些实施方案中，本发明的标记物组合可以与其它基于基因的标记物以及在癌症诊断、预后、或治疗监测中有用的非基因性诊断方法结合使用。例如，在一些瞎况下，将基于上述基因表达的方法的诊断能力与来自传统^i己物例如血清蛋白标记物(例如，癌抗原27.29("27.29"))的相结合是有益的。当其它方法产生模糊结果时该方法尤其有用。本发明包括通过获取患者的生物样品产生胃癌诊断患者报告的方法以及由此获取的报告；检测样品的基因表达；并且利用由此获得的结果产生报告。该报告还可以包含患者的结果ifi胡卩/或相对于患者群体的危险概率。本发明包括包含对应于^iB物的娜车列探针组或PCR引物/探针组的组合物。依据本发明的制品还包括用于揭示基因表达信息的介质鹏式化分析法。这些可包括，例如，微阵列，其中互补序列或探针被固定到基质上，感兴趣基因的指示序列结合到所述基质上产生确定它们存在的可读确定物。^#依据本发明的制品可以制成试剂诊断飾于进行杂交、扩增、以及用于检测癌症的兴趣基因表ii^平的信号生成指示。依据本发明的试剂盒包括格式化的分析。这些可包括进行该分析需要的所有或部分材料，例如试剂和说明以^il31其分析核,列、它们的互补序列、或其部分的介质。当要以另一种形式进摘分析时，试剂盒将具有那个形式特有的组分。例如，如果该形式为扩增形式例如PCR、滚环扩增方法(RCA)、连接,式反应方法(LCR)、^ES换扩增方法(SDA)、基于核,列的扩增方法(NASBA),然后试剂盒将包含适于这种技术的试齐IJ和材料。任舰，试剂盒包括样品制备试剂和/或用于从组织例如淋巴结组织提取核酸的制品(例如，管)。试剂盒还可以包括最小化样品污染风险的制品(例如，一次性手术刀和用于淋巴结切割和制备的表面)。在i^试剂盒中，单管QRT-PCRai呈必需的试剂包括例如逆转录酶、逆转录酶引物、相应的pcr引物对(用于i^Ha物和，im地，对照物)、热稳定DNA聚合酶，例如Taq聚合酶,以及魏的检测试剂,例如,没有限制地,scorpion探针、用于荧光5、核酸齢析的探针、肝标志探针、单染料弓嫩或针对双链DNA的荧光染料，例如溴化乙锭。引Wfc选为产生高浓度的量。热稳定DNA聚合酶很普通并且可从各制造商那里商购到。试剂盒内的其^&t才料可以包括合适的反应管或瓶、隔离组分例如石蜡小球，任选包括镁；用于逆转录酶的反应混，(通常为10X的)和PCR阶段，包括必需的缓冲液和试剂例如dNTP;不含核酸喊RNA酶的水；RNA柳制剂；对照核酸和/或ttM附加缓冲液、化糊、辅助因子、离子组分、蛋白和酶、聚糊等，其可以用于逆録中和/或QRT-PCR反应的PCR阶段。條地，该试剂盒包括核^JI取试齐卿材料。提供下列实施例以说明但不限制要求保护的发明。本文所弓l用的全部参考文献在此引入作为参考。实施例1该实施例基于采用实时PCR。在实时PCR中，在PCR的指数期^l呈中实时监测聚合^^;反应的产物而不是终点检测。因此，DNA和RNA的量化更加精确并且是可重现的。在旨循环过程中记录荧光,^^在扩增反应中的那个点的扩增产物量。在反应开始出现的模板越多，至哒其中首次记录的荧光信号在统计学上显著高于背景的点花费的循环l^少，这是(CO值的定义。循环临界值(Ct)的观点允许利用基于RT-PCR的荧光的精确性和可重现性定量。PCR产物的匀浆化检测,基于(a)双链DNA结合染料(例如，SYBRGreen)，(b)荧光探针(例如，TaqManprobes,MolecularBeacons),和(c)直接标记引物(例如，Amplifluor引物)进行。从诊断为胃癌的患者得至U总共24个淋巴结转移阳性的H&E和18个淋巴结转移阴性的H&E。淋巴结,为那些从胃部引出的。从^^淋巴结切取30mg的组织块。