专利名称：测定婴幼儿食品和乳品中维生素ade的含量的方法
技术领域：
本发明属于一种测定婴幼儿食品和乳品中维生素ADE的含量的方法。
背景技术：
维生素A(retinoL)、维生素 D(VitaminD2 和 VitaminD3)和维生素 Ε( α -Ε、y -E 和 δ-Ε)是机体维持正常代谢和机能必需的脂溶性维生素[1]。维生素A又称为视黄醇，具有促进机体生长、维持表皮完整、生殖、骨骼及视觉等功能；维生素D主要包括维生素込(麦角钙化醇)和D3 (胆钙化醇)，它们对哺乳动物有促进钙磷代谢及成骨作用；维生素E又称为生育酚，主要包括α-Ε、γ-E和δ-Ε，其中以α-生育酚的生物效应最高，具有促进生育、 抗衰老的作用。由于这6种维生素在食品工业的生产加工过程广泛运用，而在外界环境中不稳定，很容易受光、氧等影响而被氧化破坏生产、运输、贮存中易对这6种维生素造成破坏，影响因素较多，因此维生素A、D和E的同时测定十分重要，但目前的检验技术仍存在众多难点，科研工作者一直在努力寻找合适的测定方法来得到准确、重现性好的结果。目前报道的反相HPLC测定法[2-4]样品经提取后，涉及到多次蒸发、溶解等步骤，前处理较麻烦、 费时，易造成待测成份的破坏，导致测定结果偏低，而且只能同时测维生素A和Ε，不能用来同时测6种脂溶性维生素，对样品种类也有限制。现行的食品国家标准GB 5413. 9-2010 婴幼儿食品和乳制品中维生素A、D、E的测定，采用硅胶柱净化待测液，回收馏分的方法测定维生素D。国家卫生标准方法不能对这6种维生素进行同时测定，且测定时间长、方法繁琐，可能导致样品中脂溶性维生素损失而使回收率下降。不仅在检测时间和人力方面的大量消耗，也为实验结果的稳定性增添了诸多影响因素，不利于检验结果的系统分析，同时也是对有限资源的一种浪费。

发明内容
本发明的目的是提供一种测定婴幼儿食品和乳品中维生素ADE含量的方法。本发明的目的是这样实现的，其具体步骤为
1)准确称取婴幼儿食品或乳品样品，置于棕色碘量瓶中，加入焦性没食子酸乙醇溶液， 震摇，使各组分混合均勻后，加入KOH水溶液，所述KOH水溶液中的KOH与水体积比为1 2，摇勻，放置在70-100°C水浴锅中回流皂化完全后，迅速冷却后将样品置于棕色分液漏斗中，接着用石油醚与乙醚体积比为2 1的醚溶液荡洗碘量瓶，洗液移入棕色分液漏斗，振摇、静置至完全分层，分有机层和水层，水层置于盛有石油醚与乙醚体积比为2 1的醚溶液的另一棕色分液漏斗中再次萃取，有有机层和水层，合并上述两次有机层；用去离子水反复清洗有机层，直至不显碱性，有机层提取液经无水硫酸钠除水、过滤，置于圆底烧瓶中， 35-50°C水浴下氮气吹至近干后用甲醇溶解并转移至刻度试管中，用氮吹仪吹至lmL，再用甲醇定容2mL，经过微孔滤膜过滤，上色谱柱分离；2)采用体积比为8 92的10%乙腈甲醇流动相分离；流速为0. 3 mL/min ；3) ^6nm、264nm、325nm三波长同时检测维生素A、维生素D和维生素E，维生素A、维生素D和维生素E的检测质量浓度分别在1. 0-100. 0 μ g/L、
31. 0-100. 0μ g/L、0. 50-50. O mg/L 之间。所述色谱柱ACQUITYUPLC BEH ShieLd RP18 2. ImmX 150mm 1.7 μπι ； 液相系统沃特世ACQUITY UPLC配ACQUITY TUV紫外检测器；
柱温:35°C ； 流动相A 10%乙腈； 流动相B:甲醇；
检测波长325 nm、265 nm>290 nm ； 分析时间8 min ； 进样量3 uL； 采用梯度洗脱。本发明的检测方法的主要技术特点
本发明采用反相高效液相色谱法同时测定食品中维生素A(retin0l)、维生素 D (Vitamin D2和Vitamin D3)和维生素E ( α-Ε、γ-E和δ-Ε)的方法，样品处理简单，方法简便易行。并用建立的方法对奶粉及乳制品中维生素A、D和E进行了测定，在保证原有检出限的基础上大大节省实验时间及耗材，最重要的是能确保较高的数据重现性，并能同时进行Y-E和δ-E的定量检测，从而提供更为准确、可靠性高的检验结果。为生产实践中的广泛运用，提供进行生产工艺分析和大批量检验的可能。
本发明优点为本发明采用C18色谱柱，流动相为10%乙腈和甲醇，流速为0. 3 mL/min, 296 nm、264 nm、325 nm三波长同时检测，实现在1根Cw柱上同时分离奶粉及乳制品中维生素A、D2、D3、α-Ε、γ-E和δ-E六种脂溶性维生素；维生素Α、维生素D和维生素E的质量浓度分别在1. 0-100. 0 μ g/L、l. 0-100. 0 μ g/L、0. 50-50. 0 mg/L范围内与峰面积呈良好的线性关系，检测限分别为0.8 ng.1.5 ng、90.7 ng，平均回收率分别为99. 1 %、96. 3%、 97. 1%。