按照以下,^^淋巴结组织的30mg块U每组织块加到2ml缓冲液RLT中并利用一次性组织研磨辭工匀浆20一40秒。2.itai涡旋在4.5ml的管中将400"1组织匀浆与400u170%的乙醇混合10秒。3.对于敏样品，在多真空装置上附加一个真空阀，并且在每个阀上附加—t次性真空接头。4.将小柱子附加至慎空接头上，盖子打开。5.把700"由步骤2所得的组织匀M/乙醇混糊辦量加入到RNASpin払6.将真空阀转到打开位置并施加真空(800-1200毫巴)直至孵品被过滤(大约30秒)。7.停止真空；加700u1洗脱缓冲液1至IJ柱子。开始真空并允许溶^131柱子过滤。停止真空。8.加700"1洗脱缓冲液2至lj柱子。开始真空并允许溶^M^柱子过滤。停止真空。9.从多头抽真空装置移去每个柱子并放置在2ml收集管(与柱子一起提供)内。IO在鹏离心机中以>10,000RPM离心30秒。11.丢弃收集管。将柱子方i(A—个新的干净收集管内(1.5ml聚丙烯微离心管)。12.直接将50u1不含RNA酶的7X加到柱子的过滤膜上。13.在1tM离心机中以〉IO，OOORPM离心包含RNASpin柱的管30秒。R在继续到步骤14之前，确保收集管己经以这样的方式被^H3过即可以识别来源标本(例如患者ID&淋巴结ID)。15.丢弃柱子。离心管内会容纳大约50"1洗脱的RNA溶液。提取的RNA在CepheidSmartCyclern内进行一步RT-PCR扩增。反应包含下列组分50mMN-二甘氨,OH,pH8,2,115mM醋酸钾，8%体粉体积甘油，0.2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，150mM海藻糖，0.2%#|R/#Pi温20，0.2mMTris-ClpH8，3.5mM硫^f孟或锰(乙酸)，0.3mMdATP,0.3mMdCTP，0，3mMdGTP，0.3mMTTP，100U/mlTth,20ug/m抗体TP6-25.3，每个探针和引物0.4力.8uM。设计探针和引物序列使得最小化非特异性引物事件并且使得它们适合利用下列快速RT-PCR獻的多fiT增/检测95°C3秒，60。C3射中，然后32个循环95'C3秒、65'C6秒*和72匸3秒一总扩增时间等于1佛该例中使用的引物和探针如下MUC2:上游引物ATGAACTACGCTCCTGGCTT(SEQIDNO::'i:NM_0<)2457)下游引物AAACTCTCTGGGCACATTGTC(犯QIDNO:J_:NMJ02457)探针FAM-CGTGAAGACCTGCGGCTGTGT-BHQ1.TT(SEQIDNO:J_:NM_002457)CEA:上游引物ACCACAGTCACGACGATCACA卿IDNO:丄M17303)下游引物CGGGGTTGGAGTTGTTGCT(SEQIDNO:」!:Ml7303)探针:TexasRed.CTATGCAGAGCCACCCAAACCCTT-BHQ2-TT(SEQIDNO::M17303)CK19:上游引物CACCCTTCAGGGTCTTGAGATT(SEQIDNO:UJ下游引物TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC(SEQIDNO::U)探针5'Quasar570d(ACAGCTGAGCATGAAAGCTGCCIT)'BHQ-2-TT)3'(SEQIDNO:11)PBGD:引物1CTGCTTCGCTGCATCGCTGAAA(SEQIDNO:J4J引物2CAGACTCCTCCAGTCAGGTACA(SEQIDNO:H)探针-FAM-CCTGAGGCACCTGGAAGGAGGCTGCAGTGT.TAMRA(SEQIDNO:HJ样品和i微结果总结在表l中。