图1五种维生素标准色谱图，柱温35°C ；流动相A 10%乙腈；流动相B 甲醇；检测波长:325 nm、265 nm、290 nm ；分析时间8 min ；进样量3 μ L。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细说明 1. 1材料与方法
1. 1主要仪器和试剂
维生素A、D2、D3、α-Ε、Υ-Ε、和δ-E标准品(含量> 99%)，来自美国Sigma公司；乙腈、 甲醇为色谱纯，石油醚和乙醚为分析纯，其他试剂除注明外均为分析纯。实验用水为18.2 M Ω · cm超纯水。Waters超高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器；色谱柱反向C18柱，2. 1X150 mm, 1.7 μπι ；Milli-Q超纯水系统(美国密理博公司)。1.2标准溶液的配制
分别准确称取0. 025 g维生素A、D2, D3> α -Ε、γ -E和δ -E于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇勻，配成1 mg/mL维生素标准贮备液，放置于-4°C的冰箱中备用。工作液 测定前用甲醇稀释维生素A、D2、D3、α-Ε、γ-E和31储备液，使浓度分别为25、0.5、0.5、 250,250,250 μ g/mL。应用液测定时先用紫外分光光度法标定其准确浓度，用脱醛乙醇将工作液稀释成一定浓度的混合标准系列溶液。1.3色谱条件
液相系统沃特世ACQUITY UPLC配ACQUITY TUV紫外检测器色谱柱ACQUITY UPLC BEH shieLd RP18 2. ImmX 150mm 1. 7 um 柱温:35°C 流动相A :10%乙腈流动相B:甲醇
检测波长325nm、265nm、290nm 分析时间8min 进样量3 UL0表1梯度洗脱表
权利要求
1.一种测定婴幼儿食品和乳品中维生素ADE的含量的方法，1)准确称取婴幼儿食品或乳品样品，置于棕色碘量瓶中，加入焦性没食子酸乙醇溶液，震摇，使各组分混合均勻后， 加入KOH水溶液，所述KOH水溶液中的KOH与水体积比为1 :2，摇勻，放置在70-100°C水浴锅中回流皂化完全后，迅速冷却后将样品置于棕色分液漏斗中，接着用石油醚与乙醚体积比为2 1的醚溶液荡洗碘量瓶，洗液移入棕色分液漏斗，振摇、静置至完全分层，分有机层和水层，水层置于盛有石油醚与乙醚体积比为2 1的醚溶液的另一棕色分液漏斗中再次萃取，有有机层和水层，合并上述两次有机层；用去离子水反复清洗有机层，直至不显碱性，有机层提取液经无水硫酸钠除水、过滤，置于圆底烧瓶中，35-50°C水浴下氮气吹至近干后用甲醇溶解并转移至刻度试管中，用氮吹仪吹至lmL，再用甲醇定容2mL，经过微孔滤膜过滤， 上色谱柱分离；2)采用体积比为8 92的10%乙腈甲醇流动相分离；流速为0. 3 mL/min ； 3) 296nm,264nm,325nm三波长同时检测维生素A、维生素D和维生素E，维生素A、维生素D 和维生素E的检测质量浓度分别在1. 0-100. 0 μ g/L、1. 0-100. 0 μ g/L、0. 50-50. 0 mg/L之间。
2.根据权利要求1所述的婴幼儿食品和乳品中维生素ADE的含量的方法，其特征在于所述色谱柱:ACQUITY UPLC BEH shieLd RP18 2. ImmX 150mm 1.7 μπι ；液相系统沃特世ACQUITY UPLC配ACQUITY TUV紫外检测器；柱温:35°C ；流动相A 10%乙腈；流动相B:甲醇；检测波长:325nm>265nm>290nm ；分析时间:8min ；进样量3 uL；采用梯度洗脱。
全文摘要
本发明公开一种测定婴幼儿食品和乳品中维生素ADE的含量的方法，包括如下步骤准确称取样品，加入焦性没食子酸乙醇溶液，加入KOH水溶液皂化完全后，迅速冷却后将样品置于棕色分液漏斗中，接着用石油醚与乙醚体积比为21的醚溶液荡洗碘量瓶，洗液移入棕色分液漏斗，振摇、静置至完全分层，水层再用装有醚溶液的另一棕色分液漏斗中再次萃取，合并有机层；用去离子水反复清洗有机层，直至不显碱性，有机层除水、过滤，氮气吹至近干后用甲醇溶解，用氮吹仪吹至1mL，再用甲醇定容2mL，经滤膜过滤，上色谱柱分离；采用10%乙腈∶甲醇流动相分离；流速为0.3mL/min；296nm、264nm、325nm三波长同时检测维生素A、维生素D和维生素E，检测质量浓度分别在1.0-100.0μg/L、1.0-100.0μg/L、0.50-50.0mg/L之间。
文档编号G01N30/88GK102435700SQ201110284680
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者林玉宙, 陈光耀 申请人:明一(福建)婴幼儿营养品有限公司