所得Ct,于确定M^有测，品基因的相对駄。用于标记物粒的Ct錢27并且内对照(pbgd)粒的a35o具有3个标记物中的樹可一个Ct为27或更低的样品将被认为是转移阳性，但是具有3个标记物中的任何一个为27以上Ct值的样品将被视为是转移阴性。由于为了使阴性诊断结果有效内对照的Ct值需低于35。基于这些截断值，i^ffl于正确评估了18个阴性淋巴结中的17个(特异性94.4%)以及所有24个阳性淋巴结(灵敏变100%)。表l.具有胃腺癌的患者的淋巴结转移检测<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>权利要求1.一种诊断胃癌的淋巴结转移的方法，包括以下步骤a)从患者获得生物学样品，和b)检测样品中的标记物水平；其中高于预定截断水平的水平表明胃癌的淋巴结转移。2、根据权利要求1的方法，其中标记物是基因、基因片段、或其补体。3、根据权利要求1的方法，其中标记物是蛋白质、蛋白质片段、或多肽。4、权利要求1的方法，进一步包括糊另一种诊断方法。5、权利要求4的方法，其中另一诊断方鄉!^行血清分析。6、权利要求1的方法，进一步包括,性表iiS因的测定。7、权利要求l的方法，具有至少80%的鹏性。8、权利要求l的方法，具有至少70%的特异性。9、权利要求1的方法，其中样品包括淋巴结组织。10、一种确定或调,于胃癌患者的治疗方法的方法，包括以下步骤-a、从胃癌患者获得生物学样品，和b、测定样品中的标记物水平；其中髙于或低于截断水平的水平与疾病，或身皿况相一致，据此确定或调整治疗方法。11、根据权利要求10的方法，其中I^B物是基因、基因片段、鄉补体。12、根据权利要求10的方法，其中^iB物是蛋白质、蛋白质片段、或多肽。13、权利要求10的方法，进一步包括^t性^iiS因的测定。14、权利要求10的方法，其中特异'胆少是70%。15、权利要求10的方法，其中敏感，少约为80%。16、釆用微阵列实施的权利要求1的方法。17、釆用微阵列实施的权利要求10的方法。18、使用扩增方法实施的权利要求1的方法。19、根据权利要求18的方法，其中扩增方法是PCR。20、根据权利要求19的方法，其中PCR是RT-PCR。21、使用扩增方法实施的权利要求10的方法。22、一种用以实施化验以确定生物学样品中的胃癌诊断的试剂盒，包括用来检测标记物的材料。23、权利要求22的试剂盒，包括微阵列和试剂。24、权利要求22的试剂盒，包括PCR试剂。25、权利要求22的试剂盒，包括说明书。26、权利要求22的试剂盒，其中t疏物由CEA、MUC2和CK一19组成。27、一种诊断胃癌的淋巴结转移的方法，包括以下步骤a)从患者获得生物学样品，和b)测定样品中的标记物水平；其中高于预定截断水平的7K平表明胃癌的淋巴结转移，并且其中标记物由CEA、MUC2、禾卩CK-19舰。28、权利要求27的方法，进一步包括，另一种诊断方法。29、权利要求27的方法，其中另一诊断方魏括进行血淸分析。30、权利要求27的方法，进一步包括,性^iiS因的测定。31、权利要求27的方法，具有至少80%的,性。32、权利要求27的方法，具有至少70%的特异性。全文摘要本发明涉及一种诊断胃癌的淋巴结转移的方法、组分和制品，其对阴性淋巴结和具有胃癌转移的淋巴结进行区分，检测组织样品以确定胃癌阶段性状态。文档编号G01N33/68GK101236193SQ20071012828公开日2008年8月6日申请日期2007年6月5日优先权日2006年6月5日发明者G·格林,J·琼斯,M·徐,S·W·曹申请人:维里德克斯有限责任公司